High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of Breast Cancer Patient-derived Xenografts(유방암 환자 유래 이종이식편의 High-Throughput Dissociation and orthotopic Implantation of breast Cancer Patient-derived Xenografts)

요약

이 프로토콜은 마우스에서 유방암 환자 유래 이종이식편의 정소성 이식을 위한 효율적인 비수술적 방법을 설명합니다. 이 기술은 효소 종양 해리 후 유방 지방 패드에 직접 주입하여 고처리량 이식을 가능하게 합니다. 포괄적인 검증은 모델 충실도를 보장하여 다양한 유방암 하위 유형에 대한 엄격한 연구를 촉진합니다.

초록

환자 유래 이종이식편(PDX)은 유방암(BC)에 대한 지식을 발전시키는 데 필수적인 종양 관련 세포 유형 및 종양 미세환경을 재현하기 위한 임상적으로 관련된 방법을 제공합니다. 또한 PDX 모델은 체외 모델로는 불가능한 BC 전신 효과에 대한 연구를 가능하게 합니다. BC 이종이식편을 이식하는 전통적인 방법은 일반적으로 마취 및 멸균 수술 절차를 포함하며, 이는 시간이 많이 걸리고 침습적이며 BC 연구에서 PDX 모델의 확장성을 제한합니다. 이 프로토콜은 마우스에 BC PDX의 정소성 이식을 위한 간단하고 확장 가능한 방법을 설명합니다. 면역결핍 마우스 균주 NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG)를 PDX 생착에 사용했습니다. IRB에 동의한 환자로부터 얻은 인간 BC 샘플을 기계적 및 효소적으로 해리한 다음 기저막 추출물(BME) 및 RPMI 1640 용액에 재현탁시켰습니다. 동물은 목덜미를 문지르는 것으로 제지하고, 제모 크림을 바르고 네 번째 서혜부 유두의 지방 패드에서 털을 제거한 다음 주사를 놓았습니다. 100μL 현탁액에 있는 약 200만 개의 세포를 26G 바늘을 사용하여 유방 지방 패드에 양측으로 직교정 주입했습니다. 특히 마취제가 필요하지 않았으며 세포 준비에서 주입까지 총 시술 시간이 5분 미만이었습니다. 몇 개월의 성장기가 지난 후 종양을 절제하고 인증을 위해 처리했습니다. 검증에는 기존 BC 수용체(즉, ER, PR, HER2)에 대한 특정 항체와 함께 면역조직화학을 사용한 수용체 상태 평가가 포함되었습니다. 종양 형태는 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색으로 확인되었으며, 병리학자에 의해 해석되었습니다. 환자 샘플과의 유전적 유사성은 벌크 RNA 염기서열분석 및 STR(Short Tandem Repeat) 분석을 통해 검증되었습니다. PDX 생착 및 검증에 대한 이러한 접근 방식은 엄격한 모델 개발과 고처리량 종양 이식을 지원하여 다양한 BC 하위 유형에 걸쳐 강력한 연구를 가능하게 합니다.

서문

유방암(BC)은 매년 전 세계적으로 200만 명 이상의 여성이 진단을 받습니다¹. BC에 대한 기본적인 생물학적 이해를 증진하고 새로운 치료법을 승인된 치료법으로 성공적으로 전환하기 위해서는 환자 종양의 특징을 유지하는 전임상 동물 모델이 필요합니다. 환자 유래 이종이식편(PDX)은 조직병리학, 수용체 발현 및 유전적 이상을 포함하여 정형외과적으로 이식할 때 높은 충실도로 종양 이질성을 재현하는 것으로 입증되었습니다 ^2,3,4. 중요한 것은 혈관 구조, 면역 세포 및 암 관련 섬유아세포와 같이 종양의 미세 환경에 기여하는 기질 세포도 유지한다는 것입니다. 그럼에도 불구하고, 그들은 점차적으로 파시징(passaging)을 가진 쥐 숙주 기질 세포(murine host stromal cell)로 대체된다⁵. PDX는 또한 피로 ^6,7과 같은 종양 성장으로 인한 전신 합병증에 대한 연구를 가능하게 하며, 이는 현재 체외 모델로는 불가능합니다.

그러나 성공적인 BC PDX 생착을 위해서는 면역결핍 마우스 균주가 필요하며, 가장 일반적으로 사용되는 균주는 NSG(NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ)입니다. NSG 마우스는 적응 면역이 없으며 선천성 면역에 결함이 매우 높습니다⁸. BC PDX 생착은 SCID/Beige (CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/Crl)와 같은 다른 면역결핍 균주에서도 유사한 생착률로 이루어졌다⁴.

BC PDX를 이식하는 전통적인 방법은 유방 지방 패드⁹에 종양 조각을 외과적으로 이식하는 것이며, 이 방법은 유리한 비율로 성공적인 생착으로 이어집니다. 그러나 멸균 수술 절차와 마취제 사용의 필요성으로 인해 시간이 많이 소요되므로 특정 시간 창에 이식할 수 있는 마우스의 수가 제한됩니다. 종양에 대한 약물 반응과 정밀 의학에서의 사용에 대한 PDX의 잠재적인 예측 이점을 감안할 때¹⁰ PDX를 마우스에 균일하게 이식하기 위한 간단하고 재현 가능한 워크플로우를 갖추는 것이 중요합니다. 이 논문은 인간 유방 종양이 단일 세포 현탁액으로 해리되고 면역 결핍 마우스의 유방 지방 패드에 후속 orthotopic 주입을 보여줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 웨스트 버지니아 대학교(WVU) 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 제정한 지침을 준수합니다. 생후 8주 이상이고 체중이 약 25g인 암컷 NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스를 종양 세포 주사에 사용했습니다. 유방암 종양 조직은 West Virginia University Cancer Institute(웨스트버지니아주 모건타운)와 NCI 협력 인체 조직 네트워크(NCI Cooperative Human Tissue Network)에서 승인된 WVU Institutional Review Board 프로토콜 및 WVU Cancer Institute 프로토콜 검토 및 모니터링 위원회에 의해 조달되었습니다. 환자들로부터 충분한 정보를 입각한 서면 동의를 받았습니다. 모든 절차는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 프로토콜에 따라 Class II 생물 안전 캐비닛 내에서 무균 상태로 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 동물, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 종양 조직의 High-throughput 효소 해리

1. 인간 종양 해리 키트의 효소 H, R 및 A를 멸균된 C-튜브에서 해동하고 결합합니다. 200 μL의 효소 H, 100 μL의 효소 R 및 25 μL의 효소 A를 추가합니다. C-tube에 4.7 mL의 멸균 RPMI 1640 배지를 추가하여 최종 부피를 ~5 mL로 만듭니다.
   참고: RPMI 1640 대신 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)을 사용할 수 있습니다.
2. 종양 단편은 기존 프로토콜⁹에 설명된 대로 절단 및 동결할 수 있습니다. 해동된 종양 조각과 함께 제공되는 동결 매체를 멸균된 100mm 배양 접시의 절반으로 옮깁니다. 멸균 겸자를 사용하여 종양 조각을 멸균 5mL 마이크로튜브로 옮깁니다.
   알림: 멸균 피하 주사 바늘을 겸자 대신 사용할 수 있습니다. 5mL 마이크로튜브 대신 35mm 접시를 사용할 수 있습니다.
3. 1-3mL의 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, 1x)로 종양 조각을 세척합니다. 잔류 동결 매체를 철저히 제거하기 위해 집게를 사용하여 용액의 단편을 조작합니다.
4. 세척된 단편을 겸자를 사용하여 2mL 마이크로튜브로 옮깁니다. 종양 조각에 삼중 항생제(TAB) 용액 1mL를 바르고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   참고: 원하는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다. 10x TAB 스톡은 1% 겐타마이신, 1% 클린다마이신 및 0.5% 폴리믹신 B 황산염을 멸균 1x PBS에 용해하여 만들 수 있습니다. 멸균 1x PBS에서 1x TAB 용액으로 희석합니다.
5. 멸균 집게를 사용하여 소독된 조각을 새 5mL 마이크로튜브로 옮깁니다. 1-3mL의 멸균 PBS로 두 번째 세척을 수행합니다. 세척된 조각을 1.2단계에서 100mm 배양 접시의 건조한 절반으로 옮깁니다.
6. 두 개의 멸균 No. 10 메스 날을 사용하여 종양 조직을 철저히 다집니다. 다진 종양 조각을 한쪽 블레이드로 옮기고 준비된 효소 용액이 들어 있는 C-튜브에 넣습니다. 마지막 딸깍 소리가 날 때까지 튜브 뚜껑을 단단히 조입니다.
7. C-튜브를 여러 번 뒤집어 효소 용액 내에서 종양 조각이 균일하게 분포되도록 합니다.
8. C-튜브를 기계적 분리기에 놓습니다. 튜브를 뒤집고 모든 내용물이 매체에 잠겨 있는지 확인합니다. 튜브는 기계에서 거꾸로 된 위치에 있습니다.
   1. 움푹 들어간 부분이 작업자를 향하도록 하여 튜브를 슬롯에 고정합니다. 해당되는 경우 튜브 주위에 히터를 놓습니다.
9. 터치스크린 인터페이스에서 37C_h_TDK_3 프로그램을 선택합니다. 이 프로그램은 37°C에서 60분 동안 작동합니다. 부드러운 종양의 경우 37C_h_TDK_1 또는 2를 사용할 수 있습니다.
   참고: 효율성을 극대화하려면 마우스가 주사 부위에 제모 크림을 바르고 이 해리 기간 동안 주사를 준비할 수 있도록 하는 것이 좋습니다.
10. 해리 프로그램이 완료되면 튜브 내용물을 검사합니다. 눈에 보이는 종양 조각이 남아 없어야 합니다.
    참고: 단편이 있는 경우 추가 해리 시간이 필요할 수 있습니다. 이러한 경우 20-30분 동안 프로그램을 추가로 실행하십시오.
11. 적절한 해리가 이루어지면 C-튜브를 200 x g 에서 4°C에서 5-8분 동안 원심분리하여 해리된 세포를 펠릿화합니다. 진공 흡입 또는 피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 제거합니다.
12. 세포 펠릿을 5-10mL의 새로운 RPMI 배지에 재현탁합니다. 더 쉽게 조작할 수 있도록 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 200 x g 에서 4°C에서 5-8분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인합니다.
    참고: 세포 펠릿이 작은 경우 이 단계를 생략할 수 있습니다. 이러한 경우, 세포는 원하는 부피의 배지에 직접 재현탁된 다음 기저막 추출물(Matrigel)과 결합되어 세포 손실을 최소화합니다.
13. 원하는 최종 주입 부피의 절반에 해당하는 RPMI 1640의 부피로 세포 펠릿을 재현탁합니다. RPMI 1640과 Matrigel은 1:1 v/v 비율로 결합되며, 주입 부위당 최종 주입량은 100μL입니다.
    참고: 4마리의 마우스에 대한 양측 주입의 경우 필요한 총 부피는 800μL입니다. 따라서 최소 400μL의 RPMI 1640에서 세포를 재현탁합니다. 잠재적인 볼륨 손실을 고려하려면 최종 볼륨에 20%를 추가하여 1:1 v/v 비율을 유지하는 것이 좋습니다. 또는 RPMI 1640 대신 DMEM 또는 1x PBS를 사용할 수 있습니다.
14. 혈구계 또는 자동화된 방법을 사용하여 재현탁된 세포를 계수합니다. 주입에 필요한 농도를 얻기 위해 필요에 따라 희석합니다. 주입 부위당 약 1-200만 개의 세포로 시작하는 것이 제안됩니다.
15. 2mL 둥근 바닥 마이크로 원심분리기 튜브에서 RPMI의 원하는 양의 희석된 세포 현탁액과 동일한 부피의 Matrigel을 결합합니다. 균질성을 보장하기 위해 반복적인 피펫팅으로 현탁액을 부드럽게 혼합합니다.
    참고: 이전 단계에 따라 400μL의 Matrigel에 400μL의 희석된 세포 현탁액을 추가합니다. 사용할 주사 바늘의 수와 관련 부피 손실을 고려합니다. Matrigel을 항상 얼음 위에 두십시오. 세포가 다시 부유할 때까지 해동하지 마십시오, 빨리 응고될 것이므로. 2mL 튜브에서 빠른 해동 및 결합을 위해 작은 부분 표본(예: 120 μL)을 유지하는 것이 좋습니다.
16. 주입할 준비가 될 때까지 얼음 위에서 세포 현탁액을 유지합니다.

2. 해리된 PDX의 정사위 서혜부 유방 지방 패드 주입

1. 보정된 저울을 사용하여 각 마우스의 질량을 측정합니다. 대상 주사 부위에 탈모 크림을 얇게 바르십시오. 멸균 면봉을 사용하여 시계 방향과 시계 반대 방향으로 번갈아 가며 크림을 마사지하면 털이 빠르게 제거됩니다.
   1. 멸균 식염수에 적신 거즈 스펀지를 사용하여 여분의 털과 제모 크림을 제거합니다. 주입 부위에서 완전한 제모를 확인하십시오.
      알림: 피부 자극을 방지하기 위해 제모 크림 노출을 60초를 초과하지 마십시오. 생쥐는 노출 시간을 더욱 최소화하기 위해 제모 크림을 바르기 전에 면도할 수 있습니다. 이 단계는 시간 효율성을 최적화하고 얼음 위에 세포 현탁액이 저장되는 기간을 최소화하기 위해 종양 해리 중에 수행할 수 있습니다.
2. 각 마우스에 대한 철저한 육안 검사를 수행하여 주사 적합성을 평가합니다. 통증, 고통, 질병 또는 기타 금기 징후가 있는지 평가합니다.
3. 바늘이 부착되지 않은 1mL 주사기를 사용하여 세포 현탁액을 위아래로 부드럽게 흡인하여 균질성을 보장합니다. 1mL 주사기에 26G 바늘을 부착하고 원하는 주입량을 빼냅니다. 주사기에서 기포를 부드럽게 두드리거나 튕겨 제거합니다.
   참고: 한 손 주입을 용이하게 하기 위해 주사기당 600μL를 초과하지 않는 것이 좋습니다.
4. 준비된 주사기를 바늘이 작업자에게서 멀어지도록 얼음 용기 위에 수평으로 놓습니다. 얼음 용기와 바늘을 작업자의 주로 사용하는 손 또는 선호하는 주입 손과 같은 쪽에 놓습니다. 하우징에서 마우스를 제거하고 알코올 클렌징 패드를 사용하여 주입 부위를 소독합니다.
5. 목덜미와 등쪽 피부의 등을 단단히 잡고 마우스를 단단히 제지합니다. 유방 지방 패드를 명확하게 노출시키기 위해 충분한 고정을 보장하십시오. 서혜부 유방 지방 패드는 유두에서 엉덩이 상단까지 뻗어 있습니다. 피부 아래 설명된 영역에서 부드럽고 분홍빛이 도는 조직으로 관찰할 수 있습니다.
   알림: 보조 작업자는 평평한 집게를 사용하여 지방 패드가 포함된 피부를 꼬집고 들어 올릴 수 있습니다. 이 기술은 주사를 수행하는 작업자가 지방 패드를 성공적으로 표적으로 삼도록 하는 데 도움이 됩니다.
6. 마우스를 누운 위치에 놓습니다. 바늘을 45도 각도로 삽입하고 엉덩이를 향해 지방 패드에서 약 0.5-1cm 꼬리를 가리키고 바늘 길이를 조정합니다.
   1. 바늘을 뚱뚱한 패드에 밀어 넣습니다. 제어된 방식으로 원하는 부피의 세포 현탁액을 주입합니다. 효율적인 주입 속도는 장시간의 구속으로 인한 동물의 동요를 최소화하는 데 도움이 됩니다.
      알림: 동물의 고통을 최소화하기 위해 지속적인 수동 구속의 최대 지속 시간은 30초를 초과해서는 안 됩니다. 구속 시간이 30초를 초과하는 경우, 두 번째 시도 전에 회복을 위해 동물을 케이지 안으로 풀어 주어야 합니다.
7. 주입 후 바늘을 180도 회전합니다(아래로 경사). 주입 부위에서 세포 손실을 최소화하기 위해 천천히 빼내기 전에 바늘 위치를 잠시 유지하십시오. 출혈이 발생하면 필요에 따라 표준 거즈 또는 지혈 거즈를 적용합니다.
8. 양측 주사가 필요한 경우 반대쪽 지방 패드에 대해 2.6단계와 2.7단계를 반복합니다. 여러 동물의 경우 필요에 따라 2.2-2.7 단계를 반복합니다.

3. 후속 조치

1. 모든 날카로운 물건은 지정된 날카로운 물건 용기에 버리십시오. 다른 모든 내용물은 적절한 쓰레기통에 버리십시오.
2. 주사 중 출혈이 발생하면 지혈을 확인하기 위해 최소 1시간 동안 마우스를 모니터링하십시오.
3. 매주 체질량을 모니터링하십시오. 성장이 뚜렷해지면 종양 부피를 평가합니다.

결과

이 연구는 마우스에서 환자 유래 유방암 이종이식편의 정형소 이식을 위한 효율적이고 비수술적인 접근 방식을 설명합니다. 유방 종양 조직을 인간 특이적 효소 및 기계적 교반을 사용하여 해리하고, Matrigel: RPMI 1640의 1:1 v/v 비율로 재현탁하고, NSG 마우스의 서혜부 유방 지방 패드에 정형외과적으로 주입했습니다(그림 1 및

토론

이 논문은 면역 결핍 마우스의 서혜부 유방 지방 패드에 BC PDX를 정교소적으로 이식하기 위한 효율적인 고처리량 방법을 제시합니다. 이 최적화된 워크플로우를 통해 한 명의 연구원이 하루에 수십 개의 마우스에 PDX를 이식할 수 있어 적절한 성능을 갖춘 대규모 연구를 지원할 수 있습니다. 여러 개의 고유한 PDX를 동시에 해리하고 이식할 수 있는 능력은 또한 정밀 종양학...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe	BD	305945	sterile
1x phosphate buffered saline, pH 7.4	Gibco	10010023	sterile
2.0 mL round-bottom microcentrifuge tube	Eppendorf	0030123620	sterile
26 G needle, ½ in.	BD	305111	sterile
5.0 mL microtube	Eppendorf	0030119401	sterile
8+ week old NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	The Jackson Laboratory	#005557
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Basement membrane extract (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Cotton-tipped applicators, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553	sterile
Curved Forceps with Medium Non-serrated Tips, 152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	sterile
Depilatory cream	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociator with heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
No. 10 scalpel blades	Fisher Scientific	12-000-162	sterile
Non-woven gauze sponges, 4x4 inch	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutamine	Gibco	11875093	sterile
Tumor dissociation kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929