التفكك عالي الإنتاجية وزرع تقويم العظام للطعوم الغريبة المشتقة من مرضى سرطان الثدي

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة وغير جراحية لزرع تقويم العظام للطعوم الغريبة المشتقة من مرضى سرطان الثدي في الفئران. تتضمن هذه التقنية تفكك الورم الأنزيمي متبوعا بالحقن المباشر في ضمادات الدهون الثديية ، مما يتيح الزرع عالي الإنتاجية. يضمن التحقق الشامل دقة النموذج ، مما يسهل الدراسات الصارمة عبر الأنواع الفرعية المختلفة لسرطان الثدي.

Abstract

توفر الطعوم الغريبة المشتقة من المريض (PDXs) طريقة ذات صلة سريريا لتلخيص أنواع الخلايا المتورطة في الورم والبيئة المكروية للورم ، وهو أمر ضروري لتعزيز المعرفة بسرطان الثدي (BC). بالإضافة إلى ذلك ، تتيح نماذج PDX دراسة التأثيرات الجهازية BC ، وهو أمر غير ممكن باستخدام النماذج المختبرية. عادة ما تتضمن الطرق التقليدية لزرع الطعوم الغريبة BC التخدير والإجراءات الجراحية المعقمة ، والتي تستغرق وقتا طويلا والغازية وتحد من قابلية توسع نماذج PDX في أبحاث BC. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وقابلة للتطوير لزرع تقويم العظام ل BC PDXs في الفئران. تم استخدام سلالة الفأر التي تعاني من نقص المناعة NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl / SzJ (NSG) لنقش PDX. تم فصل عينات BC البشرية التي تم الحصول عليها من المرضى الموافقين على IRB ميكانيكيا وإنزيميا ، ثم أعيد تعليقها في محلول من مستخلص الغشاء القاعدي (BME) و RPMI 1640. تم تقييد عن طريق التجريف ، وتم وضع كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر من ضمادات الدهون في الحلمة الأربية الرابعة ، متبوعا بالحقن. تم حقن ما يقرب من 2 مليون خلية في معلق 100 ميكرولتر بشكل ثنائي في ضمادات الدهون الثديية باستخدام إبرة 26 جرام. والجدير بالذكر أنه لم تكن هناك حاجة إلى مخدر ، وكان إجمالي وقت الإجراء أقل من 5 دقائق ، من تحضير الخلية إلى الحقن. بعد فترة نمو استمرت عدة أشهر ، تم استئصال الأورام ومعالجتها للمصادقة. تضمن التحقق تقييم حالة المستقبلات باستخدام الكيمياء المناعية مع الأجسام المضادة المحددة لمستقبلات BC التقليدية (على سبيل المثال ، ER ، PR ، HER2). تم تأكيد مورفولوجيا الورم من خلال تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) ، والذي تم تفسيره من قبل أخصائي علم الأمراض. تم التحقق من التشابه الجيني لعينة المريض من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي السائب وتحليل التكرار الترادفي القصير (STR). يدعم هذا النهج في نقش PDX والتحقق من صحته التطوير الصارم للنماذج وزرع الورم عالي الإنتاجية ، مما يتيح إجراء دراسات جيدة الطاقة عبر مختلف الأنواع الفرعية BC.

Introduction

يتم تشخيص سرطان الثدي (BC) في أكثر من 2 مليون امرأة في جميع أنحاء العالم كل^{عام 1}. من أجل تعزيز الفهم البيولوجي الأساسي لكولومبيا البريطانية وترجمة العلاجات الجديدة بنجاح إلى العلاجات المعتمدة ، من الضروري وجود نماذج حيوانية قبل سريرية تحتفظ بالسمات المميزة لأورام المريض. ثبت أن الطعوم الغريبة المشتقة من المريض (PDXs) تلخص عدم تجانس الورم بدقة عالية عند زرعها تقويم العظام ، بما في ذلك علم الأنسجة المرضية ، وتعبير المستقبلات ، والانحرافات الجينية^2،3،4. الأهم من ذلك ، أنها تحتفظ أيضا بالخلايا اللحمية التي تساهم في البيئة الدقيقة للورم ، مثل الأوعية الدموية والخلايا المناعية والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. على الرغم من أنه يتم استبدالها تدريجيا بخلايا لحمية مضيفة الفئران مع مرور⁵. تتيح PDXs أيضا دراسة المضاعفات الجهازية الناتجة عن نمو الورم ، مثل التعب^6،7 ، وهو أمر غير ممكن حاليا باستخدام النماذج المختبرية .

ومع ذلك ، فإن نقش BC PDX الناجح يتطلب سلالة فأر تعاني من نقص المناعة ، مع السلالة الأكثر استخداما هي NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl / SzJ). فئران NSG خالية من المناعة التكيفية وتظهر مناعة فطرية معيبة^{للغاية 8}. تم تحقيق نقش BC PDX في سلالات أخرى تعاني من نقص المناعة ، مثل SCID / Beige (CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J / Crl) ، مع معدلات نقش مماثلة⁴.

تتضمن الطرق التقليدية لزرع BC PDXs زرع جزء من الورم جراحيا في وسادة دهون الثدي⁹ ، ويؤدي هذا النهج إلى النقش الناجح بمعدلات مواتية. ومع ذلك ، فإن الحاجة إلى الإجراءات الجراحية المعقمة واستخدام التخدير تجعلها تستغرق وقتا طويلا ، وبالتالي تحد من عدد الفئران التي يمكن زرعها في نافذة زمنية معينة. بالنظر إلى الفوائد التنبؤية المحتملة ل PDXs للاستجابات الدوائية في الأورام واستخدامها في الطب^{الدقيق 10} ، فإن وجود سير عمل بسيط وقابل للتكرار لزرع PDXs بشكل متجانس عبر الفئران أمر حيوي. توضح هذه المقالة تفكك أورام الثدي البشرية في معلق خلية واحدة والحقن التقويمي اللاحق في ضمادات الدهون الثديية للفئران التي تعاني من نقص المناعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

يلتزم هذا البروتوكول بالمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة وست فيرجينيا (WVU). تم استخدام إناث الفئران NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl / SzJ (NSG) ، التي تبلغ أعمارها 8 أسابيع أو أكثر وتزن حوالي 25 جراما ، لحقن الخلايا السرطانية. تم شراء أنسجة ورم سرطان الثدي في معهد السرطان بجامعة ويست فيرجينيا (مورغانتاون ، فيرجينيا الغربية) ومن قبل شبكة الأنسجة البشرية التعاونية NCI بموجب بروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية المعتمد من WVU ولجنة مراجعة ومراقبة بروتوكول معهد WVU للسرطان. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى. تم إجراء جميع الإجراءات في ظل ظروف معقمة داخل خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، باتباع بروتوكولات معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE). يتم توفير تفاصيل والكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. التفكك الأنزيمي عالي الإنتاجية لأنسجة الورم

1. قم بإذابة ودمج الإنزيمات H و R و A من مجموعة تفكك الورم البشري في أنبوب C معقم. أضف 200 ميكرولتر من إنزيم H ، و 100 ميكرولتر من إنزيم R ، و 25 ميكرولتر من الإنزيم A. ارفع الحجم النهائي إلى ~ 5 مل عن طريق إضافة 4.7 مل من وسط RPMI 1640 المعقم إلى الأنبوب C.
   ملاحظة: يمكن استخدام Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) بدلا من RPMI 1640.
2. يمكن قطع شظايا الورم وتجميدها كما هو موضح في البروتوكولات الحالية⁹. انقل شظايا الورم المذابة ووسط التجميد المصاحب لها إلى نصف طبق استزراع معقم مقاس 100 مم. باستخدام ملقط معقم ، انقل شظايا الورم إلى أنبوب دقيق معقم سعة 5 مل.
   ملاحظة: يمكن استخدام إبرة معقمة تحت الجلد كبديل للملقط. يمكن استخدام طبق 35 مم بدلا من أنبوب صغير سعة 5 مل.
3. اغسل شظايا الورم ب 1-3 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ، 1x). قم بمعالجة الشظايا الموجودة في المحلول باستخدام الملقط لضمان الإزالة الشاملة لوسط التجميد المتبقي.
4. انقل الأجزاء المغسولة إلى أنبوب دقيق سعة 2 مل باستخدام ملقط. ضع 1 مل من محلول المضادات الحيوية الثلاثية (TAB) على شظايا الورم واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا رغبت في ذلك. يمكن صنع مخزون 10x TAB عن طريق إذابة 1٪ جنتاميسين ، و 1٪ كليندامايسين ، و 0.5٪ كبريتات بوليميكسين ب في 1x PBS معقم. خفف إلى محلول 1x TAB في 1x PBS معقم.
5. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأجزاء المطهرة إلى أنبوب دقيق جديد سعة 5 مل. قم بإجراء غسل ثان باستخدام 1-3 مل من PBS المعقم. انقل الأجزاء المغسولة إلى النصف الجاف من طبق الثقافة 100 مم من الخطوة 1.2.
6. باستخدام شفرتين معقمتين من المشرط رقم 10 ، قم بفرم أنسجة الورم جيدا. انقل شظايا الورم المفرومة إلى شفرة واحدة وقم بإيداعها في الأنبوب C الذي يحتوي على محلول الإنزيم المحضر. اربط غطاء الأنبوب بإحكام حتى تشعر بنقرة نهائية.
7. اقلب الأنبوب C عدة مرات لضمان التوزيع المتساوي لشظايا الورم داخل محلول الإنزيم.
8. ضع الأنبوب C في جهاز الفصل الميكانيكي. اقلب الأنبوب وتأكد من غمر جميع المحتويات في الوسط. سيكون الأنبوب في وضع مقلوب في الجهاز.
   1. قم بتأمين الأنبوب في فتحة بحيث يكون الجزء ذو المسافة البادئة مواجها للمشغل. إذا كان ذلك ممكنا ، ضع السخان حول الأنبوب.
9. حدد برنامج 37C_h_TDK_3 من واجهة شاشة اللمس. يعمل هذا البرنامج لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بالنسبة للأورام اللينة ، يمكن استخدام 37C_h_TDK_1 أو 2.
   ملاحظة: للحصول على أكبر قدر من الكفاءة ، يوصى بإعداد الفئران للحقن خلال فترة التفكك هذه عن طريق وضع كريم مزيل الشعر على مواقع الحقن.
10. عند الانتهاء من برنامج التفكك ، افحص محتويات الأنبوب. يجب ألا تبقى شظايا الورم المرئية.
    ملاحظة: في حالة وجود شظايا ، قد تكون هناك حاجة إلى وقت إضافي للتفكك. في مثل هذه الحالات ، قم بتشغيل البرنامج لمدة 20-30 دقيقة إضافية.
11. بمجرد تحقيق التفكك الكافي ، قم بالطرد المركزي للأنبوب C عند 200 × جم لمدة 5-8 دقائق عند 4 درجات مئوية لبيليه الخلايا المنفصلة. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام الشفط الفراغي أو الماصة.
12. أعد تعليق حبيبات الخلية في 5-10 مل من وسط RPMI الطازج. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل لتسهيل التلاعب. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5-8 دقائق عند 4 درجات مئوية. شفط بعناية الطافف.
    ملاحظة: قد يتم حذف هذه الخطوة إذا كانت حبيبات الخلية صغيرة. في مثل هذه الحالات ، يتم تعليق الخلايا مباشرة في الحجم المطلوب من الوسائط ثم دمجها مع مستخلص الغشاء القاعدي (Matrigel) لتقليل فقدان الخلايا.
13. أعد تعليق حبيبات الخلية بحجم RPMI 1640 ، أي ما يعادل نصف حجم الحقن النهائي المطلوب. سيتم دمج RPMI 1640 و Matrigel بنسبة 1: 1 v / v ، مع حجم حقن نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل موقع حقن.
    ملاحظة: بالنسبة للحقن الثنائي في 4 فئران ، يبلغ الحجم الإجمالي المطلوب 800 ميكرولتر. لذلك ، أعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر على الأقل من RPMI 1640. لحساب خسارة الحجم المحتملة ، ينصح بإضافة 20٪ إضافية إلى الحجم النهائي ، مع الحفاظ على نسبة 1: 1 v / v. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام DMEM أو 1x PBS بدلا من RPMI 1640.
14. عد الخلايا المعلقة باستخدام مقياس الدم أو الطريقة الآلية. خفف حسب الحاجة لتحقيق التركيز المطلوب للحقن. يقترح نقطة انطلاق من حوالي 1-2 مليون خلية لكل موقع حقن.
15. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ذو القاع المستدير سعة 2 مل ، اجمع الكمية المطلوبة من تعليق الخلية المخفف في RPMI مع حجم متساو من Matrigel. امزج المعلق برفق عن طريق سحب العينات المتكرر لضمان التجانس.
    ملاحظة: باتباع الخطوة السابقة ، أضف 400 ميكرولتر من تعليق الخلية المخفف إلى 400 ميكرولتر من Matrigel. ضع في اعتبارك عدد إبر الحقن التي سيتم استخدامها وعامل خسائر الحجم المرتبطة بها. احتفظ ب Matrigel على الجليد في جميع الأوقات. لا تقم بإذابة الثلج حتى يتم تعليق الخلايا ، لأنها ستتصلب بسرعة. يوصى بالحفاظ على كميات صغيرة (على سبيل المثال ، 120 ميكرولتر) للذوبان السريع والجمع في أنبوب 2 مل.
16. حافظ على تعليق الخلية على الجليد حتى يصبح جاهزا للحقن.

2. حقن وسادة الدهون الثديية الأربية تقويم العظام من PDX المنفصل

1. حدد كتلة كل ماوس باستخدام ميزان معاير. ضعي طبقة رقيقة من كريم إزالة الشعر على موقع (مواقع) الحقن المستهدفة. باستخدام قطعة قطن معقمة ، قم بتدليك الكريم بالتناوب في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة لتسهيل إزالة الفراء بسرعة.
   1. قم بإزالة الفراء الزائد وكريم إزالة الشعر باستخدام إسفنجة شاش معقمة مبللة بالمحلول الملحي. تأكد من إزالة الشعر بالكامل في منطقة الحقن.
      ملاحظة: لا تتجاوز 60 ثانية من التعرض لكريم إزالة الشعر لمنع تهيج الجلد. يمكن حلق الفئران قبل وضع كريم إزالة الشعر لتقليل وقت التعرض. يمكن تنفيذ هذه الخطوة أثناء تفكك الورم لتحسين كفاءة الوقت وتقليل مدة تخزين تعليق الخلية على الجليد.
2. إجراء فحص بصري شامل لكل فأر لتقييم اللياقة البدنية للحقن. تقييم أي علامات للألم أو الضيق أو المرض أو موانع أخرى.
3. باستخدام حقنة سعة 1 مل بدون إبرة متصلة ، قم بشفط معلق الخلية برفق لأعلى ولأسفل لضمان التجانس. قم بتوصيل إبرة 26 جم بحقنة 1 مل واسحب حجم الحقن المطلوب. تخلص من أي فقاعات هواء من المحقنة عن طريق النقر أو النقر برفق.
   ملاحظة: يوصى بعدم تجاوز 600 ميكرولتر لكل حقنة لتسهيل الحقن بيد واحدة.
4. ضع المحقنة المحضرة أفقيا فوق وعاء الثلج ، مع توجيه الإبرة بعيدا عن المشغل. ضع حاوية الثلج والإبرة على نفس جانب يد المشغل المهيمنة أو يد الحقن المفضلة. قم بإزالة الماوس من غلافه وتطهير منطقة الحقن باستخدام وسادة تنظيف الكحول.
5. كبح جماح الماوس بإحكام عن طريق الإمساك بالجلد الظهري بإحكام في مؤخرة العنق والظهر. تأكد من الشلل الكافي لفضح ضمادات الدهون الثديية بوضوح. تمتد وسادة دهون الثدي الأربية من الحلمة إلى أعلى الورك. يمكن ملاحظته على شكل نسيج ناعم وردي في المنطقة الموصوفة تحت الجلد.
   ملاحظة: قد يستخدم المشغل المساعد ملقطا مسطحا لقرص الجلد الذي يحتوي على وسادة الدهون ورفعه. تساعد هذه التقنية على ضمان أن المشغل الذي يقوم بالحقن يستهدف بنجاح وسادة الدهون.
6. ضع الماوس في وضع ضعيف. أدخل الإبرة (شطبة) بزاوية 45 درجة ، مشيرا إلى الورك حوالي 0.5-1 سم الذيلية إلى وسادة الدهون ، مع ضبط طول الإبرة.
   1. تقدم الإبرة إلى وسادة الدهون. بطريقة خاضعة للرقابة ، قم بحقن الحجم المطلوب من تعليق الخلية. ستساعد سرعة الحقن الفعالة في تقليل هياج من ضبط النفس لفترات طويلة.
      ملاحظة: لتقليل ضائقة ، يجب ألا تتجاوز المدة القصوى للتقييد اليدوي المستمر 30 ثانية. إذا تجاوزت مدة ضبط النفس 30 ثانية ، فيجب إطلاق سراح في القفص للتعافي قبل المحاولة الثانية.
7. بعد الحقن ، قم بتدوير الإبرة 180 درجة (شطبة لأسفل). حافظ على وضع الإبرة لفترة وجيزة قبل الانسحاب البطيء لتقليل فقدان الخلايا من موقع الحقن. في حالة حدوث أي نزيف ، استخدم شاشا قياسيا أو شاشا مرقئا حسب الضرورة.
8. كرر الخطوتين 2.6 و 2.7 لوسادة الدهون المقابلة إذا كانت الحقن الثنائية مطلوبة. بالنسبة لحيوانات متعددة ، كرر الخطوات 2.2-2.7 حسب الحاجة.

3. إجراءات المتابعة

1. تخلص من جميع الأدوات الحادة في حاويات الأدوات الحادة المخصصة. تخلص من جميع المحتويات الأخرى في حاويات النفايات المناسبة.
2. في حالة حدوث نزيف أثناء الحقن ، راقب الفئران لمدة ساعة على الأقل بعد ذلك للتأكد من الإرقاء.
3. مراقبة كتلة الجسم على أساس أسبوعي. تقييم حجم الورم بمجرد أن يصبح النمو واضحا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحدد هذه الدراسة نهجا فعالا وغير جراحي لزرع تقويم العظام لطعوم سرطان الثدي المشتقة من المريض في الفئران. تم فصل أنسجة ورم الثدي باستخدام إنزيمات خاصة بالإنسان والتحريض الميكانيكي ، وأعيد تعليقها بنسبة 1: 1 v / v من Matrigel: RPMI 1640 ، وتم حقنها بشكل تقويمي في ضما?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تقدم هذه المقالة طريقة فعالة وعالية الإنتاجية لزرع BC PDXs تقويم العظام في ضمادات الدهون الثديية الأربية للفئران التي تعاني من نقص المناعة. يتيح سير العمل المحسن هذا للباحث الفردي زرع PDXs في عشرات الفئران يوميا ، مما يدعم الدراسات واسعة النطاق ومدعومة بشكل كاف. كما أن القدر?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe	BD	305945	sterile
1x phosphate buffered saline, pH 7.4	Gibco	10010023	sterile
2.0 mL round-bottom microcentrifuge tube	Eppendorf	0030123620	sterile
26 G needle, ½ in.	BD	305111	sterile
5.0 mL microtube	Eppendorf	0030119401	sterile
8+ week old NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	The Jackson Laboratory	#005557
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Basement membrane extract (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Cotton-tipped applicators, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553	sterile
Curved Forceps with Medium Non-serrated Tips, 152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	sterile
Depilatory cream	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociator with heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
No. 10 scalpel blades	Fisher Scientific	12-000-162	sterile
Non-woven gauze sponges, 4x4 inch	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutamine	Gibco	11875093	sterile
Tumor dissociation kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929