通过免疫染色对小鼠视网膜血管周细胞进行 3D 可视化

摘要

眼眶后注射荧光番茄凝集素后，用血小板衍生生长因子受体β免疫荧光染色检查视网膜脉管系统中的周细胞。标记的视网膜进一步用组织透明化方法处理并安装整个，以便在共聚焦显微镜下可视化视网膜脉管系统周围周细胞的三维视图。

摘要

视网膜周细胞对于视网膜的血管发育和稳定性至关重要，在维持视网膜脉管系统的完整性方面起着关键作用。为了提供周细胞形态学特征的详细视图，本研究描述了一种结合荧光剂眼眶后注射、免疫荧光染色和组织透明化处理的新方法。首先，将荧光番茄凝集素注射到活小鼠的眶后窦中，以标记视网膜脉管系统。5 分钟后，处死小鼠，小心地从视网膜杯中取出其完整的视网膜，并用血小板衍生的生长因子受体β进行免疫荧光染色以显示周细胞。此外，用组织透明化试剂处理染色的视网膜，并将其整个安装在显微镜载玻片上。通过这些方法，在透明视网膜中清楚地观察到视网膜脉管系统和周细胞。在共聚焦显微镜下，我们获得了更多拍摄高分辨率图像的机会，以便在三维视图中进一步重建和分析沿视网膜血管树的周细胞的形态特征。在方法上，该协议提供了一种有效的方法来可视化视网膜脉管系统内的周细胞，为它们在生理和病理条件下的作用提供了有价值的见解。

引言

视网膜周细胞沿着血管内皮细胞的腔侧嵌入基底膜内，显示出包裹在视网膜血管周围的短程突起的网状图案¹。周细胞和视网膜脉管系统之间的这种亲密接触有助于维持视网膜环境稳态²。尽管许多研究提供了视网膜脉管系统中周细胞的形态学证据，但我们对视网膜周细胞形态特征的大部分理解来自常规的组织学技术³。

根据这些研究，我们设计了这项研究，通过将传统的组织学技术与现代前沿科学方法相结合，有效地展示了视网膜微血管系统中周细胞的更多形态学细节。该方法整合了三种关键技术：在活小鼠中眶后注射荧光番茄凝集素、血小板衍生生长因子受体β免疫荧光染色 （PDGFR-β） 和基于溶剂的组织透明化策略。荧光番茄凝集素的眶后注射已被证明在体内和体外环境中观察小鼠视网膜脉管系统有效且可靠 ^4,5。PDGFR-β 可作为周细胞免疫荧光染色的常用生物标志物⁶.为了捕获较厚和完整视网膜内周细胞的高分辨率图像，组织透明化策略提高了组织学透明度 ^2,7,8。

虽然这些技术中的每一种都已单独应用于视网膜研究，但它们在研究小鼠视网膜脉管系统中周细胞的组合兼容性仍不确定。由于小鼠视网膜的平均厚度约为 180-220 μm⁹，因此未经透明化处理，在这种厚组织中进行抗体标记和共聚焦成像通常会导致高背景信号，使观察周细胞和血管之间的空间关系变得复杂¹⁰。通过此处描述的方法，我们的目标是提供一种简单的方法，在共聚焦显微镜下以三维 （3D） 视图可视化视网膜脉管系统内的周细胞。这种来自视网膜脉管系统中周细胞的增强细胞信息可以提高我们对视网膜环境稳态的理解，并强调血管保护的潜在策略，从而增强视网膜血管疾病的功能结果。

研究方案

在本研究中，使用了 3 只年轻成年雄性 C57BL/6 小鼠 （8-10 周龄，体重 20-25 g）。它们被安置在 12 小时的光照/黑暗循环中，控制温度和湿度，并允许自由获取食物和水。本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准（批准号：2023-03-14-04），并按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》（美国国家科学院出版社，华盛顿特区，1996 年）进行。

1. 体内眶 后注射荧光番茄凝集素

1. 腹膜内注射 50 mg/kg 戊巴比妥以麻醉小鼠。通过评估对脚趾捏刺激没有反应来评估麻醉深度。
2. 将鼠标放在右侧卧位中，头部朝左。
3. 用两根手指轻轻按压眶周区域，露出小鼠的左眼，以便最轻松地注射到动物的左眶后窦^{中 11}。
4. 使用配备 1G 针头的 27 mL 注射器轻轻刺入小鼠的眼眶静脉窦约 2-3 mm，针头上的斜面以 45° 角向前。
5. 将 0.1 mL （1 mg/mL） 荧光番茄凝集素注射到小鼠的眼眶静脉窦中。

2. 眼睛灌注和眼球剜除术

1. 眼眶后注射后 5 分钟，腹膜内注射三溴乙醇溶液 （250 mg/kg） 以深度麻醉小鼠。随后，通过放血和心脏灌注对动物实施安乐死。呼吸停止后，用手术剪刀打开胸腔¹².
2. 一旦呼吸停止，用手术剪刀打开胸腔。提前对手术器械进行消毒，并在通风橱中作。使用 24G 针头，通过左心室心尖将其插入左心室 2 毫米。以 3 mL/min 的速率灌注加入 20 mL 0.9% 生理盐水，然后在 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （PB，pH 7.4） 中加入 20 mL 4% 甲醛。
3. 将牺牲的鼠标侧放，用剪刀去除覆盖眼睛的皮肤。用剪刀和镊子摘除眼睛。
4. 切开视神经和周围组织，然后取出眼睛并转移到 12 孔板中，在 0.1 M PB 中的 4% 甲醛中后固定 2 小时。
5. 在 4 °C 下，在 0.1 M PB （pH 7.4） 中的 25% 蔗糖中冷冻保护组织，直到其沉到溶液底部。
   注意：由于眼组织在蔗糖溶液中脱水良好，因此视网膜可以更容易和完全地分离，从而促进随后的全面研究。

3. 视网膜解剖

1. 使用塑料巴斯德移液器将眼睛转移到含有 0.1 M PB （pH 7.4） 的培养皿中。
2. 用锋利的剪刀刺穿角膜边缘，剪开角膜和虹膜周围，然后丢弃。
3. 使用镊子去除晶状体和玻璃体液。然后，用细镊子将杯状视网膜从眼睛中心拉开。在干净的培养皿中用 0.1 M PB （pH 7.4） 冲洗视网膜。

4. 视网膜的免疫荧光染色和组织透明化

1. 小心地去除杯状视网膜，并将其在 2% Triton X-100 溶液中加入 0.1 M PB （pH 7.4） 在 4 °C 下孵育过夜。
2. 将视网膜转移到封闭溶液（0.1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0.2%叠氮化钠 + 10%正常驴血清）中，并在摇床上以 72 rpm 的速度在 4 °C 下旋转过夜。
3. 将视网膜转移到微量离心管中含有山羊抗 PDGFR-β （10 μg/mL） 一抗的溶液中，溶于稀释缓冲液（0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100 + 0.2% 叠氮化钠 + 1% 正常驴血清）中，并在摇床上在 4 °C 下旋转 2 天。
4. 在室温下用洗涤缓冲液（0.1 M PB + 0.2% Triton-X 100）洗涤视网膜 2 次，然后将它们在摇床上于 4 °C 的洗涤缓冲液中过夜。
5. 第二天，将视网膜转移到微量离心管中，加入含有 1 mg/mL 驴抗山羊 488 二抗和 0.2 ng/mL 荧光核 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 的混合溶液中，并在振荡器上以 72 rpm 的速度在 4 °C 下旋转 5 小时。
6. 在室温下，在含有洗涤缓冲液的 6 孔板中洗涤视网膜 1 小时，2 次。将视网膜保存在摇床上的洗涤缓冲液中，在 4 °C 下过夜。 按照步骤 5 进行成像和分析，以获得组织清除前的视图。
7. 将视网膜转移到组织透明化试剂中，并在振荡器上以 60 rpm 的速度在 37 °C 下轻轻旋转 1 小时。
8. 组织透明化处理后，在干净的培养皿中用 0.1 M PB （pH 7.4） 冲洗杯状视网膜。
9. 使用弹簧剪刀做 4 个径向切口，达到视网膜半径的大约 2/3，形成花瓣形状。
10. 将视网膜压平并安装在显微镜载玻片上，然后用一小块吸水纸去除任何多余的 PB。保持视网膜内部朝上放在载玻片上。
11. 用垫片圈住已安装的视网膜，并用新鲜的组织清除试剂和盖玻片填充间隙。

5. 成像和分析

1. 在组织透明化治疗之前（完成步骤 4.6 后）和之后获得视网膜的外部视图。
2. 使用全景组织切片扫描仪扫描标记视网膜的蒙太奇视图。使用 NA 为 0.08 的 2 倍物镜。
3. 通过配备以下物镜的共聚焦成像系统拍摄更高放大倍率的图像：NA 为 0.40 的 10 倍镜头和 NA 为 0.95 的 40 倍镜头。将共聚焦针孔设置为 152 μm（10 倍物镜）和 105 μm（40 倍物镜）。将图像捕获的空间分辨率设置为 1024 x 1024 像素（10 倍物镜）和 640 x 640 像素（40 倍物镜）。
4. 从标记的视网膜中捕获 50 张 2 μm 帧的图像（Z 堆栈）。在投影/地形模式下将所有图像集成到单个聚焦中。对于设置，请单击 设置起始焦平面 > 设置结束焦平面 > 设置步长 > 选择深度图案 > Z 系列的图像>捕捉。
5. 针对不同的荧光信号使用以下激发和发射波长捕获图像：499 nm 和 519 nm 处的绿色荧光信号;591 nm 和 618 nm 处的红色荧光信号;以及 401 nm 和 421 nm 处的蓝色荧光信号。
6. 通过将 Z 堆栈共聚焦图像导入分析软件，方法是选择“ 添加新表面”>选择“体积”设置>选择“源通道”>“调整显示”>“调整表面角度>快照”，从而在三维图案中重建图像。

结果

从整体视网膜的外观来看，与没有组织透明化的视网膜相比，使用组织透明化治疗的全身视网膜的组织透明度增加（图 1）。

对于全支架视网膜的组织学检查，通过眼眶后注射用荧光番茄凝集素将视网膜脉管系统标记为红色，视网膜周细胞用 PDGFR-β 显示为绿色（图 2、 图 3 和

讨论

在这项研究中，我们详细介绍了使用眶后注射荧光番茄凝集素、使用 PDGFR-β 进行免疫荧光检查和溶剂型组织透明化来证明视网膜脉管系统中周细胞形态的技术过程。结果表明，这些技术与突出整个视网膜中的周细胞高度兼容。这些方法的结合提供了一种从详细的 3D 视角可视化视网膜脉管系统中周细胞的形态学特征的有效方法。

其中一项关键技术，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protect from light
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Research and Development	AF1042	25 µg
Imaris software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Panoramic tissue slice scanner	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Six-well plate	Costar	3335
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus microscope slide	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm