3D-визуализация сосудистых перицитов сетчатки у мышей методом иммуноокрашивания

Резюме

Перициты в сосудистой сети сетчатки исследовали методом иммунофлуоресцентного окрашивания рецептором тромбоцитарного фактора роста β после ретроорбитального введения флуоресцентного лектина томата. Меченая сетчатка была дополнительно обработана методом очищения тканей и полностью смонтирована для визуализации трехмерных изображений перицитов, окружающих сосудистую сеть сетчатки, под конфокальным микроскопом.

Аннотация

Перициты сетчатки имеют важное значение для развития сосудов и стабильности сетчатки, играя ключевую роль в поддержании целостности сосудистой сети сетчатки. Чтобы получить подробное представление о морфологических характеристиках перицитов, в этом исследовании описан новый подход, сочетающий ретроорбитальную инъекцию флуоресцентного агента, иммунофлуоресцентное окрашивание и лечение очищением тканей. Во-первых, флуоресцентный лектин томата вводили в ретроорбитальный синус живой мыши для обозначения сосудистой сети сетчатки. Через 5 минут мышь приносили в жертву, а ее неповрежденную сетчатку осторожно извлекали из чашечки сетчатки и иммунофлуоресцентно окрашивали рецептором тромбоцитарного фактора роста β для выявления перицитов. Кроме того, окрашенную сетчатку обрабатывали реагентом для очистки тканей и целиком устанавливали на предметное стекло микроскопа. Благодаря этим подходам в прозрачной сетчатке были четко замечены сосуды сетчатки и перициты. Под конфокальным микроскопом мы получили больше возможностей для получения изображений с высоким разрешением для дальнейшей реконструкции и анализа морфологических характеристик перицитов вдоль сосудистого дерева сетчатки в трехмерном виде. С методологической точки зрения этот протокол предлагает эффективный подход к визуализации перицитов в сосудистой сети сетчатки, предоставляя ценную информацию об их роли как в физиологических, так и в патологических условиях.

Введение

Перициты сетчатки встроены в базальную мембрану вдоль абуминальной стороны эндотелиальных клеток сосудов, демонстрируя сетчатый рисунок краткосрочных процессов, обернутых вокруг кровеносных сосудов сетчатки¹. Этот тесный контакт между перицитами и сосудистой сетью сетчатки способствует поддержанию гомеостаза сетчатки окружающей^среды2. Несмотря на то, что многочисленные исследования предоставили морфологические доказательства наличия перицитов в сосудистой сети сетчатки, большая часть нашего понимания морфологических характеристик перицитов сетчатки основана на традиционных гистологических^{методах}.

В соответствии с этими исследованиями, мы разработали это исследование, чтобы эффективно продемонстрировать больше морфологических деталей перицитов в микроциркуляторном русле сетчатки, сочетая традиционные гистологические методы с современными передовыми научными методами. Подход здесь объединяет три ключевых метода: ретроорбитальную инъекцию флуоресцентного лектина томата живым мышам, иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью рецептора тромбоцитарного фактора роста β (PDGFR-β) и стратегию очищения тканей на основе растворителя. Ретроорбитальная инъекция флуоресцентного лектина томата доказала свою эффективность и надежность для наблюдения за сосудистой сетью сетчатки мыши как in vivo, так и in vitro ^4,5. PDGFR-β служит широко используемым биомаркером для иммунофлуоресцентного окрашивания перицитов⁶. Для получения изображений перицитов с высоким разрешением в более толстой и цельной сетчатке стратегия очистки тканей повышает гистологическую прозрачность ^2,7,8.

Несмотря на то, что каждый из этих методов применялся индивидуально в исследованиях сетчатки, их совокупная совместимость для исследования перицитов в сосудистой сети сетчатки мыши остается неопределенной. Поскольку средняя толщина сетчатки мыши составляет примерно 180-220^мкм9, мечение антителами и конфокальная визуализация в этой толстой ткани без очистки часто приводят к высоким фоновым сигналам, что затрудняет наблюдение за пространственными отношениями между перицитами и кровеносными сосудами¹⁰. С помощью описанных здесь подходов мы стремимся предоставить простой метод визуализации перицитов в сосудистой сети сетчатки в трехмерном (3D) виде под конфокальным микроскопом. Эта расширенная клеточная информация из перицитов в сосудистой сети сетчатки может улучшить наше понимание гомеостаза окружающей среды сетчатки и подчеркнуть потенциальные стратегии защиты сосудов, тем самым улучшая функциональные результаты при сосудистых заболеваниях сетчатки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Для этого исследования были использованы три молодых взрослых самца мышей C57BL/6 (8-10 недель, масса тела 20-25 г). Они были размещены в 12-часовом цикле свет/темнота с контролируемой температурой и влажностью и имели свободный доступ к пище и воде. Это исследование было одобрено Комитетом по этике Института акупунктуры и прижигания Китайской академии медицинских наук Китая (одобрение No 2023-03-14-04) и проведено в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных (National Academy Press, Вашингтон, округ Колумбия, 1996).

1. Ретроорбитальная инъекция in vivo флуоресцентного лектина томата

1. Введите 50 мг/кг пентобарбитала внутрибрюшинно, чтобы обезболить мышь. Оцените глубину анестезии, оценив отсутствие реакции на стимул пощипывания пальца ноги.
2. Поместите мышь в правое боковое лежачее положение головой влево.
3. Осторожно надавите двумя пальцами на периорбитальную область, чтобы обнажить левый глаз мыши^{, чтобы} можно было легче ввести инъекцию в левый ретроорбитальный синус животного.
4. С помощью шприца объемом 1 мл с иглой 27G аккуратно проколите примерно на 2-3 мм орбитальный венозный синус мыши так, чтобы скос на игле был направлен вперед под углом 45°.
5. Введите 0,1 мл (1 мг/мл) флуоресцентного лектина томата в орбитальный венозный синус мыши.

2. Перфузия и энуклеация глаз

1. Через 5 мин после ретроорбитального введения введите раствор трибромэтанола (250 мг/кг) внутрибрюшинно для глубокой анестезии мыши. Впоследствии усыпьте животное с помощью обескровливания и сердечной перфузии. Как только дыхание остановится, вскройте грудную полость хирургическими ножницами¹².
2. Как только дыхание остановится, откройте грудную полость хирургическими ножницами. Заранее простерилизуйте хирургические инструменты и работайте в вытяжном шкафу. С помощью иглы 24G введите ее на 2 мм в левый желудочек сердца через верхушку левого желудочка. Проводят перфузию со скоростью 3 мл/мин с 20 мл 0,9% физиологического раствора с последующим добавлением 20 мл 4% формальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (PB, pH 7,4).
3. Положите принесенную в жертву мышь на бок и снимите ножницами кожу, закрывающую глаза. Энуклеируйте глаза с помощью ножниц и щипцов.
4. Разрежьте зрительный нерв и окружающие ткани, затем приподнимите глаз и переложите на 12-луночную пластину для последующей фиксации в 4% формальдегиде в 0,1 М PB в течение 2 ч.
5. Криозащитите ткань в 25% сахарозе в 0,1 М PB (pH 7,4) при 4 °C до тех пор, пока она не опустится на дно раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку глазная ткань хорошо обезвоживается в растворе сахарозы, сетчатка может быть более легко и полностью отделена, что облегчает последующие всесторонние исследования.

3. Рассечение сетчатки глаза

1. Перенесите глаза в чашку Петри, содержащую 0,1 М PB (pH 7,4), с помощью пластиковой пастеровской пипетки.
2. Проткните край роговицы острыми ножницами, разрежьте вокруг роговицы и радужной оболочки и выбросьте.
3. Используйте щипцы для снятия хрусталика и стекловидного тела. Затем оттяните чашеобразную сетчатку от центра глаза с помощью тонких щипцов. Промойте сетчатку 0,1 М PB (pH 7,4) в чистой чашке Петри.

4. Иммунофлюоресцентное окрашивание и очищение тканей сетчатки

1. Осторожно удалите чашеобразную сетчатку и инкубируйте ее в 2% растворе Triton X-100 в 0,1 М PB (pH 7,4) в течение ночи при температуре 4 °C.
2. Перенесите сетчатку в раствор для блокировки (0,1 М PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% азид натрия + 10% обычная ослиная сыворотка) и вращайте со скоростью 72 об/мин на шейкере в течение ночи при температуре 4 °C.
3. Перенесите сетчатку в раствор, содержащий первичные антитела козьего анти-PDGFR-β (10 мкг/мл) в буфере для разведения (0,1 М ПБ + 0,2% Тритон-Х 100 + 0,2% азид натрия + 1% нормальная ослиная сыворотка) в микроцентрифужной пробирке и вращайте на шейкере в течение 2 суток при 4 °С.
4. Промойте сетчатку 2x с помощью буфера для стирки (0,1 М PB + 0,2% Triton-X 100) при комнатной температуре, затем держите их в буфере для стирки в течение ночи при температуре 4 °C на шейкере.
5. На следующий день перенесите сетчатку в смешанный раствор, содержащий 1 мг/мл вторичного антитела осла против козы 488 и 0,2 нг/мл флуоресцентного ядерного 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в микроцентрифужной пробирке и вращайте со скоростью 72 об/мин на шейкере в течение 5 ч при 4 °C.
6. Промойте сетчатку в 6-луночной пластине с промывочным буфером в течение 1 часа, 2х, при комнатной температуре. Держите сетчатку в буфере для стирки на шейкере в течение ночи при температуре 4 °C. Выполните визуализацию и анализ в соответствии с шагом 5 для получения изображений перед очищением тканей.
7. Перенесите сетчатку в реагент для очищения тканей и осторожно вращайте ее со скоростью 60 об/мин на шейкере в течение 1 часа при температуре 37 °C.
8. После очищения тканей промойте чашеобразную сетчатку 0,1 М PB (pH 7,4) в чистой чашке Петри.
9. Сделайте 4 радиальных разреза, достигающих примерно 2/3 радиуса сетчатки, с помощью пружинных ножниц для создания формы лепестка.
10. Расплющите и закрепите сетчатку на предметном стекле микроскопа, а затем удалите излишки PB с помощью небольшого кусочка абсорбирующей бумаги. Держите внутреннюю часть сетчатки на предметном стекле лицевой стороной вверх.
11. Обведите установленную сетчатку спейсером и заполните промежуток свежим реагентом для очистки тканей и покровным стеклопакетом.

5. Визуализация и анализы

1. Получите внешний вид сетчатки до (после выполнения шага 4.6) и после процедуры очищения тканей.
2. Сканируйте монтажные изображения помеченной сетчатки с помощью панорамного сканера срезов тканей. Используйте объектив с 2-кратным увеличением и NA 0,08.
3. Получение изображений с большим увеличением осуществляется с помощью конфокальной системы визуализации, оснащенной следующими объективами: 10-кратный объектив с NA 0,40 и 40-кратный объектив с NA 0,95. Установите конфокальную точечную дыру на 152 μм (объектив с 10-кратным увеличением) и 105 μм (объектив с 40-кратным увеличением). Установите пространственное разрешение захвата изображения на уровне 1024 x 1024 пикселей (объектив с 10-кратным увеличением) и 640 x 640 пикселей (объектив с 40-кратным увеличением).
4. Захват 50 изображений (Z-стек) в кадрах размером 2 мкм с маркированной сетчатки. Интегрируйте все изображения в один фокус в режиме проекции/топографии. Для настройки нажмите «Установить начальную фокальную плоскость» > «Установить конечную фокальную плоскость» > «Задать размер шага» > «Выбрать шаблон глубины» > «Захват изображений» > серии Z.
5. Получение изображений с использованием следующих длин волн возбуждения и излучения для различных сигналов флуоресценции: Зеленые флуоресцентные сигналы на длинах волн 499 нм и 519 нм; красные флуоресцентные сигналы на длинах волн 591 нм и 618 нм; и синие флуоресцентные сигналы на длинах волн 401 нм и 421 нм.
6. Восстановите изображения в трехмерном шаблоне путем импорта конфокальных изображений Z-стека в программное обеспечение для анализа, выбрав «Добавить новые поверхности» > «Выбрать параметры объема» > «Выбрать исходный канал» > «Настроить отображение» > «Настроить угол поверхности > моментальный снимок».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

При внешнем наблюдении цельной сетчатки прозрачность тканей цельной сетчатки была увеличена с помощью лечения очищения тканей по сравнению с сетчаткой без очищения тканей (Рисунок 1).

Для гистологического исследования на цельной сетча...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом исследовании мы подробно описали технический процесс демонстрации морфологии перицитов в сосудистой сети сетчатки с использованием ретроорбитального введения флуоресцентного лектина томата, иммунофлуоресцентного исследования с помощью PDGFR-β и очищения тка...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protect from light
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Research and Development	AF1042	25 µg
Imaris software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Panoramic tissue slice scanner	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Six-well plate	Costar	3335
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus microscope slide	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm