דיסוציאציה בתפוקה גבוהה והשתלה אורתוטופית של קסנוגרפים שמקורם בסרטן השד

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ולא כירורגית להשתלה אורתוטופית של קסנוגרפים שמקורם בחולה סרטן השד בעכברים. הטכניקה כוללת דיסוציאציה אנזימטית של הגידול ואחריה הזרקה ישירה לרפידות השומן של החלב, מה שמאפשר השתלה בתפוקה גבוהה. אימות מקיף מבטיח נאמנות למודל, ומאפשר מחקרים קפדניים על פני תת-סוגים שונים של סרטן השד.

Abstract

קסנוגרפים שמקורם בחולה (PDXs) מספקים שיטה רלוונטית מבחינה קלינית לסיכום סוגי תאים המעורבים בגידול ומיקרו-סביבת הגידול, החיונית לקידום הידע על סרטן השד (BC). בנוסף, מודלים של PDX מאפשרים לחקור את ההשפעות המערכתיות של BC, דבר שאינו אפשרי בשימוש במודלים במבחנה. שיטות מסורתיות להשתלת xenografts BC כוללות בדרך כלל הרדמה והליכים כירורגיים סטריליים, שגוזלים זמן, פולשניים ומגבילים את יכולת ההרחבה של דגמי PDX במחקר BC. פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה וניתנת להרחבה להשתלה אורתוטופית של BC PDX בעכברים. זן העכברים חסר החיסון NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) שימש להשתלת PDX. דגימות BC אנושיות שהתקבלו מחולים בהסכמת IRB פורקו מכנית ואנזימטית, ולאחר מכן הושעו מחדש בתמיסה של תמצית קרום הבסיס (BME) ו-RPMI 1640. בעלי חיים היו מרוסנים על ידי קשקוש, וקרם הסרת שיער נמרח כדי להסיר שיער מכריות השומן בפטמה המפשעתית הרביעית, ולאחר מכן הזרקה. כ-2 מיליון תאים בתרחיף של 100 מיקרוליטר הוזרקו באופן אורתוטופי לתוך רפידות השומן החלביות באמצעות מחט 26 גרם. יש לציין כי לא היה צורך בהרדמה, וזמן ההליך הכולל היה פחות מ-5 דקות, מהכנת התא ועד להזרקה. לאחר תקופת גידול של מספר חודשים, הגידולים נכרתו ועובדו לצורך אימות. האימות כלל הערכת מצב הקולטן באמצעות אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים ספציפיים לקולטני BC מסורתיים (כלומר, ER, PR, HER2). מורפולוגיה של הגידול אושרה עם צביעת המטוקסילין ואאוזין (H&E), שפורשה על ידי פתולוג. הדמיון הגנטי לדגימת המטופל אומת באמצעות ריצוף RNA בתפזורת וניתוח חוזר טנדם קצר (STR). גישה זו להשתלה ואימות PDX תומכת בפיתוח קפדני של מודלים והשתלת גידול בתפוקה גבוהה, ומאפשרת מחקרים בעלי עוצמה טובה על פני תת-סוגים שונים של BC.

Introduction

סרטן השד (BC) מאובחן אצל למעלה מ-2 מיליון נשים ברחבי העולם מדי שנה¹. על מנת לקדם את ההבנה הביולוגית הבסיסית של BC ולתרגם בהצלחה טיפולים חדשים לטיפולים מאושרים, יש צורך במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים השומרים על המאפיינים המגדירים של גידולים חולים. הוכח כי קסנוגרפטים שמקורם בחולה (PDX) מסכמים הטרוגניות של גידול בנאמנות גבוהה כאשר הם מושתלים אורתוטופית, כולל היסטופתולוגיה, ביטוי קולטנים וסטיות גנטיות ^2,3,4. חשוב לציין, הם גם שומרים על תאי סטרומה התורמים למיקרו-סביבה של הגידול, כגון כלי דם, תאי חיסון ופיברובלסטים הקשורים לסרטן. אם כי, הם מוחלפים בהדרגה על ידי תאי סטרומה מארחים של עכברים עם מעבר⁵. PDX מאפשרים גם לחקור סיבוכים מערכתיים הנובעים מגידול גידול, כגון עייפות ^6,7, שאינה אפשרית כיום בשימוש במודלים במבחנה.

עם זאת, השתלת BC PDX מוצלחת דורשת זן עכבר חסר חיסון, כאשר הזן הנפוץ ביותר הוא NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ). עכברי NSG נטולי חסינות נרכשת ומציגים חסינות מולדת פגומה מאוד⁸. השתלת BC PDX הושגה בזנים אחרים חסרי חיסון, כגון SCID/Beige (CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/Crl), עם שיעורי השתלה דומים⁴.

שיטות מסורתיות להשתלת BC PDX כוללות השתלה כירורגית של שבר גידול בכרית השומן של החלב⁹, וגישה זו מובילה לחריטה מוצלחת בשיעורים נוחים. עם זאת, הצורך בהליכים כירורגיים סטריליים ושימוש בהרדמה הופך אותו לזמן רב, ובכך מגביל את מספר העכברים שניתן להשתיל בחלון זמן מסוים. בהתחשב ביתרונות החיזוי הפוטנציאליים של PDX של תגובות תרופתיות בגידולים ושימוש ברפואה מדויקת¹⁰, זרימת עבודה פשוטה וניתנת לשחזור להשתלת PDX באופן הומוגני על פני עכברים היא חיונית. מאמר זה מדגים את הדיסוציאציה של גידולי שד אנושיים לתרחיף תא בודד והזרקה אורתוטופית לאחר מכן לרפידות שומן חלב של עכברים חסרי חיסון.

Protocol

פרוטוקול זה עומד בהנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מערב וירג'יניה (WVU). עכברי NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG), בני 8 שבועות ומעלה ובמשקל של כ-25 גרם, שימשו להזרקת תאי גידול. רקמת גידול סרטן השד נרכשה במכון הסרטן של אוניברסיטת מערב וירג'יניה (מורגנטאון, WV) ועל ידי רשת הרקמות האנושיות השיתופיות של NCI תחת פרוטוקול מועצת הסקירה המוסדית של WVU וועדת הסקירה והניטור של פרוטוקול מכון הסרטן של WVU. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מהמטופלים. כל ההליכים נערכו בתנאים אספטיים בתוך ארון בטיחות ביולוגי Class II, בהתאם לפרוטוקולים מתאימים של ציוד מגן אישי (PPE). הפרטים של בעלי החיים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. דיסוציאציה אנזימטית בתפוקה גבוהה של רקמת הגידול

1. להפשיר ולשלב את האנזימים H, R ו-A מערכת דיסוציאציה של גידול אנושי בצינור C סטרילי. הוסף 200 מיקרוליטר של אנזים H, 100 מיקרוליטר של אנזים R ו-25 מיקרוליטר של אנזים A. הביאו את הנפח הסופי ל~5 מ"ל על ידי הוספת 4.7 מ"ל של מדיום RPMI 1640 סטרילי לצינור C.
   הערה: ניתן להשתמש במדיום הנשר השונה (DMEM) של Dulbecco במקום RPMI 1640.
2. ניתן לחתוך ולהקפיא שברי גידול כמתואר בפרוטוקולים הקיימים⁹. מעבירים שברי גידול מופשרים ומדיום הקפאה נלווה למחצית צלחת תרבית סטרילית של 100 מ"מ. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את שברי הגידול למיקרו-צינור סטרילי של 5 מ"ל.
   הערה: מחט היפודרמית סטרילית עשויה לשמש כחלופה למלקחיים. ניתן להשתמש בצלחת 35 מ"מ במקום מיקרו-צינור של 5 מ"ל.
3. שטפו את שברי הגידול עם 1-3 מ"ל של מי מלח סטריליים עם פוספט (PBS, 1x). תפעל את השברים בתמיסה באמצעות מלקחיים כדי להבטיח הסרה יסודית של אמצעי ההקפאה שנותר.
4. העבירו את השברים השטופים למיקרו-צינור של 2 מ"ל בעזרת מלקחיים. מרחו 1 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה משולשת (TAB) על שברי הגידול ודגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: ניתן לדלג על שלב זה אם תרצה. ניתן לייצר מלאי TAB פי 10 על ידי המסת 1% גנטמיצין, 1% קלינדמיצין ו-0.5% פולימיקסין B סולפט ב-PBS סטרילי 1x. יש לדלל לתמיסת TAB 1x ב-PBS סטרילי 1x.
5. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו את השברים המחוטאים למיקרו-צינור חדש של 5 מ"ל. בצע שטיפה שנייה עם 1-3 מ"ל PBS סטרילי. העבירו את השברים השטופים למחצית היבשה של צלחת התרבות 100 מ"מ משלב 1.2.
6. בעזרת שני להבי אזמל סטריליים מס' 10, טוחנים היטב את רקמת הגידול. העבירו את שברי הגידול הטחון ללהב אחד והפקידו אותם בצינור C המכיל את תמיסת האנזים המוכנה. מהדקים היטב את מכסה הצינור עד שתורגש לחיצה אחרונה.
7. הפוך את צינור ה-C מספר פעמים כדי להבטיח פיזור אחיד של שברי הגידול בתוך תמיסת האנזים.
8. הנח את צינור ה-C במפריד המכני. הפוך את הצינור וודא שכל התוכן שקוע במדיום. הצינור יהיה במצב הפוך במכונה.
   1. אבטח את הצינור בחריץ כשהחלק השקוע פונה למפעיל. במידת הצורך, הנח את התנור סביב הצינור.
9. בחר את התוכנית 37C_h_TDK_3 מממשק מסך המגע. תוכנית זו פועלת במשך 60 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. עבור גידולים רכים יותר, ניתן להשתמש ב-37C_h_TDK_1 או 2.
   הערה: ליעילות הגדולה ביותר, מומלץ להכין את העכברים להזרקה בתקופת דיסוציאציה זו על ידי מריחת קרם אפילציה על אתרי ההזרקה.
10. עם סיום תוכנית הדיסוציאציה, בדוק את תכולת הצינור. לא אמורים להישאר שברי גידול גלויים.
    הערה: אם קיימים שברים, ייתכן שיידרש זמן דיסוציאציה נוסף. במקרים כאלה, הפעל את התוכנית למשך 20-30 דקות נוספות.
11. לאחר השגת דיסוציאציה נאותה, צנטריפוגה את צינור ה-C ב-200 x גרם למשך 5-8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול תאים מנותקים. הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות שאיבת ואקום או פיפטה.
12. השעו מחדש את גלולת התא ב-5-10 מ"ל של מדיום RPMI טרי. העבירו את מתלה התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל למניפולציה קלה יותר. צנטריפוגה את מתלה התא ב-200 x גרם למשך 5-8 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שאפו בזהירות את הסופרנטנט.
    הערה: שלב זה עשוי להיות מושמט אם גלולת התא קטנה. במקרים כאלה, התאים מושעים ישירות בנפח המדיה הרצוי ולאחר מכן משולבים עם תמצית קרום הבסיס (Matrigel) כדי למזער את אובדן התאים.
13. השעו מחדש את גלולת התא בנפח של RPMI 1640, שווה ערך למחצית מנפח ההזרקה הסופי הרצוי. RPMI 1640 ו-Matrigel ישולבו ביחס של 1:1 v/v, עם נפח הזרקה סופי של 100 μL לכל אתר הזרקה.
    הערה: להזרקה דו-צדדית ב-4 עכברים, הנפח הכולל הנדרש הוא 800 מיקרוליטר. לכן, השעו מחדש את התאים לפחות 400 מיקרוליטר של RPMI 1640. כדי לקחת בחשבון אובדן נפח פוטנציאלי, מומלץ להוסיף 20% נוספים לנפח הסופי, תוך שמירה על יחס של 1:1 v/v. לחלופין, ניתן להשתמש ב-DMEM או 1x PBS במקום RPMI 1640.
14. ספרו את התאים התלויים באמצעות המוציטומטר או שיטה אוטומטית. יש לדלל לפי הצורך כדי להשיג את הריכוז הרצוי להזרקה. מוצעת נקודת התחלה של כ-1-2 מיליון תאים לכל אתר הזרקה.
15. בצינור מיקרו-צנטריפוגה תחתון עגול של 2 מ"ל, שלב את הכמות הרצויה של תרחיף תאים מדולל ב-RPMI עם נפח שווה של מטריג'ל. מערבבים בעדינות את המתלים על ידי פיפטינג חוזר ונשנה כדי להבטיח הומוגניות.
    הערה: בהמשך לשלב הקודם, הוסף 400 מיקרוליטר של תרחיף תאים מדולל ל-400 מיקרוליטר של מטריגל. שקול את מספר מחטי ההזרקה שיש להשתמש בהן ולקחת בחשבון את הפסדי הנפח הנלווים. שמור את המטריגל על קרח כל הזמן. אל תפשיר אותו עד שתאים מושעים מחדש, מכיוון שהוא יתמצק במהירות. מומלץ לשמור על אליקוטים קטנים (למשל, 120 מיקרוליטר) להפשרה מהירה ושילוב בשפופרת של 2 מ"ל.
16. שמור על תרחיף התאים על קרח עד שהוא מוכן להזרקה.

2. הזרקת כרית שומן חלב מפשעתי אורתוטופית של PDX מנותק

1. קבע את המסה של כל עכבר באמצעות איזון מכויל. מרחו שכבה דקה של קרם אפילציה על אתר הזרקת המטרה. בעזרת צמר גפן סטרילי, עסו את הקרם בתנועות לסירוגין עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון כדי להקל על הסרת פרווה מהירה.
   1. הסר עודפי פרווה וקרם אפילציה בעזרת ספוג גזה סטרילי ספוג במי מלח. הקפידו על הסרת שיער מלאה באזור ההזרקה.
      הערה: אין לחרוג מ-60 שניות של חשיפה לקרם אפילציה כדי למנוע גירוי בעור. ניתן לגלח עכברים לפני מריחת קרם אפילציה כדי למזער עוד יותר את זמן החשיפה. ניתן לבצע שלב זה במהלך דיסוציאציה של הגידול כדי לייעל את יעילות הזמן ולמזער את משך אחסון תרחיף התאים על קרח.
2. ערכו בדיקה ויזואלית יסודית של כל עכבר כדי להעריך את כשירותו להזרקה. הערך אם יש סימנים של כאב, מצוקה, מחלה או התוויות נגד אחרות.
3. בעזרת מזרק של 1 מ"ל ללא מחט מחוברת, שאפו בעדינות את תרחיף התאים למעלה ולמטה כדי להבטיח הומוגניות. חבר מחט 26 גרם למזרק 1 מ"ל ומשוך את נפח ההזרקה הרצוי. הסר בועות אוויר מהמזרק על ידי הקשה עדינה או החלקה.
   הערה: מומלץ לא לחרוג מ-600 מיקרוליטר למזרק כדי להקל על הזרקה ביד אחת.
4. הנח את המזרק המוכן בצורה אופקית על גבי מיכל הקרח, כשהמחט מכוונת הרחק מהמפעיל. מקם את מיכל הקרח והמחט באותו צד של היד הדומיננטית של המפעיל או יד ההזרקה המועדפת. הסר את העכבר מביתו וחטא את אזור ההזרקה באמצעות כרית לניקוי אלכוהול.
5. רסנו היטב את העכבר על ידי אחיזה בחוזקה בעור הגב בעורף ובגב. הקפידו על קיבוע מספיק כדי לחשוף בבירור את רפידות השומן החלביות. כרית השומן המפשעתית משתרעת מהפטמה ועד לחלק העליון של הירך. ניתן להבחין בו כרקמה רכה ורדרדה, באזור המתואר מתחת לעור.
   הערה: עוזר מפעיל עשוי להשתמש במלקחיים שטוחים כדי לצבוט ולהרים את העור המכיל את כרית השומן. טכניקה זו עוזרת להבטיח שהמפעיל המבצע את ההזרקה מכוון בהצלחה לכרית השומן.
6. הנח את העכבר במצב שכיבה. הכנס את המחט (שיפוע כלפי מעלה) בזווית של 45 מעלות, מצביע לכיוון הירך כ-0.5-1 ס"מ זנב לכרית השומן, תוך התאמה לאורך המחט.
   1. מקדמים את המחט לתוך כרית השומן. בצורה מבוקרת, הזרקו את הנפח הרצוי של תרחיף התאים. מהירות הזרקה יעילה תעזור למזער את תסיסה של בעלי חיים מריסון ממושך.
      הערה: כדי למזער את מצוקת בעלי החיים, משך הזמן המרבי של ריסון ידני מתמשך לא יעלה על 30 שניות. אם משך הריסון עולה על 30 שניות, יש לשחרר את החיה לכלוב כדי להתאושש לפני ניסיון שני.
7. לאחר ההזרקה, סובב את המחט 180 מעלות (שיפוע כלפי מטה). שמור על מיקום המחט לזמן קצר לפני נסיגה איטית כדי למזער את אובדן התאים מאתר ההזרקה. אם מתרחש דימום כלשהו, יש למרוח גזה רגילה או גזה המוסטטית לפי הצורך.
8. חזור על שלבים 2.6 ו-2.7 עבור כרית השומן הנגדית אם יש צורך בזריקות דו-צדדיות. עבור בעלי חיים מרובים, חזור על שלבים 2.2-2.7 לפי הצורך.

3. נהלי מעקב

1. השלך את כל החדים למיכלים חדים ייעודיים. השלך את כל שאר התכולה למיכלי פסולת מתאימים.
2. אם מתרחש דימום במהלך ההזרקה, עקוב אחר עכברים לפחות שעה אחת לאחר מכן כדי להבטיח המוסטזיס.
3. עקוב אחר מסת הגוף על בסיס שבועי. העריכו את נפח הגידול ברגע שהצמיחה הופכת מוחשית.

תוצאות

מחקר זה מתאר גישה יעילה ולא כירורגית להשתלה אורתוטופית של השתלות סרטן שד שמקורן בחולה בעכברים. רקמת גידול השד פורקה באמצעות אנזימים ספציפיים לאדם ותסיסה מכנית, הושעה מחדש ביחס של 1:1 v/v של Matrigel: RPMI 1640, והוזרקה אורתוטופית לתוך כריות השומן המפשעתי של עכברי N...

Discussion

מאמר זה מציג שיטה יעילה ובעלת תפוקה גבוהה להשתלה אורתוטופית של BC PDX לתוך כריות השומן המפשעתי של עכברים חסרי חיסון. זרימת עבודה אופטימלית זו מאפשרת לחוקר היחיד להשתיל PDX בעשרות עכברים ביום, ולתמוך במחקרים בקנה מידה גדול ובעלי עוצמה מספקת. היכולת לנתק ולהשתיל בו זמנית מספר ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe	BD	305945	sterile
1x phosphate buffered saline, pH 7.4	Gibco	10010023	sterile
2.0 mL round-bottom microcentrifuge tube	Eppendorf	0030123620	sterile
26 G needle, ½ in.	BD	305111	sterile
5.0 mL microtube	Eppendorf	0030119401	sterile
8+ week old NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	The Jackson Laboratory	#005557
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Basement membrane extract (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Cotton-tipped applicators, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553	sterile
Curved Forceps with Medium Non-serrated Tips, 152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	sterile
Depilatory cream	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociator with heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
No. 10 scalpel blades	Fisher Scientific	12-000-162	sterile
Non-woven gauze sponges, 4x4 inch	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutamine	Gibco	11875093	sterile
Tumor dissociation kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929