Visualização 3D de pericitos vasculares da retina em camundongos por imunocoloração

Resumo

Os pericitos na vasculatura retiniana foram examinados por coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β após injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate. A retina marcada foi posteriormente tratada com o método de limpeza de tecido e toda montada para visualizar as vistas tridimensionais dos pericitos ao redor da vasculatura retiniana sob um microscópio confocal.

Resumo

Os pericitos retinianos são essenciais para o desenvolvimento vascular e estabilidade da retina, desempenhando um papel fundamental na manutenção da integridade da vasculatura retiniana. Para fornecer uma visão detalhada das características morfológicas dos pericitos, este estudo descreveu uma nova abordagem que combina a injeção retro-orbital de um agente fluorescente, coloração imunofluorescente e tratamento de limpeza de tecidos. Em primeiro lugar, a lectina fluorescente do tomate foi injetada no seio retro-orbital do camundongo vivo para marcar a vasculatura da retina. Após 5 minutos, o camundongo foi sacrificado e sua retina intacta foi cuidadosamente removida do copo da retina e corada por imunofluorescência com β do receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas para revelar os pericitos. Além disso, a retina corada foi tratada com reagente de limpeza de tecido e toda montada na lâmina do microscópio. Por meio dessas abordagens, a vasculatura retiniana e os pericitos foram claramente observados na retina transparente. Sob um microscópio confocal, obtivemos mais oportunidades de obter imagens de alta resolução para posterior reconstrução e análise das características morfológicas dos pericitos ao longo da árvore vascular da retina em uma visão tridimensional. Metodologicamente, este protocolo oferece uma abordagem eficaz para visualizar pericitos dentro da vasculatura da retina, fornecendo informações valiosas sobre seu papel em condições fisiológicas e patológicas.

Introdução

Os pericitos da retina estão embutidos na membrana basal ao longo do lado abluminal das células endoteliais vasculares, exibindo um padrão semelhante a uma malha de processos de curto alcance enrolados nos vasos sanguíneos da retina¹. Esse contato íntimo entre os pericitos e a vasculatura retiniana contribui para a manutenção da homeostase ambiental da retina². Embora numerosos estudos tenham fornecido evidências morfológicas de pericitos na vasculatura retiniana, a maior parte de nossa compreensão das características morfológicas dos pericitos retinianos vem de técnicas histológicas convencionais³.

De acordo com esses estudos, projetamos este estudo para mostrar efetivamente mais detalhes morfológicos de pericitos na microvasculatura da retina, combinando técnicas histológicas tradicionais com métodos científicos modernos de ponta. A abordagem aqui integra três técnicas principais: injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate em camundongos vivos, coloração imunofluorescente com receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas β (PDGFR-β) e a estratégia de limpeza de tecido à base de solvente. A injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate tem se mostrado eficaz e confiável para observar a vasculatura da retina de camundongos em ambientes in vivo e in vitro ^4,5. O PDGFR-β serve como um biomarcador comumente usado para a coloração imunofluorescente de pericitos⁶. Para capturar imagens de alta resolução de pericitos dentro das retinas mais espessas e de montagem total, a estratégia de limpeza do tecido aumenta a transparência histológica ^2,7,8.

Embora cada uma dessas técnicas tenha sido aplicada individualmente em estudos de retina, sua compatibilidade combinada para investigar pericitos na vasculatura retiniana de camundongos permanece incerta. Como a espessura média da retina do camundongo é de aproximadamente 180-220 μm⁹, a marcação de anticorpos e a imagem confocal nesse tecido espesso sem tratamento de limpeza geralmente resultam em altos sinais de fundo, complicando a observação da relação espacial entre pericitos e vasos sanguíneos¹⁰. Por meio das abordagens descritas aqui, pretendemos fornecer um método direto para visualizar pericitos dentro da vasculatura retiniana em uma visão tridimensional (3D) sob um microscópio confocal. Essa informação celular aprimorada dos pericitos na vasculatura retiniana pode melhorar nossa compreensão da homeostase ambiental da retina e ressaltar estratégias potenciais para proteção vascular, melhorando assim os resultados funcionais em distúrbios vasculares da retina.

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Protocolo

Para este estudo, foram utilizados três camundongos C57BL/6 machos adultos jovens (8-10 semanas de idade, pesando 20-25 g). Eles foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 h com temperatura e umidade controladas e permitiram livre acesso a alimentos e água. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxabustão, Academia Chinesa de Ciências Médicas Chinesas (aprovação nº 2023-03-14-04) e conduzido de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, DC, 1996).

1. Injeção retro-orbital in vivo de lectina fluorescente de tomate

1. Injete 50 mg / kg de pentobarbital por via intraperitoneal para anestesiar o camundongo. Avalie a profundidade da anestesia avaliando a ausência de resposta a um estímulo de pinça do dedo do pé.
2. Coloque o mouse em decúbito lateral direito com a cabeça voltada para a esquerda.
3. Pressione dois dedos suavemente na área periorbital para expor o olho esquerdo do camundongo para permitir a administração mais fácil da injeção no seio retroorbital esquerdo do animal¹¹.
4. Use uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha 27G para perfurar suavemente cerca de 2-3 mm no seio venoso orbital do camundongo com o chanfro da agulha voltado para a frente em um ângulo de 45°.
5. Injete 0,1 mL (1 mg / mL) de lectina fluorescente de tomate no seio venoso orbital do camundongo.

2. Perfusão e enucleação dos olhos

1. Aos 5 minutos após a injeção retroorbital, injete solução de tribromoetanol (250 mg / kg) por via intraperitoneal para anestesiar profundamente o camundongo. Posteriormente, eutanasiar o animal por meio de exsanguinação e perfusão cardíaca. Quando a respiração parar, abra a cavidade torácica com uma tesoura cirúrgica¹².
2. Quando a respiração parar, abra a cavidade torácica com uma tesoura cirúrgica. Esterilize os instrumentos cirúrgicos com antecedência e opere em uma capela de exaustão. Use uma agulha 24G e insira-a 2 mm no ventrículo cardíaco esquerdo através do ápice do ventrículo esquerdo. Realize perfusão a uma taxa de 3 mL / min com 20 mL de solução salina fisiológica a 0,9% seguida de 20 mL de formaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).
3. Coloque o rato sacrificado de lado e remova a pele que cobre os olhos com uma tesoura. Enuclee os olhos com tesoura e fórceps.
4. Corte o nervo óptico e os tecidos circundantes, retire o olho e transfira para uma placa de 12 poços para pós-fixação em formaldeído a 4% em 0,1 M PB por 2 h.
5. Crioproteja o tecido em sacarose a 25% em 0,1 M PB (pH 7,4) a 4 ° C até que ele afunde no fundo da solução.
   NOTA: Como o tecido ocular desidrata bem em uma solução de sacarose, a retina pode ser mais fácil e completamente descolada, facilitando estudos abrangentes subsequentes.

3. Dissecção de retinas

1. Transfira os olhos para uma placa de Petri contendo 0,1 M PB (pH 7,4) usando uma pipeta de plástico Pasteur.
2. Fure a borda da córnea com uma tesoura afiada, corte ao redor da córnea e da íris e descarte.
3. Use uma pinça para remover a lente e o humor vítreo. Em seguida, puxe a retina em forma de taça para longe do centro do olho com uma pinça fina. Enxágue a retina com 0,1 M PB (pH 7,4) em uma placa de Petri limpa.

4. Coloração imunofluorescente e limpeza de tecidos de retinas

1. Remova cuidadosamente a retina em forma de copo e incube-a em uma solução Triton X-100 a 2% em 0,1 M PB (pH 7,4) durante a noite a 4 ° C.
2. Transfira a retina para a solução de bloqueio (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% de azida sódica + 10% de soro de burro normal) e gire a 72 rpm no agitador durante a noite a 4 ° C.
3. Transferir a retina para a solução que contém os anticorpos primários de cabra anti-PDGFR-β (10 μg/ml) em tampão de diluição (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100 + 0,2% azida sódica + 1% de soro de burro normal) num tubo de microcentrífuga e rodar no agitador durante 2 dias a 4 °C.
4. Lave a retina 2x com tampão de lavagem (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) à temperatura ambiente e, em seguida, mantenha-os em tampão de lavagem durante a noite a 4 °C no shaker.
5. No dia seguinte, transfira a retina para a solução mista contendo o anticorpo secundário 1 mg / mL de anticorpo anti-cabra 488 de burro e 0,2 ng / mL de 4',6-diamidino-2-fenilindol nuclear (DAPI) em um tubo de microcentrífuga e gire a 72 rpm no agitador por 5 h a 4 ° C.
6. Lave a retina em uma placa de 6 poços com tampão de lavagem por 1 h, 2x, em temperatura ambiente. Mantenha a retina em tampão de lavagem no agitador durante a noite a 4 °C. Realize imagens e análises de acordo com a etapa 5 para obter as visualizações antes da limpeza do tecido.
7. Transferir a retina para o reagente de limpeza dos tecidos e rodá-la suavemente a 60 rpm no agitador durante 1 h a 37 °C.
8. Após o tratamento de limpeza do tecido, enxágue a retina em forma de xícara com 0,1 M PB (pH 7,4) em uma placa de Petri limpa.
9. Faça 4 incisões radiais atingindo aproximadamente 2/3 do raio da retina usando uma tesoura de mola para criar uma forma de pétala.
10. Alise e monte a retina em uma lâmina de microscópio e, em seguida, remova qualquer excesso de PB com um pequeno pedaço de papel absorvente. Mantenha o interior da retina voltado para cima na lâmina.
11. Circule a retina montada com um espaçador e preencha a lacuna com um reagente de limpeza de tecido fresco e uma lamínula.

5. Imagiologia e análises

1. Obtenha as vistas externas da retina antes (após concluir a etapa 4.6) e após o tratamento de limpeza de tecidos.
2. Digitalize as visualizações de montagem da retina marcada com o scanner panorâmico de fatias de tecido. Use uma lente objetiva 2x com NA de 0,08.
3. Tire as imagens de maior ampliação pelo sistema de imagem confocal equipado com as seguintes lentes objetivas: lente 10x com NA de 0,40 e lente 40x com NA de 0,95. Defina o orifício confocal em 152 μm (lente objetiva de 10x) e 105 μm (lente objetiva de 40x). Defina a resolução espacial da captura de imagem em 1024 x 1024 pixels (lente objetiva de 10x) e 640 x 640 pixels (lente objetiva de 40x).
4. Capture 50 imagens (pilha Z) em quadros de 2 μm da retina marcada. Integre todas as imagens em um único foco no modo de projeção/topografia. Para a configuração, clique em Definir plano focal inicial > Definir plano focal final > Definir tamanho do passo > Escolher padrão de profundidade > Captura de imagem > série Z.
5. Capture imagens usando os seguintes comprimentos de onda de excitação e emissão para diferentes sinais de fluorescência: Sinais de fluorescência verde em 499 nm e 519 nm; sinais de fluorescência vermelha a 591 nm e 618 nm; e sinais de fluorescência azul em 401 nm e 421 nm.
6. Reconstrua as imagens no padrão tridimensional importando imagens confocais de pilha Z para um software de análise selecionando Adicionar novas superfícies > Escolher configurações de volume > Escolher canal de origem > Ajustar exibição > Ajustar ângulo de superfície > Instantâneo.

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Resultados

Das vistas externas da retina de montagem total, a transparência do tecido da retina de montagem total foi aumentada usando o tratamento de limpeza de tecido em comparação com a da retina sem limpeza de tecido (Figura 1).

Para o exame histológico da retina de montagem total, a vasculatura retiniana foi marcada em vermelho com lectina fluorescente de tomate por meio da injeção retro-orbital, e os pericitos retinianos são mos...

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Discussão

Neste estudo, detalhamos o processo técnico para demonstrar a morfologia dos pericitos na vasculatura retiniana usando injeção retro-orbital de lectina fluorescente de tomate, exame de imunofluorescência com PDGFR-β e limpeza tecidual à base de solvente. Os resultados mostram que essas técnicas são altamente compatíveis para destacar pericitos na retina de montagem total. A combinação dessas metodologias oferece uma abordagem eficaz para visualizar as características morfoló...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D3571	Protect from light
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific	A-11055	Protect from light
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.	SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Goat anti-PDGFR-β	Research and Development	AF1042	25 µg
Imaris software	Oxford Instruments	v.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomato) lectin, DyLight594	Thermo Fisher Scientific	L32471	1 mg
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	10 mL
Panoramic tissue slice scanner	Olympus	VS120-S6-W
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6
RapiClear 1.52 Solution	SunJin Lab	RC152001	10 mL
Six-well plate	Costar	3335
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Superfrost Plus microscope slide	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	25 mm x 75 mm x 1 mm