Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

Özet

Retinal vasküler sistemdeki perisitler, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu sonrası trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan boyama ile incelendi. Etiketli retina, doku temizleme yöntemi ile daha fazla tedavi edildi ve retina vaskülatürünü çevreleyen perisitlerin üç boyutlu görünümlerini konfokal mikroskop altında görselleştirmek için tamamen monte edildi.

Özet

Retina perisitleri, retinanın vasküler gelişimi ve stabilitesi için gereklidir ve retina damar sisteminin bütünlüğünün korunmasında önemli bir rol oynar. Perisitlerin morfolojik özelliklerinin ayrıntılı bir görünümünü sağlamak için, bu çalışma, bir floresan ajanın retro-orbital enjeksiyonunu, immünofloresan boyamayı ve doku temizleme tedavisini birleştiren yeni bir yaklaşımı tanımlamıştır. İlk olarak, floresan domates lektini, retina vaskülatürünü etiketlemek için canlı farenin retro-orbital sinüsüne enjekte edildi. 5 dakika sonra, fare sakrifiye edildi ve sağlam retinası retina kabından dikkatlice çıkarıldı ve perisitleri ortaya çıkarmak için trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü β ile immünofloresan olarak boyandı. Ek olarak, lekeli retina doku temizleme reaktifi ile muamele edildi ve bütün mikroskop lamı üzerine monte edildi. Bu yaklaşımlar sayesinde şeffaf retinada retina vasküler sistemi ve perisitler net olarak gözlenmiştir. Konfokal bir mikroskop altında, retinal vasküler ağaç boyunca perisitlerin morfolojik özelliklerini üç boyutlu bir görünümde daha fazla yeniden yapılandırmak ve analiz etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüler almak için daha fazla fırsat elde ettik. Metodolojik olarak, bu protokol retina vaskülatürü içindeki perisitleri görselleştirmek için etkili bir yaklaşım sunar ve hem fizyolojik hem de patolojik koşullar altındaki rolleri hakkında değerli bilgiler sağlar.

Giriş

Retinal perisitler, vasküler endotel hücrelerinin abluminal tarafı boyunca bazal membranın içine gömülür ve retina kan damarlarının etrafına sarılmış kısa menzilli süreçlerin ağ benzeri bir modelini gösterir¹. Perisitler ve retina vaskülatürü arasındaki bu yakın temas, retina çevresel homeostazının^{korunmasına katkıda bulunur 2}. Çok sayıda çalışma retina vaskülatüründeki perisitlerin morfolojik kanıtlarını sağlamış olsa da, retina perisitlerinin morfolojik özelliklerini anlamamızın çoğu geleneksel histolojik tekniklerden gelmektedir³.

Bu çalışmalara paralel olarak, bu çalışmayı, geleneksel histolojik teknikleri modern en son bilimsel yöntemlerle birleştirerek retina mikrovaskülatüründeki perisitlerin daha morfolojik ayrıntılarını etkili bir şekilde göstermek için tasarladık. Buradaki yaklaşım üç temel tekniği bütünleştirir: canlı farelerde floresan domates lektininin retro-orbital enjeksiyonu, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptör β (PDGFR-β) ile immünofloresan boyama ve solvent bazlı doku temizleme stratejisi. Floresan domates lektininin retro-orbital enjeksiyonunun, hem in vivo hem de in vitro ortamlarda fare retina damar sistemini gözlemlemek için etkili ve güvenilir olduğu kanıtlanmıştır ^4,5. PDGFR-β, perisitlerin⁶ immünofloresan boyaması için yaygın olarak kullanılan bir biyobelirteç görevi görür. Daha kalın ve tam montajlı retinalardaki perisitlerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini yakalamak için doku temizleme stratejisi histolojik şeffaflığı artırır ^2,7,8.

Bu tekniklerin her biri retina çalışmalarında ayrı ayrı uygulanmış olsa da, fare retina vaskülatüründe perisitleri araştırmak için birleşik uyumlulukları belirsizliğini korumaktadır. Fare retinasının ortalama kalınlığı yaklaşık 180-220 μm⁹ olduğundan, temizleme tedavisi olmadan bu kalın dokuda antikor etiketleme ve konfokal görüntüleme genellikle yüksek arka plan sinyallerine neden olur ve perisitler ve kan damarları arasındaki uzamsal ilişkinin gözlemlenmesini zorlaştırır¹⁰. Burada açıklanan yaklaşımlarla, retina damar sistemi içindeki perisitleri konfokal mikroskop altında üç boyutlu (3D) bir görünümde görselleştirmek için basit bir yöntem sağlamayı amaçlıyoruz. Retina vaskülatüründeki perisitlerden gelen bu gelişmiş hücresel bilgi, retinal çevresel homeostaz anlayışımızı geliştirebilir ve vasküler koruma için potansiyel stratejilerin altını çizebilir, böylece retinal vasküler bozukluklarda fonksiyonel sonuçları iyileştirebilir.

Protokol

Bu çalışma için üç genç yetişkin erkek C57BL / 6 fare (8-10 haftalık, 20-25 g ağırlığında) kullanıldı. Kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsüne yerleştirildiler ve yiyecek ve suya serbest erişime izin verildi. Bu çalışma, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Yakı Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay No. 2023-03-14-04) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne (National Academy Press, Washington, DC, 1996) uygun olarak yürütülmüştür.

1. Floresan domates lektininin in vivo retro-orbital enjeksiyonu

1. Fareyi uyuşturmak için intraperitoneal olarak 50 mg / kg pentobarbital enjekte edin. Ayak parmağı sıkışma uyaranına yanıt verilmemesini değerlendirerek anestezi derinliğini değerlendirin.
2. Fareyi, başı sola bakacak şekilde sağ yanal yaslanacak şekilde yerleştirin.
3. Enjeksiyonun hayvanın sol retro-orbital sinüsüne en kolay şekilde uygulanmasını sağlamak için farenin sol gözünü ortaya çıkarmak için peri-orbital alana iki parmağınızı hafifçe bastırın¹¹.
4. İğnenin eğimi 45°'lik bir açıyla öne bakacak şekilde farenin orbital venöz sinüsünü yaklaşık 2-3 mm nazikçe delmek için 27G iğne ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanın.
5. Farenin orbital venöz sinüsüne 0.1 mL (1 mg / mL) floresan domates lektini enjekte edin.

2. Gözlerin perfüzyonu ve enükleasyonu

1. Retroorbital enjeksiyondan 5 dakika sonra, fareyi derinlemesine uyuşturmak için intraperitoneal olarak tribromoetanol solüsyonu (250 mg / kg) enjekte edin. Daha sonra, hayvanı kan kaybı ve kardiyak perfüzyon yoluyla ötenazi yapın. Solunum durduğunda göğüs boşluğunu cerrahi makasla^{açın 12}.
2. Solunum durduğunda göğüs boşluğunu cerrahi makasla açın. Cerrahi aletleri önceden sterilize edin ve çeker ocakta çalıştırın. 24G'lik bir iğne kullanın ve sol ventrikül tepesinden sol kardiyak ventriküle 2 mm yerleştirin. 20 mL% 0.9 fizyolojik salin ile 3 mL / dk oranında perfüzyon gerçekleştirin, ardından 0.1 M fosfat tamponunda (PB, pH 7.4) 20 mL% 4 formaldehit uygulayın.
3. Kurban edilen fareyi yan yatırın ve gözleri makasla kaplayan cildi çıkarın. Gözleri makas ve forseps ile enüklee edin.
4. Optik siniri ve çevresindeki dokuları kesin, daha sonra gözü kaldırın ve 2 saat boyunca 0.1 M PB'de% 4 formaldehit içinde sonradan sabitleme için 12 oyuklu bir plakaya aktarın.
5. Dokuyu 4 ° C'de 0.1 M PB'de (pH 7.4) %25 sükroz içinde çözeltinin dibine batana kadar kriyoprotekte tutun.
   NOT: Oküler doku bir sükroz çözeltisinde iyi bir şekilde dehidre olduğundan, retina daha kolay ve tamamen ayrılabilir ve bu da sonraki kapsamlı çalışmaları kolaylaştırır.

3. Retinaların diseksiyonu

1. Gözleri plastik bir Pasteur pipeti kullanarak 0,1 M PB (pH 7,4) içeren bir Petri kabına aktarın.
2. Korneanın kenarını keskin bir makasla delin, kornea ve irisin etrafını kesin ve atın.
3. Lensi ve vitröz mizahı çıkarmak için forseps kullanın. Daha sonra fincan şeklindeki retinayı ince forsepslerle gözün merkezinden uzaklaştırın. Retinayı temiz bir Petri kabında 0.1 M PB (pH 7.4) ile durulayın.

4. Retinaların immünofloresan boyama ve doku temizleme

1. Kap şeklindeki retinayı dikkatlice çıkarın ve gece boyunca 4 ° C'de 0.1 M PB (pH 7.4) içinde% 2 Triton X-100 çözeltisinde inkübe edin.
2. Retinayı bloke edici solüsyona (0.1 M PB + %1 Triton-X 100 + %0.2 sodyum azid + %10 normal eşek serumu) aktarın ve gece boyunca 4 °C'de çalkalayıcı üzerinde 72 rpm'de döndürün.
3. Retinayı, bir mikrosantrifüj tüpünde seyreltme tamponunda (0.1 M PB + %0.2 Triton-X 100 + %0.2 sodyum azid + %1 normal eşek serumu) keçi anti-PDGFR-β'nin (10 μg/mL) birincil antikorlarını içeren çözeltiye aktarın ve çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de 2 gün döndürün.
4. Retina 2x'i oda sıcaklığında yıkama tamponu (0.1 M PB + %0.2 Triton-X 100) ile yıkayın, ardından çalkalayıcı üzerinde 4 °C'de gece boyunca yıkama tamponunda tutun.
5. Ertesi gün, retinayı bir mikrosantrifüj tüpünde eşek anti-keçi 488 ve 0.2 ng / mL floresan nükleer 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolün (DAPI) 1 mg / mL ikincil antikorunu içeren karışık çözeltiye aktarın ve çalkalayıcı üzerinde 72 rpm'de 4 ° C'de 5 saat döndürün.
6. Retinayı oda sıcaklığında 1 saat, 2 kez yıkama tamponu ile 6 oyuklu bir plakada yıkayın. Retinayı gece boyunca 4 °C'de çalkalayıcı üzerindeki yıkama tamponunda tutun. Doku temizleme öncesi görünümleri elde etmek için 5. adıma göre görüntüleme ve analiz yapın.
7. Retinayı doku temizleme reaktifine aktarın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca çalkalayıcı üzerinde 60 rpm'de hafifçe döndürün.
8. Doku temizleme işleminden sonra, fincan şeklindeki retinayı temiz bir Petri kabında 0.1 M PB (pH 7.4) ile durulayın.
9. Taç yaprağı şekli oluşturmak için yaylı makas kullanarak retina yarıçapının yaklaşık 2 / 3'üne ulaşan 4 radyal kesi yapın.
10. Retinayı düzleştirin ve bir mikroskop lamına monte edin ve ardından fazla PB'yi küçük bir emici kağıt parçasıyla çıkarın. Retinanın iç kısmını slaytta yukarı bakacak şekilde tutun.
11. Monte edilmiş retinayı bir ara parça ile daire içine alın ve boşluğu taze doku temizleme reaktifi ve bir lamel ile doldurun.

5. Görüntüleme ve analizler

1. Doku temizleme tedavisinden önce (adım 4.6'yı tamamladıktan sonra) ve sonrasında retinanın dış görünümlerini elde edin.
2. Etiketli retinanın montaj görünümlerini panoramik doku dilimi tarayıcısı ile tarayın. NA'sı 0,08 olan 2x objektif lensi kullanın.
3. Aşağıdaki objektif lenslerle donatılmış konfokal görüntüleme sistemi ile daha yüksek büyütmeli görüntüler çekin: NA'sı 0.40 olan 10x lens ve NA'sı 0.95 olan 40x lens. Konfokal iğne deliğini 152 μm (10x objektif lens) ve 105 μm (40x objektif lens) olarak ayarlayın. Görüntü yakalamanın uzamsal çözünürlüğünü 1024 x 1024 piksel (10x objektif lens) ve 640 x 640 piksel (40x objektif lens) olarak ayarlayın.
4. Etiketli retinadan 2 μm karelerde 50 görüntü (Z-yığını) yakalayın. Projeksiyon/topografi modunda tüm görüntüleri tek bir odakta birleştirin. Kurulum için Başlangıç Odak Düzlemini Ayarla > Bitiş Odak Düzlemini Ayarla > Adım boyutunu ayarla > Z serisi > Görüntü Yakalama > Derinlik Deseni Seç'e tıklayın.
5. Farklı floresan sinyalleri için aşağıdaki uyarma ve emisyon dalga boylarını kullanarak görüntüler yakalayın: 499 nm ve 519 nm'de yeşil floresan sinyalleri; 591 nm ve 618 nm'de kırmızı floresan sinyalleri; ve 401 nm ve 421 nm'de mavi floresan sinyalleri.
6. Yeni Yüzeyler Ekle > Ses ayarlarını seç > Kaynak Kanalı Seç > Ekranı ayarla > Yüzey Açısını Ayarla > Anlık Görüntü Al seçeneğini belirleyerek Z-yığını konfokal görüntüleri bir analiz yazılımına aktararak görüntüleri üç boyutlu desende yeniden oluşturun.

Sonuçlar

Tam montajlı retinanın dış görünümlerinden, doku temizleme tedavisi kullanılarak tüm montajlı retinanın doku şeffaflığı, doku temizleme yapılmayan retinanınkine kıyasla arttırıldı (Şekil 1).

Tüm mount retina üzerindeki histolojik inceleme için, retina vaskülatürü retro-orbital enjeksiyon yoluyla floresan domates lektini ile kırmızı ile işaretlendi ve retinal perisitler PDGFR-β ile yeşil renkte gö...

Tartışmalar

Bu çalışmada, retroorbital floresan domates lektin enjeksiyonu, PDGFR-β ile immünofloresan inceleme ve solvent bazlı doku temizleme kullanılarak retina vasküler sistemindeki perisitlerin morfolojisini göstermek için teknik süreç detaylandırıldı. Sonuçlar, bu tekniklerin tam montajlı retinadaki perisitleri vurgulamak için oldukça uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu metodolojilerin kombinasyonu, retina vaskülatüründeki perisitlerin morfolojik özelliklerini ayrıntı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protect from light
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Research and Development	AF1042	25 µg
Imaris software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Panoramic tissue slice scanner	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Six-well plate	Costar	3335
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus microscope slide	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm