Visualización 3D de pericitos vasculares retinianos en ratones mediante inmunotinción

Resumen

Los pericitos de la vasculatura de la retina se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β después de la inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate. La retina marcada se trató posteriormente con el método de limpieza de tejidos y se montó completa para visualizar las vistas tridimensionales de los pericitos que rodean la vasculatura de la retina bajo un microscopio confocal.

Resumen

Los pericitos retinianos son esenciales para el desarrollo vascular y la estabilidad de la retina, desempeñando un papel clave en el mantenimiento de la integridad de la vasculatura retiniana. Para proporcionar una visión detallada de las características morfológicas de los pericitos, este estudio describió un nuevo enfoque que combina la inyección retroorbitaria de un agente fluorescente, la tinción inmunofluorescente y el tratamiento de limpieza de tejidos. En primer lugar, la lectina fluorescente de tomate se inyectó en el seno retroorbitario del ratón vivo para marcar la vasculatura de la retina. Después de 5 minutos, el ratón fue sacrificado y su retina intacta se extrajo cuidadosamente de la copa de la retina y se tiñó inmunofluorescentemente con el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β para revelar los pericitos. Además, la retina teñida se trató con un reactivo de limpieza de tejidos y se montó entera en el portaobjetos del microscopio. A través de estos enfoques, la vasculatura retiniana y los pericitos se observaron claramente en la retina transparente. Bajo un microscopio confocal, obtuvimos más oportunidades de tomar imágenes de alta resolución para reconstruir y analizar las características morfológicas de los pericitos a lo largo del árbol vascular de la retina en una vista tridimensional. Metodológicamente, este protocolo ofrece un enfoque eficaz para visualizar los pericitos dentro de la vasculatura de la retina, proporcionando información valiosa sobre su papel tanto en condiciones fisiológicas como patológicas.

Introducción

Los pericitos de la retina están incrustados dentro de la membrana basal a lo largo del lado abluminal de las células endoteliales vasculares, mostrando un patrón en forma de malla de procesos de corto alcance envueltos alrededor de^{los vasos} sanguíneos de la retina. Este contacto íntimo entre los pericitos y la vasculatura retiniana contribuye al mantenimiento de la homeostasis ambiental de la retina². Aunque numerosos estudios han proporcionado evidencia morfológica de los pericitos en la vasculatura retiniana, la mayor parte de nuestra comprensión de las características morfológicas de los pericitos retinianos proviene de técnicas histológicas convencionales³.

En línea con estos estudios, diseñamos este estudio para mostrar de manera efectiva más detalles morfológicos de los pericitos en la microvasculatura de la retina mediante la combinación de técnicas histológicas tradicionales con métodos científicos modernos de vanguardia. El enfoque aquí integra tres técnicas clave: inyección retroorbital de lectina fluorescente de tomate en ratones vivos, tinción inmunofluorescente con receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas β (PDGFR-β) y la estrategia de limpieza de tejidos basada en solventes. La inyección retroorbital de lectina fluorescente de tomate ha demostrado ser eficaz y fiable para observar la vasculatura de la retina del ratón tanto in vivo como in vitro ^4,5. El PDGFR-β sirve como un biomarcador comúnmente utilizado para la tinción inmunofluorescente de pericitos⁶. Para capturar imágenes de alta resolución de los pericitos dentro de las retinas más gruesas y de montaje completo, la estrategia de limpieza de tejidos mejora la transparencia histológica ^2,7,8.

Si bien cada una de estas técnicas se ha aplicado individualmente en estudios de retina, su compatibilidad combinada para investigar pericitos en la vasculatura de la retina de ratones sigue siendo incierta. Dado que el grosor promedio de la retina del ratón es de aproximadamente 180-220 μm⁹, el marcaje de anticuerpos y la obtención de imágenes confocales en este tejido grueso sin tratamiento de aclaramiento a menudo resultan en señales de fondo altas, lo que complica la observación de la relación espacial entre los pericitos y los vasos sanguíneos¹⁰. A través de los enfoques descritos aquí, nuestro objetivo es proporcionar un método sencillo para visualizar los pericitos dentro de la vasculatura de la retina en una vista tridimensional (3D) bajo un microscopio confocal. Esta información celular mejorada de los pericitos en la vasculatura de la retina podría mejorar nuestra comprensión de la homeostasis ambiental de la retina y subrayar las estrategias potenciales para la protección vascular, mejorando así los resultados funcionales en los trastornos vasculares de la retina.

Protocolo

Para este estudio, se utilizaron tres ratones machos C57BL/6 adultos jóvenes (de 8 a 10 semanas de edad, con un peso de 20 a 25 g). Se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con temperatura y humedad controladas y se les permitió el libre acceso a alimentos y agua. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión de la Academia China de Ciencias Médicas Chinas (aprobación No. 2023-03-14-04) y se realizó de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).

1. Inyección retroorbital in vivo de lectina fluorescente de tomate

1. Inyectar 50 mg/kg de pentobarbital por vía intraperitoneal para anestesiar al ratón. Evalúe la profundidad de la anestesia evaluando la ausencia de una respuesta a un estímulo de pellizco en el dedo del pie.
2. Coloque el ratón en la decúbito lateral derecho con la cabeza hacia la izquierda.
3. Presione dos dedos suavemente sobre el área periorbitaria para exponer el ojo izquierdo del ratón y permitir la administración más fácil de la inyección en el seno retroorbitario izquierdo del animal¹¹.
4. Utilice una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 27G para perforar suavemente unos 2-3 mm en el seno venoso orbitario del ratón con el bisel de la aguja hacia adelante en un ángulo de 45°.
5. Inyecte 0,1 mL (1 mg/mL) de lectina fluorescente de tomate en el seno venoso orbitario del ratón.

2. Perfusión y enucleación de los ojos

1. A los 5 min después de la inyección retroorbitaria, inyectar la solución de tribromoetanol (250 mg/kg) por vía intraperitoneal para anestesiar profundamente al ratón. Posteriormente, se practica la eutanasia del animal mediante exanguinación y perfusión cardíaca. Una vez que se detenga la respiración, abra la cavidad torácica con unas tijeras quirúrgicas¹².
2. Una vez que se detenga la respiración, abra la cavidad torácica con unas tijeras quirúrgicas. Esterilice los instrumentos quirúrgicos con anticipación y opere con una campana extractora. Utilice una aguja de 24G e insértela 2 mm en el ventrículo cardíaco izquierdo a través del vértice ventricular izquierdo. Realizar la perfusión a una velocidad de 3 mL/min con 20 mL de solución salina fisiológica al 0,9% seguido de 20 mL de formaldehído al 4% en tampón de fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).
3. Coloque el ratón sacrificado de lado y retire la piel cubriendo los ojos con unas tijeras. Enuclear los ojos con tijeras y fórceps.
4. Corte el nervio óptico y los tejidos circundantes, luego levante el ojo y transfiéralo a una placa de 12 pocillos para su posterior fijación en formaldehído al 4% en PB 0,1 M durante 2 h.
5. Crioproteger el tejido en sacarosa al 25% en 0,1 M PB (pH 7,4) a 4 °C hasta que se hunda hasta el fondo de la solución.
   NOTA: Dado que el tejido ocular se deshidrata bien en una solución de sacarosa, la retina se puede desprender más fácil y completamente, lo que facilita estudios exhaustivos posteriores.

3. Disección de retinas

1. Transfiera los ojos a una placa de Petri que contenga 0,1 M PB (pH 7,4) con una pipeta Pasteur de plástico.
2. Perfore el borde de la córnea con unas tijeras afiladas, corte alrededor de la córnea y el iris y deséchelo.
3. Use fórceps para extraer el cristalino y el humor vítreo. Luego, aleje la retina en forma de copa del centro del ojo con pinzas finas. Enjuague la retina con 0,1 M PB (pH 7,4) en una placa de Petri limpia.

4. Tinción inmunofluorescente y limpieza de tejidos de retina

1. Retire con cuidado la retina en forma de copa e incubela en una solución de Triton X-100 al 2% en 0,1 M PB (pH 7,4) durante la noche a 4 °C.
2. Transfiera la retina a la solución de bloqueo (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% azida sódica + 10% suero de burro normal) y gire a 72 rpm en el agitador durante la noche a 4 °C.
3. Transfiera la retina a la solución que contiene los anticuerpos primarios de cabra anti-PDGFR-β (10 μg/mL) en tampón de dilución (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100 + 0,2% azida sódica + 1% suero de burro normal) en un tubo de microcentrífuga y gire en el agitador durante 2 días a 4 °C.
4. Lave la retina 2 veces con tampón de lavado (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) a temperatura ambiente, luego manténgala en tampón de lavado durante la noche a 4 °C en el agitador.
5. Al día siguiente, transfiera la retina a la solución mezclada que contiene el anticuerpo secundario de 1 mg/mL de burro anti-cabra 488 y 0,2 ng/mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) nuclear fluorescente en un tubo de microcentrífuga y gire a 72 rpm en el agitador durante 5 h a 4 °C.
6. Lave la retina en una placa de 6 pocillos con tampón de lavado durante 1 h, 2 veces, a temperatura ambiente. Mantenga la retina en tampón de lavado en el agitador durante la noche a 4 °C. Realice imágenes y análisis según el paso 5 para obtener las vistas de aclarado de tejido antes de la aclaración.
7. Transfiera la retina al reactivo de limpieza de tejidos y gírela suavemente a 60 rpm en el agitador durante 1 h a 37 °C.
8. Después del tratamiento de limpieza de tejidos, enjuague la retina en forma de copa con 0,1 M PB (pH 7,4) en una placa de Petri limpia.
9. Haga 4 incisiones radiales que alcancen aproximadamente 2/3 del radio de la retina con unas tijeras de resorte para crear una forma de pétalo.
10. Aplana y monta la retina en un portaobjetos de microscopio, y luego retira el exceso de PB con un pequeño trozo de papel absorbente. Mantenga el interior de la retina hacia arriba en el portaobjetos.
11. Rodea la retina montada con un espaciador y rellena el espacio con un reactivo para limpiar tejidos y un cubreobjetos.

5. Imágenes y análisis

1. Obtenga las vistas externas de la retina antes (después de completar el paso 4.6) y después del tratamiento de limpieza de tejidos.
2. Escanee las vistas de montaje de la retina etiquetada con el escáner panorámico de corte de tejido. Utilice un objetivo 2x con un NA de 0,08.
3. Tome las imágenes de mayor aumento mediante un sistema de imágenes confocal equipado con las siguientes lentes de objetivos: lente de 10x con NA de 0.40 y lente de 40x con NA de 0.95. Ajuste el orificio confocal a 152 μm (lente de objetivo de 10x) y 105 μm (lente de objetivo de 40x). Establezca la resolución espacial de la captura de imágenes en 1024 x 1024 píxeles (lente de objetivo de 10x) y 640 x 640 píxeles (lente de objetivo de 40x).
4. Capture 50 imágenes (pila Z) en fotogramas de 2 μm desde la retina etiquetada. Integre todas las imágenes en un solo enfoque bajo el modo de proyección/topografía. Para la configuración, haga clic en Establecer plano focal inicial > Establecer plano focal final > Establecer tamaño de paso > Elegir patrón de profundidad > Captura de imagen > serie Z.
5. Capture imágenes utilizando las siguientes longitudes de onda de excitación y emisión para diferentes señales de fluorescencia: Señales de fluorescencia verde a 499 nm y 519 nm; señales de fluorescencia roja a 591 nm y 618 nm; y señales de fluorescencia azul a 401 nm y 421 nm.
6. Reconstruya las imágenes en el patrón tridimensional importando imágenes confocales de pila Z a un software de análisis seleccionando Agregar nuevas superficies > Elegir configuración de volumen > Elegir canal de origen > Ajustar visualización > Ajustar ángulo de superficie > instantánea.

Resultados

A partir de las vistas externas de la retina de montaje completo, la transparencia del tejido de la retina de montaje completo aumentó con el tratamiento de limpieza de tejidos en comparación con la de la retina sin limpieza de tejidos (Figura 1).

Para el examen histológico de la retina de montaje completo, la vasculatura de la retina se marcó en rojo con lectina fluorescente de tomate a través de la inyección retroorbitaria...

Discusión

En este estudio, detallamos el proceso técnico para demostrar la morfología de los pericitos en la vasculatura de la retina mediante inyección retroorbitaria de lectina fluorescente de tomate, examen inmunofluorescente con PDGFR-β y aclaramiento de tejidos a base de solventes. Los resultados muestran que estas técnicas son altamente compatibles para resaltar pericitos en la retina de montaje completo. La combinación de estas metodologías ofrece un enfoque eficaz para visualizar la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protect from light
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Research and Development	AF1042	25 µg
Imaris software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Panoramic tissue slice scanner	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Six-well plate	Costar	3335
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus microscope slide	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm