Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화

요약

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

초록

망막 주위세포는 혈관 발달과 망막의 안정성에 필수적이며, 망막 혈관 구조의 무결성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 주피세포의 형태학적 특성에 대한 자세한 견해를 제공하기 위해 이 연구는 형광제의 역궤도 주입, 면역형광 염색 및 조직 제거 처리를 결합한 새로운 접근 방식을 설명했습니다. 첫째, 형광 토마토 렉틴을 살아있는 쥐의 후안와동에 주입하여 망막 혈관 구조를 표시했습니다. 5분 후, 마우스를 희생하고 온전한 망막을 망막 컵에서 조심스럽게 제거하고 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역형광 염색하여 주피세포를 드러냈습니다. 또한, 염색된 망막을 조직 투명화 시약으로 처리하고 현미경 슬라이드에 전체를 장착했습니다. 이러한 접근법을 통해 투명한 망막에서 망막 혈관 구조와 주위 세포를 명확하게 관찰할 수 있었습니다. 컨포칼 현미경을 통해 망막 혈관 나무를 따라 있는 주피세포의 형태학적 특성을 3차원으로 추가로 재구성하고 분석하기 위한 고해상도 이미지를 촬영할 수 있는 더 많은 기회를 얻었습니다. 방법론적으로 이 프로토콜은 망막 혈관 구조 내의 주위 세포를 시각화하기 위한 효과적인 접근 방식을 제공하여 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 주위 세포의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

서문

망막 주위세포(retinal pericyte)는 혈관 내피 세포(vascular endothelial cell)의 압발(abluminal) 쪽을 따라 기저막(basement membrane) 내에 내장되어 있으며, 망막 혈관을 감싸고 있는 단거리 돌기의 그물망 같은 패턴을 나타냅니다¹. 주피세포와 망막 혈관 구조 사이의 이러한 밀접한 접촉은 망막 환경 항상성을 유지하는 데 기여합니다². 수많은 연구에서 망막 혈관 구조의 주위 세포에 대한 형태학적 증거를 제공했지만, 망막 주위 세포의 형태학적 특성에 대한 이해의 대부분은 기존의 조직학적 기법에서 비롯됩니다³.

이러한 연구에 발맞춰 우리는 전통적인 조직학적 기술과 현대의 최첨단 과학적 방법을 결합하여 망막 미세혈관 구조에서 주피세포의 보다 형태학적 세부 사항을 효과적으로 보여주기 위해 이 연구를 설계했습니다. 이 접근법은 살아있는 쥐에서 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주입, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β(PDGFR-β)을 사용한 면역형광 염색, 용매 기반 조직 정화 전략의 세 가지 핵심 기술을 통합합니다. 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사는 생체 내 및 체외 환경 모두에서 마우스 망막 혈관 구조를 관찰하는 데 효과적이고 신뢰할 수 있는 것으로 입증되었습니다 ^4,5. PDGFR-β는 주피세포의 면역형광 염색을 위해 일반적으로 사용되는 바이오마커 역할을 합니다⁶. 더 두껍고 전체적으로 장착된 망막 내에 있는 주피세포의 고해상도 이미지를 캡처하기 위해 조직 제거 전략은 조직학적 투명도를 향상시킵니다 ^2,7,8.

이러한 각 기술은 망막 연구에 개별적으로 적용되었지만, 마우스 망막 혈관 구조에서 주위 세포를 조사하기 위한 결합된 호환성은 불확실합니다. 마우스 망막의 평균 두께는 약 180-220 μm⁹이기 때문에 치료를 받지 않고 이 두꺼운 조직에서 항체 표지 및 컨포칼 이미징은 종종 높은 백그라운드 신호를 초래하여 주피세포와 혈관 사이의 공간적 관계 관찰을 복잡하게 만듭니다¹⁰. 여기에 설명된 접근 방식을 통해 컨포칼 현미경에서 3차원(3D) 보기로 망막 혈관 구조 내의 주위 세포를 시각화하는 간단한 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 망막 혈관 구조에 있는 주위 세포의 이러한 향상된 세포 정보는 망막 환경 항상성에 대한 이해를 높이고 혈관 보호를 위한 잠재적 전략을 강조하여 망막 혈관 질환의 기능적 결과를 향상시킬 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구를 위해 3마리의 젊은 성인 수컷 C57BL/6 마우스(8-10주령, 체중 20-25g)를 사용했습니다. 그들은 온도와 습도가 조절된 12시간 라이트/다크 사이클에 수용되었으며 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다. 본 연구는 중국의학원 침술 및 뜸 연구소 윤리위원회(승인번호 2023-03-14-04)의 승인을 받았으며, 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 따라 수행되었다.

1. 형광 토마토 렉틴의 생체 내 역궤도 주입

1. 마우스를 마취하기 위해 복강내 50mg/kg의 펜토바르비탈을 주사합니다. 발가락 꼬집음 자극에 대한 반응의 부재를 평가하여 마취의 깊이를 평가합니다.
2. 머리가 왼쪽을 향하도록 마우스를 오른쪽 측면 누운 자세에 놓습니다.
3. 두 손가락으로 안와 주위 부위를 부드럽게 눌러 마우스의 왼쪽 눈을 노출시켜 동물의 왼쪽 후안와 동에 주사를 가장 쉽게 투여할 수 있도록 합니다¹¹.
4. 27G 바늘이 장착된 1mL 주사기를 사용하여 바늘의 경사가 45° 각도로 앞을 향하도록 하여 마우스의 안와 정맥동에 약 2-3mm를 부드럽게 뚫습니다.
5. 0.1mL(1mg/mL)의 형광 토마토 렉틴을 마우스의 안와 정맥동에 주입합니다.

2. 눈의 관류 및 적출

1. 역안와 주사 후 5분에 트리브로모에탄올 용액(250mg/kg)을 복강내에 주입하여 마우스를 심층 마취합니다. 그 후, 출혈과 심장 관류를 통해 동물을 안락사시킵니다. 호흡이 멈추면 수술 용 가위로 흉강을 엽니^{다. 12}.
2. 호흡이 멈추면 수술용 가위로 흉강을 엽니다. 수술 기구를 미리 소독하고 흄 후드에서 수술하십시오. 24G 바늘을 사용하여 좌심실 정점을 통해 좌심실에 2mm 삽입합니다. 0.9% 생리식염수 20mL를 투여한 후 0.1M 인산염 완충액(PB, pH 7.4)에 4% 포름알데히드 20mL를 투여하여 3mL/분의 속도로 관류를 수행합니다.
3. 희생된 쥐를 옆으로 눕히고 가위로 눈을 덮고 있는 피부를 제거합니다. 가위와 집게로 눈을 적출합니다.
4. 시신경과 주변 조직을 절단한 다음 눈을 들어 올리고 12웰 플레이트로 옮겨 0.1M PB의 4% 포름알데히드를 2시간 동안 고정합니다.
5. 용액의 바닥으로 가라앉을 때까지 0.1M PB(pH 7.4)의 25% 자당에서 조직을 4% 동결 보호합니다.
   참고: 안구 조직은 자당 용액에서 잘 탈수되기 때문에 망막을 더 쉽고 완전히 분리할 수 있어 후속 종합 연구를 용이하게 할 수 있습니다.

3. 망막 절제

1. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 0.1M PB(pH 7.4)가 들어 있는 페트리 접시에 눈을 옮깁니다.
2. 날카로운 가위로 각막의 가장자리를 뚫고 각막과 홍채 주위를 잘라 버립니다.
3. 집게를 사용하여 수정체와 유리체액을 제거합니다. 그런 다음 컵 모양의 망막을 가는 집게로 눈 중심에서 당겨 빼냅니다. 깨끗한 페트리 접시에 0.1M PB(pH 7.4)로 망막을 헹굽니다.

4. 망막의 면역 형광 염색 및 조직 청소

1. 컵 모양의 망막을 조심스럽게 제거하고 2% Triton X-100 용액에 0.1M PB(pH 7.4)의 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
2. 망막을 차단 용액(0.1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0.2% 아지드화나트륨 + 10% 일반 당나귀 혈청)으로 옮기고 4°C에서 밤새 쉐이커에서 72rpm으로 회전합니다.
3. 마이크로 원심분리기 튜브에 희석 완충액(0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100 + 0.2% 아지드화나트륨 + 1% 일반 당나귀 혈청)에 염소 항 PDGFR-β의 1차 항체가 들어 있는 용액에 망막을 옮기고 4°C에서 2일 동안 셰이커에서 회전합니다.
4. 실온에서 세척 버퍼(0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100)로 망막을 2x 세척한 다음 셰이커에서 4 °C의 세척 버퍼에 밤새 보관합니다.
5. 다음날, 당나귀 항염소 488의 1mg/mL 2차 항체와 0.2ng/mL 형광 핵 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)이 포함된 혼합 용액에 망막을 옮기고 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 셰이커에서 72rpm으로 4°C에서 5시간 동안 회전합니다.
6. 세척 버퍼가 있는 6웰 플레이트에 담긴 망막을 실온에서 1시간, 2회 세척합니다. 망막을 4°C에서 밤새 셰이커의 세척 버퍼에 보관하십시오. 5단계에 따라 이미징 및 분석을 수행하여 조직 제거 전 보기를 얻습니다.
7. 망막을 조직 제거 시약으로 옮기고 37°C에서 1시간 동안 셰이커에서 60rpm으로 부드럽게 회전합니다.
8. 조직 제거 치료 후 깨끗한 페트리 접시에서 컵 모양의 망막을 0.1M PB(pH 7.4)로 헹굽니다.
9. 스프링 가위를 사용하여 망막 반경의 약 2/3에 이르는 4개의 방사형 절개를 만들어 꽃잎 모양을 만듭니다.
10. 망막을 평평하게 펴서 현미경 슬라이드에 장착한 다음 작은 흡수성 종이 조각으로 여분의 PB를 제거합니다. 슬라이드에서 망막 내부가 위를 향하도록 합니다.
11. 장착된 망막에 스페이서를 둘러싸고 새로운 조직 제거 시약과 커버슬립으로 틈을 채웁니다.

5. 이미징 및 분석

1. 조직 제거 치료 전(4.6단계 완료 후)과 후에 망막의 외부 모습을 확인합니다.
2. 파노라마 조직 절편 스캐너로 라벨링된 망막의 몽타주 보기를 스캔합니다. NA가 0.08인 2x 대물렌즈를 사용합니다.
3. 뒤에 오는 대물렌즈 장비된 confocal 화상 진찰 체계에 의하여 더 높은 확대 심상을 가지고 가십시오: 0.40의 NA를 가진 10x 렌즈 및 0.95의 NA를 가진 40x 렌즈. 컨포칼 핀홀을 152μm(10x 대물렌즈) 및 105μm(40x 대물렌즈)로 설정합니다. 이미지 캡처의 공간 해상도를 1024 x 1024 픽셀(10x 대물 렌즈) 및 640 x 640 픽셀(40x 대물 렌즈)로 설정합니다.
4. 라벨링된 망막에서 2μm 프레임으로 50개의 이미지(Z-스택)를 캡처합니다. 프로젝션/지형 모드에서 모든 이미지를 단일 초점이 맞춰진 상태로 통합합니다. 셋업의 경우 시작 초점면 설정(Set Start Focal Plane) > 끝 초점면 설정(Set End Focal Plane) > 단계 크기 설정>(Set step size)을 클릭하여 뎁스 패턴(Depth Pattern)> 이미지 캡처(Image Capture > Z series)를 선택합니다.
5. 다양한 형광 신호에 대해 다음 excitation 및 emission 파장을 사용하여 이미지를 캡처합니다: 499nm 및 519nm에서 녹색 형광 신호; 591 nm 및 618 nm에서 적색 형광 신호; 및 401nm 및 421nm에서 청색 형광 신호.
6. Add New Surfaces(새 표면 추가) > Choose Volume settings(볼륨 설정 선택) > Choose Source Channel(소스 채널 선택) > Adjust display(디스플레이 조정) > Adjust Surface Angle > Snapshot(스냅샷 조정)을 선택하여 Z 스택 컨포칼 이미지를 분석 소프트웨어로 가져와 3차원 패턴으로 이미지를 재구성합니다.

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결과

전체 마운트 망막의 외부에서 볼 때, 조직 제거 처리를 받은 경우 조직 제거 처리가 없는 망막에 비해 전체 마운트 망막의 조직 투명도가 증가했습니다(그림 1).

산 망막 전체에 대한 조직학적 검사를 위해 후안와 주사를 통해 망막 혈관 구조를 형광 토마토 렉틴으로 빨간색으로 표시하고, 망막 주위 세포는 PDGFR-β로 녹색으로 표?...

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토론

본 연구에서는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주입, PDGFR-β를 이용한 면역형광 검사, 용매 기반 조직 투명화를 이용하여 망막 혈관 구조에서 주피세포의 형태를 입증하기 위한 기술적 과정을 자세히 설명하였다. 결과는 이러한 기술이 전체 마운트 망막에서 pericyte를 강조하는 데 매우 적합하다는 것을 보여줍니다. 이러한 방법론의 조합은 상세한 3D 관점에서 망막 혈관 구조?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protect from light
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Research and Development	AF1042	25 µg
Imaris software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Panoramic tissue slice scanner	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Six-well plate	Costar	3335
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus microscope slide	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm