乳腺癌患者来源的异种移植物的高通量解离和原位植入

摘要

该方案描述了一种有效的非手术方法，用于在小鼠中原位植入乳腺癌患者来源的异种移植物。该技术涉及酶促肿瘤解离，然后直接注射到乳腺脂肪垫中，实现高通量植入。全面的验证可确保模型的保真度，从而促进对各种乳腺癌亚型的严格研究。

摘要

患者来源的异种移植物 （PDX） 为概括涉及肿瘤的细胞类型和肿瘤微环境提供了一种临床相关的方法，这对于推进乳腺癌 （BC） 的了解至关重要。此外，PDX 模型能够研究 BC 全身效应，这是使用体外模型无法实现的。植入 BC 异种移植物的传统方法通常涉及麻醉和无菌外科手术，这些手术耗时、侵入性大，并且限制了 PDX 模型在 BC 研究中的可扩展性。该协议描述了一种简单且可扩展的方法，用于在小鼠中原位植入 BC PDX。采用免疫缺陷小鼠品系 NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ （NSG） 进行 PDX 植入。从 IRB 同意的患者那里获得的人类 BC 样品以机械和酶促方式解离，然后重悬于基底膜提取物 （BME） 和 RPMI 1640 的溶液中。通过刮擦束缚动物，涂抹脱毛膏以去除第四腹股沟脂肪垫上的毛发，然后注射。使用 26 G 针头将 100 μL 悬浮液中的约 200 万个细胞双侧原位注射到乳腺脂肪垫中。值得注意的是，不需要麻醉，从细胞制备到注射的总手术时间不到 5 分钟。经过几个月的生长期后，切除肿瘤并进行鉴定。验证包括使用免疫组化和传统 BC 受体 （即 ER、PR、HER2） 的特异性抗体进行受体状态评估。通过苏木精和伊红 （H&E） 染色证实肿瘤形态，由病理学家解释。通过大量 RNA 测序和短串联重复序列 （STR） 分析验证与患者样本的遗传相似性。这种 PDX 植入和验证方法支持模型的严格开发和高通量肿瘤植入，从而能够对各种 BC 亚型进行有力的研究。

引言

全球每年有超过 200 万女性被诊断出患有乳腺癌 （BC）¹。为了推进对 BC 的基本生物学理解并成功地将新疗法转化为批准的治疗方法，有必要保留患者肿瘤定义特征的临床前动物模型。患者来源的异种移植物 （PDX） 已被证明在原位植入时可以高保真地概括肿瘤异质性，包括组织病理学、受体表达和遗传畸变 ^2,3,4。重要的是，它们还保留了有助于肿瘤微环境的基质细胞，例如脉管系统、免疫细胞和癌症相关成纤维细胞。尽管如此，它们逐渐被传代⁵ 的小鼠宿主基质细胞取代。PDX 还可以研究肿瘤生长引起的全身并发症，例如疲劳 ^6,7，目前无法使用体外模型进行研究。

然而，成功的 BC PDX 植入确实需要免疫缺陷小鼠品系，最常用的品系是 NSG （NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ）。NSG 小鼠缺乏适应性免疫，并表现出高度缺陷的先天免疫⁸。BC PDX 植入已在其他免疫缺陷菌株中实现，例如 SCID/Beige （CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/Crl），具有相似的植入率⁴。

植入 BC PDX 的传统方法包括通过手术将肿瘤碎片植入乳腺脂肪垫⁹，这种方法可以以有利的速率成功植入。然而，对无菌外科手术和麻醉剂使用的需求使其非常耗时，从而限制了在特定时间窗口内可以植入的小鼠数量。鉴于 PDX 对肿瘤药物反应的潜在预测益处和在精准医学中的应用¹⁰，拥有一个简单且可重复的工作流程来在小鼠中均匀植入 PDX 至关重要。本文演示了人乳腺肿瘤解离成单细胞悬液，随后将原位注射到免疫缺陷小鼠的乳腺脂肪垫中。

研究方案

该协议遵守西弗吉尼亚大学 （WVU） 机构动物护理和使用委员会制定的指导方针。雌性 NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ （NSG） 小鼠，年龄在 8 周或以上，体重约 25 g，用于肿瘤细胞注射。乳腺癌肿瘤组织由西弗吉尼亚大学癌症研究所（西弗吉尼亚州摩根敦）和 NCI 合作人体组织网络根据批准的 WVU 机构审查委员会协议和 WVU 癌症研究所协议审查和监测委员会采购。获得患者的知情书面同意。所有程序均在 II 级生物安全柜内的无菌条件下进行，并遵循适当的个人防护设备 （PPE） 方案。材料 表中提供了本研究中使用的动物、试剂和设备的详细信息。

1. 肿瘤组织的高通量酶解离

1. 在无菌 C 管中解冻并结合来自人肿瘤解离试剂盒的酶 H、R 和 A。加入 200 μL 酶 H、100 μL 酶 R 和 25 μL 酶 A。向 C 管中加入 4.7 mL 无菌 RPMI 1640 培养基，使最终体积达到 ~5 mL。
   注：Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 可用于替代 RPMI 1640。
2. 可以按照现有方案⁹ 中的描述切割和冷冻肿瘤片段。将解冻的肿瘤片段和随附的冷冻培养基转移到无菌 100 mm 培养皿的一半上。使用无菌镊子，将肿瘤碎片转移到无菌 5 mL 微管中。
   注意：无菌皮下注射针头可用作镊子的替代品。可以使用 35 mm 培养皿代替 5 mL 微管。
3. 用 1-3 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS， 1x） 洗涤肿瘤片段。使用镊子作溶液中的片段，以确保彻底去除残留的冷冻培养基。
4. 使用镊子将洗涤后的碎片转移到 2 mL 微管中。将 1 mL 三联抗生素 （TAB） 溶液涂在肿瘤片段上，并在室温下孵育 10 分钟。
   注意：如果需要，可以跳过此步骤。通过将 1% 庆大霉素、1% 克林霉素和 0.5% 硫酸多粘菌素 B 溶解在无菌 1x PBS 中，可以制备 10x TAB 原液。在无菌 1x PBS 中稀释至 1x TAB 溶液。
5. 使用无菌镊子，将消毒后的碎片转移到新的 5 mL 微管中。用 1-3 mL 无菌 PBS 进行第二次洗涤。将洗涤后的片段转移到步骤 1.2 中 100 mm 培养皿的干燥部分。
6. 使用两个无菌的 10 号手术刀刀片，彻底切碎肿瘤组织。将切碎的肿瘤片段转移到一个刀片上，并将它们沉积到含有制备的酶溶液的 C 管中。牢固地固定管盖，直到感觉到最后的咔嗒声。
7. 将 C 管倒置数次，以确保肿瘤片段在酶溶液内均匀分布。
8. 将 C 管放入机械分离器中。倒置试管并确保所有内容物都浸没在培养基中。管子在机器中将处于倒置位置。
   1. 将管子固定在槽中，使凹陷部分面向作员。如果适用，将加热器放在管子周围。
9. 从触摸屏界面中选择 37C_h_TDK_3 程序。该程序在 37 °C 下运行 60 分钟。 对于较软的肿瘤，可以使用 37C_h_TDK_1 或 2。
   注意：为了获得最大的效率，建议通过向注射部位涂抹脱毛膏来准备在此解离期间进行注射。
10. 解离程序完成后，检查试管内容物。不应留下可见的肿瘤碎片。
    注：如果存在片段，则可能需要额外的解离时间。在这种情况下，请再运行程序 20-30 分钟。
11. 一旦达到充分解离，在 4 °C 下以 200 x g 离心 C 管 5-8 分钟以沉淀解离的细胞。使用真空吸液或移液管小心去除上清液。
12. 将细胞沉淀重悬于 5-10 mL 新鲜 RPMI 培养基中。将细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中，以便于作。将细胞悬液在 4 °C 下以 200 x g 离心 5-8 分钟。 小心吸出上清液。
    注意：如果细胞沉淀很小，则可以省略此步骤。在这种情况下，将细胞直接重悬于所需体积的培养基中，然后与基底膜提取物 （Matrigel） 结合，以尽量减少细胞损失。
13. 将细胞沉淀重悬于一定体积的 RPMI 1640 中，相当于所需最终注射体积的一半。RPMI 1640 和 Matrigel 将以 1：1 v/v 的比例混合，每个注射部位的最终注射量为 100 μL。
    注意：对于 4 只小鼠的双侧注射，所需的总体积为 800 μL。因此，将细胞重悬于至少 400 μL 的 RPMI 1640 中。为了解决潜在的体积损失，建议在最终体积上再增加 20%，同时保持 1：1 的 v/v 比率。或者，可以使用 DMEM 或 1x PBS 代替 RPMI 1640。
14. 使用血细胞计数器或自动方法对重悬的细胞进行计数。根据需要稀释以达到所需的注射浓度。建议每个注射部位大约 1-200 万个细胞的起点。
15. 在 2 mL 圆底微量离心管中，将所需量的 RPMI 稀释细胞悬液与等体积的 Matrigel 混合。通过重复移液轻轻混合悬浮液以确保均匀性。
    注：按照上一步，将 400 μL 稀释的细胞悬液添加到 400 μL 基质胶中。考虑要使用的注射针头数量，并考虑相关的体积损失。始终将 Matrigel 放在冰上。在细胞重悬之前不要解冻，因为它会很快凝固。建议保持小等分试样（例如 120 μL），以便在 2 mL 试管中快速解冻和混合。
16. 将细胞悬液保持在冰上，直到准备好注射。

2. 原位腹股沟乳腺脂肪垫注射解离的 PDX

1. 使用校准的天平确定每只鼠标的质量。在目标注射部位涂抹一层薄薄的脱毛霜。使用无菌棉签，以顺时针和逆时针交替运动按摩乳霜，以促进快速去除皮毛。
   1. 使用浸有盐水的无菌纱布海绵去除多余的皮毛和脱毛霜。确保在注射区域完全脱毛。
      注意：脱毛霜暴露时间不要超过 60 秒，以防止皮肤刺激。可以在使用脱毛膏之前为小鼠剃毛，以进一步减少暴露时间。此步骤可以在肿瘤解离过程中进行，以优化时间效率并最大限度地减少细胞悬液在冰上储存的时间。
2. 对每只小鼠进行彻底的目视检查，以评估是否适合注射。评估是否有任何疼痛、痛苦、疾病或其他禁忌症的迹象。
3. 使用不带针头的 1 mL 注射器，轻轻上下吸出细胞悬液，以确保均匀性。将 26 G 针头连接到 1 mL 注射器上，并抽出所需的注射体积。通过轻轻敲击或轻弹消除注射器中的任何气泡。
   注：建议每个注射器不超过 600 μL，以便于单手注射。
4. 将准备好的注射器水平放在冰容器顶部，使针头远离作员。将冰容器和针头放在与作者惯用手或首选注射手相同的一侧。将鼠标从外壳中取出，并使用酒精清洁垫对注射区域进行消毒。
5. 通过牢牢抓住后颈和背部的背侧皮肤来牢固地束缚鼠标。确保充分固定以清楚地暴露乳腺脂肪垫。腹股沟乳腺脂肪垫从跨越到臀部顶部。它可以在皮肤下的描述区域观察到柔软的粉红色组织。
   注意：助理作员可以使用平边镊子捏住和抬高含有脂肪垫的皮肤。这种技术有助于确保执行注射的作员成功地靶向脂肪垫。
6. 将鼠标置于仰卧位。以 45 度角插入针头（斜面向上），指向臀部，距脂肪垫尾部约 0.5-1 厘米，调整针头长度。
   1. 将针头推进脂肪垫。以受控方式，注入所需体积的细胞悬液。高效的注射速度将有助于最大限度地减少长时间约束引起的动物搅动。
      注意：为了尽量减少动物的痛苦，连续手动约束的最大持续时间不应超过 30 秒。如果约束持续时间超过 30 秒，则应将动物释放到笼子中以恢复，然后再尝试第二次尝试。
7. 注射后，将针头旋转 180 度（斜面向下）。在缓慢退出之前短暂保持针头位置，以尽量减少注射部位的细胞损失。如果发生任何出血，请根据需要使用标准纱布或止血纱布。
8. 如果需要双侧注射，对对侧脂肪垫重复步骤 2.6 和 2.7。对于多只动物，根据需要重复步骤 2.2-2.7。

3. 后续程序

1. 将所有尖锐物品丢弃在指定的尖锐容器中。将所有其他物品丢弃在适当的废物容器中。
2. 如果在注射过程中发生出血，则之后监测小鼠至少 1 小时以确保止血。
3. 每周监测体重。一旦生长变得可触及，就评估肿瘤体积。

结果

本研究概述了一种有效的非手术方法，用于在小鼠体内原位植入患者来源的乳腺癌异种移植物。使用人特异性酶和机械搅拌解离乳腺肿瘤组织，以 1：1 v/v 比例重悬于 Matrigel：RPMI 1640，并原位注射到 NSG 小鼠的腹股沟乳腺脂肪垫中（图 1 和图 2）。为确保 PDX 模型的保真度，使用已建立的组?...

讨论

本文提出了一种高效、高通量的方法，用于将 BC PDX 原位植入免疫缺陷小鼠的腹股沟乳腺脂肪垫中。这种优化的工作流程使单个研究人员每天能够将 PDX 植入数十只小鼠体内，从而支持大规模和有足够把握度的研究。同时解离和植入多个独特 PDX 的能力也使精准肿瘤学方法成为可能。除了时间效率之外，肿瘤的解离还产生了均匀分布在小鼠之间的细胞类型的均匀悬浮液。根...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe	BD	305945	sterile
1x phosphate buffered saline, pH 7.4	Gibco	10010023	sterile
2.0 mL round-bottom microcentrifuge tube	Eppendorf	0030123620	sterile
26 G needle, ½ in.	BD	305111	sterile
5.0 mL microtube	Eppendorf	0030119401	sterile
8+ week old NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	The Jackson Laboratory	#005557
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Basement membrane extract (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Cotton-tipped applicators, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553	sterile
Curved Forceps with Medium Non-serrated Tips, 152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	sterile
Depilatory cream	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociator with heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
No. 10 scalpel blades	Fisher Scientific	12-000-162	sterile
Non-woven gauze sponges, 4x4 inch	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutamine	Gibco	11875093	sterile
Tumor dissociation kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929