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眼眶后注射荧光番茄凝集素后,用血小板衍生生长因子受体β免疫荧光染色检查视网膜脉管系统中的周细胞。标记的视网膜进一步用组织透明化方法处理并安装整个,以便在共聚焦显微镜下可视化视网膜脉管系统周围周细胞的三维视图。
视网膜周细胞对于视网膜的血管发育和稳定性至关重要,在维持视网膜脉管系统的完整性方面起着关键作用。为了提供周细胞形态学特征的详细视图,本研究描述了一种结合荧光剂眼眶后注射、免疫荧光染色和组织透明化处理的新方法。首先,将荧光番茄凝集素注射到活小鼠的眶后窦中,以标记视网膜脉管系统。5 分钟后,处死小鼠,小心地从视网膜杯中取出其完整的视网膜,并用血小板衍生的生长因子受体β进行免疫荧光染色以显示周细胞。此外,用组织透明化试剂处理染色的视网膜,并将其整个安装在显微镜载玻片上。通过这些方法,在透明视网膜中清楚地观察到视网膜脉管系统和周细胞。在共聚焦显微镜下,我们获得了更多拍摄高分辨率图像的机会,以便在三维视图中进一步重建和分析沿视网膜血管树的周细胞的形态特征。在方法上,该协议提供了一种有效的方法来可视化视网膜脉管系统内的周细胞,为它们在生理和病理条件下的作用提供了有价值的见解。
视网膜周细胞沿着血管内皮细胞的腔侧嵌入基底膜内,显示出包裹在视网膜血管周围的短程突起的网状图案1。周细胞和视网膜脉管系统之间的这种亲密接触有助于维持视网膜环境稳态2。尽管许多研究提供了视网膜脉管系统中周细胞的形态学证据,但我们对视网膜周细胞形态特征的大部分理解来自常规的组织学技术3。
根据这些研究,我们设计了这项研究,通过将传统的组织学技术与现代前沿科学方法相结合,有效地展示了视网膜微血管系统中周细胞的更多形态学细节。该方法整合了三种关键技术:在活小鼠中眶后注射荧光番茄凝集素、血小板衍生生长因子受体β免疫荧光染色 (PDGFR-β) 和基于溶剂的组织透明化策略。荧光番茄凝集素的眶后注射已被证明在体内和体外环境中观察小鼠视网膜脉管系统有效且可靠 4,5。PDGFR-β 可作为周细胞免疫荧光染色的常用生物标志物6.为了捕获较厚和完整视网膜内周细胞的高分辨率图像,组织透明化策略提高了组织学透明度 2,7,8。
虽然这些技术中的每一种都已单独应用于视网膜研究,但它们在研究小鼠视网膜脉管系统中周细胞的组合兼容性仍不确定。由于小鼠视网膜的平均厚度约为 180-220 μm9,因此未经透明化处理,在这种厚组织中进行抗体标记和共聚焦成像通常会导致高背景信号,使观察周细胞和血管之间的空间关系变得复杂10。通过此处描述的方法,我们的目标是提供一种简单的方法,在共聚焦显微镜下以三维 (3D) 视图可视化视网膜脉管系统内的周细胞。这种来自视网膜脉管系统中周细胞的增强细胞信息可以提高我们对视网膜环境稳态的理解,并强调血管保护的潜在策略,从而增强视网膜血管疾病的功能结果。
在本研究中,使用了 3 只年轻成年雄性 C57BL/6 小鼠 (8-10 周龄,体重 20-25 g)。它们被安置在 12 小时的光照/黑暗循环中,控制温度和湿度,并允许自由获取食物和水。本研究经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准(批准号:2023-03-14-04),并按照《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》(美国国家科学院出版社,华盛顿特区,1996 年)进行。
1. 体内眶 后注射荧光番茄凝集素
2. 眼睛灌注和眼球剜除术
3. 视网膜解剖
4. 视网膜的免疫荧光染色和组织透明化
5. 成像和分析
从整体视网膜的外观来看,与没有组织透明化的视网膜相比,使用组织透明化治疗的全身视网膜的组织透明度增加(图 1)。
对于全支架视网膜的组织学检查,通过眼眶后注射用荧光番茄凝集素将视网膜脉管系统标记为红色,视网膜周细胞用 PDGFR-β 显示为绿色(图 2、 图 3 和
在这项研究中,我们详细介绍了使用眶后注射荧光番茄凝集素、使用 PDGFR-β 进行免疫荧光检查和溶剂型组织透明化来证明视网膜脉管系统中周细胞形态的技术过程。结果表明,这些技术与突出整个视网膜中的周细胞高度兼容。这些方法的结合提供了一种从详细的 3D 视角可视化视网膜脉管系统中周细胞的形态学特征的有效方法。
其中一项关键技术,?...
无利益冲突。
本研究得到了北京市自然科学基金(No. 7244480)、CACMS 创新基金(No.CI2021A03407)、国家自然科学基金(编号 82004492)和中央公益性研究机构基本科研业务费(编号 ZZ-YQ2023008、ZZ14-YQ-032、ZZ-JQ2023008、ZZ-YC2023007)。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | Protect from light |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | Protect from light |
C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | SCXK (Jing) 2021-0006 | |
Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
Goat anti-PDGFR-β | Research and Development | AF1042 | 25 µg |
Imaris software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594 | Thermo Fisher Scientific | L32471 | 1 mg |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 10 mL |
Panoramic tissue slice scanner | Olympus | VS120-S6-W | |
Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | |
RapiClear 1.52 Solution | SunJin Lab | RC152001 | 10 mL |
Six-well plate | Costar | 3335 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Superfrost Plus microscope slide | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | 25 mm x 75 mm x 1 mm |
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