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Method Article
* Questi autori hanno contribuito in egual misura
I periciti nel sistema vascolare retinico sono stati esaminati mediante colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine dopo iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro. La retina marcata è stata ulteriormente trattata con il metodo di pulizia dei tessuti e montata per visualizzare le viste tridimensionali dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico sotto un microscopio confocale.
I periciti retinici sono essenziali per lo sviluppo vascolare e la stabilità della retina, svolgendo un ruolo chiave nel mantenimento dell'integrità del sistema vascolare retinico. Per fornire una visione dettagliata delle caratteristiche morfologiche dei periciti, questo studio ha descritto un nuovo approccio che combina l'iniezione retro-orbitale di un agente fluorescente, la colorazione immunofluorescente e il trattamento di pulizia dei tessuti. In primo luogo, la lectina fluorescente di pomodoro è stata iniettata nel seno retro-orbitale del topo vivo per marcare la vascolarizzazione retinica. Dopo 5 minuti, il topo è stato sacrificato e la sua retina intatta è stata accuratamente rimossa dalla coppa retinica e colorata in immunofluorescenza con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine per rivelare i periciti. Inoltre, la retina colorata è stata trattata con un reagente per la pulizia dei tessuti e l'intero è stato montato sul vetrino del microscopio. Attraverso questi approcci, la vascolarizzazione retinica e i periciti sono stati chiaramente osservati nella retina trasparente. Sotto un microscopio confocale, abbiamo ottenuto maggiori opportunità di acquisire immagini ad alta risoluzione per ricostruire e analizzare ulteriormente le caratteristiche morfologiche dei periciti lungo l'albero vascolare retinico in una vista tridimensionale. Metodologicamente, questo protocollo offre un approccio efficace per la visualizzazione dei periciti all'interno del sistema vascolare retinico, fornendo preziose informazioni sul loro ruolo sia in condizioni fisiologiche che patologiche.
I periciti retinici sono incorporati all'interno della membrana basale lungo il lato abluminale delle cellule endoteliali vascolari, mostrando un modello a rete di processi a corto raggio avvolti attorno ai vasi sanguigni retinici1. Questo intimo contatto tra i periciti e il sistema vascolare retinico contribuisce a mantenere l'omeostasi ambientale della retina2. Sebbene numerosi studi abbiano fornito prove morfologiche della presenza di periciti nel sistema vascolare retinico, la maggior parte della nostra comprensione delle caratteristiche morfologiche dei periciti retinici proviene da tecniche istologiche convenzionali3.
In linea con questi studi, abbiamo progettato questo studio per mostrare efficacemente più dettagli morfologici dei periciti nella microvascolarizzazione retinica combinando le tecniche istologiche tradizionali con i moderni metodi scientifici all'avanguardia. L'approccio qui integra tre tecniche chiave: iniezione retro-orbitale di lectina di pomodoro fluorescente in topi vivi, colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR-β) e la strategia di pulizia dei tessuti a base di solvente. L'iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro si è dimostrata efficace e affidabile per l'osservazione della vascolarizzazione retinica di topo sia in vivo che in vitro 4,5. Il PDGFR-β funge da biomarcatore comunemente usato per la colorazione immunofluorescente dei periciti6. Per acquisire immagini ad alta risoluzione dei periciti all'interno delle retine più spesse e a montatura intera, la strategia di pulizia dei tessuti migliora la trasparenza istologica 2,7,8.
Sebbene ciascuna di queste tecniche sia stata applicata individualmente negli studi sulla retina, la loro compatibilità combinata per lo studio dei periciti nel sistema vascolare retinico del topo rimane incerta. Poiché lo spessore medio della retina del topo è di circa 180-220 μm9, la marcatura degli anticorpi e l'imaging confocale in questo tessuto spesso senza trattamento di eliminazione spesso provocano segnali di fondo elevati, complicando l'osservazione della relazione spaziale tra periciti e vasi sanguigni10. Attraverso gli approcci qui descritti, miriamo a fornire un metodo semplice per visualizzare i periciti all'interno del sistema vascolare retinico in una vista tridimensionale (3D) al microscopio confocale. Questa maggiore informazione cellulare proveniente dai periciti nel sistema vascolare retinico potrebbe migliorare la nostra comprensione dell'omeostasi ambientale retinica e sottolineare le potenziali strategie per la protezione vascolare, migliorando così i risultati funzionali nei disturbi vascolari retinici.
Per questo studio, sono stati utilizzati tre giovani topi maschi adulti C57BL/6 (8-10 settimane, del peso di 20-25 g). Sono stati alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 ore con temperatura e umidità controllate e hanno avuto libero accesso al cibo e all'acqua. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, China Academy of Chinese Medical Sciences (approvazione n. 2023-03-14-04) e condotto in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).
1. Iniezione retro-orbitale in vivo di lectina fluorescente di pomodoro
2. Perfusione ed enucleazione degli occhi
3. Dissezione delle retine
4. Colorazione immunofluorescente e pulizia tissutale della retina
5. Imaging e analisi
Dalle viste esterne della retina a montaggio intero, la trasparenza tissutale della retina a montaggio intero è stata aumentata utilizzando il trattamento di pulizia dei tessuti rispetto a quella della retina senza pulizia dei tessuti (Figura 1).
Per l'esame istologico sulla retina a montatura intera, il sistema vascolare retinico è stato marcato in rosso con lectina fluorescente di pomodoro attraverso l'iniezione retro-orbitale...
In questo studio, abbiamo dettagliato il processo tecnico per dimostrare la morfologia dei periciti nel sistema vascolare retinico utilizzando l'iniezione retro-orbitale di lectina di pomodoro fluorescente, l'esame immunofluorescente con PDGFR-β e la pulizia dei tessuti a base di solvente. I risultati mostrano che queste tecniche sono altamente compatibili per evidenziare i periciti nella retina a montatura intera. La combinazione di queste metodologie offre un approccio efficace per vi...
Nessun conflitto di interessi.
Questo studio è stato sostenuto dalla Beijing Natural Science Foundation (n. 7244480), dal CACMS Innovation Fund (n. CI2021A03407), la National Natural Science Foundation of China (n. 82004492) e i fondi di ricerca di base per gli istituti centrali di ricerca sul benessere pubblico (n. ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | Protect from light |
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | Protect from light |
C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | SCXK (Jing) 2021-0006 | |
Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
Goat anti-PDGFR-β | Research and Development | AF1042 | 25 µg |
Imaris software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594 | Thermo Fisher Scientific | L32471 | 1 mg |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 10 mL |
Panoramic tissue slice scanner | Olympus | VS120-S6-W | |
Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | |
RapiClear 1.52 Solution | SunJin Lab | RC152001 | 10 mL |
Six-well plate | Costar | 3335 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Superfrost Plus microscope slide | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | 25 mm x 75 mm x 1 mm |
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