Dissociation à haut débit et implantation orthotopique de xénogreffes dérivées de patientes atteintes d’un cancer du sein

Résumé

Ce protocole décrit une méthode efficace et non chirurgicale pour l’implantation orthotopique de xénogreffes dérivées de patientes atteintes d’un cancer du sein chez la souris. La technique implique une dissociation enzymatique de la tumeur suivie d’une injection directe dans les coussinets adipeux mammaires, permettant une implantation à haut débit. Une validation complète garantit la fidélité du modèle, ce qui facilite des études rigoureuses sur divers sous-types de cancer du sein.

Résumé

Les xénogreffes dérivées de patients (PDX) constituent une méthode cliniquement pertinente pour récapituler les types de cellules impliquées dans les tumeurs et le microenvironnement tumoral, ce qui est essentiel pour faire progresser les connaissances sur le cancer du sein (BC). De plus, les modèles PDX permettent d’étudier les effets systémiques de la BC, ce qui n’est pas possible avec des modèles in vitro. Les méthodes traditionnelles d’implantation de xénogreffes de cellules de base impliquent généralement une anesthésie et des procédures chirurgicales stériles, qui prennent du temps, sont invasives et limitent l’évolutivité des modèles PDX dans la recherche sur la chirurgie de co-production. Ce protocole décrit une méthode simple et évolutive pour l’implantation orthotopique de BC PDX chez la souris. La souche de souris immunodéficiente NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) a été utilisée pour la greffe de PDX. Des échantillons de cellules basales humaines prélevés sur des patients ayant obtenu le consentement de l’IRB ont été dissociés mécaniquement et enzymatiquement, puis remis en suspension dans une solution d’extrait de membrane basale (BME) et de RPMI 1640. Les animaux ont été immobilisés par égratignage, et une crème dépilatoire a été appliquée pour enlever les poils des coussinets adipeux au quatrième mamelon inguinal, suivie d’une injection. Environ 2 millions de cellules dans une suspension de 100 μL ont été injectées orthotopiquement dans les coussinets adipeux mammaires à l’aide d’une aiguille de 26 G. Notamment, aucun anesthésique n’a été nécessaire et la durée totale de la procédure a été inférieure à 5 minutes, de la préparation des cellules à l’injection. Après une période de croissance de plusieurs mois, les tumeurs ont été excisées et traitées pour l’authentification. La validation comprenait l’évaluation de l’état des récepteurs à l’aide de l’immunohistochimie avec des anticorps spécifiques pour les récepteurs BC traditionnels (c.-à-d. ER, PR, HER2). La morphologie tumorale a été confirmée par une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E), qui a été interprétée par un pathologiste. La similitude génétique avec l’échantillon du patient a été vérifiée par séquençage de l’ARN en vrac et analyse de courtes répétitions en tandem (STR). Cette approche de la greffe et de la validation PDX soutient le développement rigoureux de modèles et l’implantation de tumeurs à haut débit, permettant des études bien puissantes sur divers sous-types de BC.

Introduction

Le cancer du sein (CB) est diagnostiqué chez plus de 2 millions de femmes dans le monde chaque année¹. Afin de faire progresser la compréhension biologique de base de la canicule céveineuse et de traduire avec succès les nouvelles thérapies en traitements approuvés, des modèles animaux précliniques qui conservent les caractéristiques déterminantes des tumeurs des patients sont nécessaires. Il a été démontré que les xénogreffes dérivées de patients (PDX) récapitulent l’hétérogénéité tumorale avec une grande fidélité lorsqu’elles sont implantées orthotopiquement, y compris l’histopathologie, l’expression des récepteurs et les aberrations génétiques ^2,3,4. Il est important de noter qu’ils conservent également les cellules stromales qui contribuent au microenvironnement de la tumeur, telles que le système vasculaire, les cellules immunitaires et les fibroblastes associés au cancer. Cependant, ils sont progressivement remplacés par des cellules stromales hôtes murines avec^{passage 5}. Les PDX permettent également d’étudier les complications systémiques résultant de la croissance tumorale, telles que la fatigue ^6,7, ce qui n’est actuellement pas possible avec des modèles in vitro.

Cependant, la réussite de la greffe de BC PDX nécessite une souche de souris immunodéficiente, la souche la plus couramment utilisée étant NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ). Les souris NSG sont dépourvues d’immunité adaptative et présentent une immunité innée très défectueuse⁸. La greffe BC PDX a été réalisée dans d’autres souches immunodéficientes, telles que SCID/Beige (CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/Crl), avec des taux de greffe similaires⁴.

Les méthodes traditionnelles d’implantation de BC PDX impliquent l’implantation chirurgicale d’un fragment de tumeur dans le coussinet adipeux mammaire⁹, et cette approche conduit à une greffe réussie à des taux favorables. Cependant, la nécessité de procédures chirurgicales stériles et l’utilisation d’anesthésiques la rendent chronophage, limitant ainsi le nombre de souris pouvant être implantées dans une certaine fenêtre de temps. Compte tenu des avantages prédictifs potentiels des PDX en termes de réponses médicamenteuses dans les tumeurs et de leur utilisation en médecine de précision¹⁰, il est essentiel de disposer d’un flux de travail simple et reproductible pour implanter les PDX de manière homogène sur des souris. Cet article démontre la dissociation des tumeurs mammaires humaines en une suspension cellulaire unique et l’injection orthotopique ultérieure dans les coussinets adipeux mammaires de souris immunodéficientes.

Protocole

Ce protocole respecte les directives établies par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie-Occidentale (WVU). Des souris femelles NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG), âgées de 8 semaines ou plus et pesant environ 25 g, ont été utilisées pour des injections de cellules tumorales. Des tissus tumoraux pour le cancer du sein ont été prélevés à l’Institut du cancer de l’Université de Virginie-Occidentale (Morgantown, Virginie-Occidentale) et par le NCI Cooperative Human Tissue Network dans le cadre du protocole approuvé par le Conseil d’examen institutionnel de la WVU et le Comité d’examen et de surveillance du protocole de l’Institut du cancer de la WVU. Le consentement écrit éclairé des patients a été obtenu. Toutes les procédures ont été menées dans des conditions aseptiques à l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique de classe II, conformément aux protocoles appropriés d’équipement de protection individuelle (EPI). Les détails des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont fournis dans la table des matériaux.

1. Dissociation enzymatique à haut débit du tissu tumoral

1. Décongelez et combinez les enzymes H, R et A du kit de dissociation de la tumeur humaine dans un tube C stérile. Ajouter 200 μL d’enzyme H, 100 μL d’enzyme R et 25 μL d’enzyme A. Porter le volume final à ~5 mL en ajoutant 4,7 mL de milieu stérile RPMI 1640 dans le tube C.
   REMARQUE : Le Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco peut être utilisé à la place du RPMI 1640.
2. Les fragments de tumeur peuvent être coupés et congelés comme décrit dans les protocoles existants⁹. Transférez les fragments de tumeur décongelés et le milieu de congélation qui l’accompagne sur la moitié d’une boîte de culture stérile de 100 mm. À l’aide d’une pince stérile, transférez les fragments de tumeur dans un microtube stérile de 5 ml.
   REMARQUE : Une aiguille hypodermique stérile peut être utilisée comme alternative aux pinces. Une parabole de 35 mm peut être utilisée à la place d’un microtube de 5 ml.
3. Lavez les fragments de tumeur avec 1 à 3 ml de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS, 1x). Manipulez les fragments dans la solution à l’aide d’une pince pour assurer une élimination complète du fluide de congélation résiduel.
4. Transférez les fragments lavés dans un microtube de 2 ml à l’aide d’une pince. Appliquez 1 mL de solution d’antibiotique triple (TAB) sur les fragments de tumeur et incubez pendant 10 min à température ambiante.
   REMARQUE : Cette étape peut être sautée si vous le souhaitez. Le stock 10x TAB peut être fabriqué en dissolvant 1 % de gentamicine, 1 % de clindamycine et 0,5 % de sulfate de polymyxine B dans du PBS stérile 1x. Diluer à 1x solution TAB dans 1x PBS stérile.
5. À l’aide d’une pince stérile, transférez les fragments désinfectés dans un nouveau microtube de 5 ml. Effectuez un deuxième lavage avec 1 à 3 ml de PBS stérile. Transférez les fragments lavés dans la moitié sèche de la boîte de culture de 100 mm à partir de l’étape 1.2.
6. À l’aide de deux lames de scalpel stériles n° 10, hachez soigneusement le tissu tumoral. Transférez les fragments de tumeur hachés sur une lame et déposez-les dans le tube C contenant la solution enzymatique préparée. Fixez solidement le couvercle du tube jusqu’à ce qu’un dernier clic se fasse sentir.
7. Inversez le tube C plusieurs fois pour assurer une répartition uniforme des fragments de tumeur dans la solution enzymatique.
8. Placez le tube C dans le dissociateur mécanique. Retournez le tube et assurez-vous que tout le contenu est immergé dans le fluide. Le tube sera en position inversée dans la machine.
   1. Fixez le tube dans une fente avec la partie dentelée face à l’opérateur. Le cas échéant, placez le radiateur autour du tube.
9. Sélectionnez le programme 37C_h_TDK_3 dans l’interface de l’écran tactile. Ce programme fonctionne pendant 60 min à 37 °C. Pour les tumeurs plus molles, 37C_h_TDK_1 ou 2 peuvent être utilisés.
   REMARQUE : Pour une efficacité maximale, il est recommandé de préparer les souris à l’injection pendant cette période de dissociation en appliquant une crème dépilatoire sur les sites d’injection.
10. À la fin du programme de dissociation, inspectez le contenu du tube. Aucun fragment de tumeur visible ne doit rester.
    REMARQUE : Si des fragments sont présents, un temps de dissociation supplémentaire peut être nécessaire. Dans ce cas, exécutez le programme pendant 20 à 30 minutes supplémentaires.
11. Une fois la dissociation adéquate obtenue, centrifuger le tube C à 200 x g pendant 5 à 8 minutes à 4 °C pour granuler les cellules dissociées. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une aspiration intra-utérine ou d’une pipette.
12. Remettre la pastille en suspension dans 5 à 10 mL de milieu RPMI frais. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml pour faciliter la manipulation. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 à 8 min à 4 °C. Aspirez soigneusement le surnageant.
    REMARQUE : Cette étape peut être omise si la pastille de cellule est petite. Dans de tels cas, les cellules sont remises en suspension directement dans le volume de milieu souhaité, puis combinées avec un extrait de membrane basale (Matrigel) pour minimiser la perte de cellules.
13. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume de RPMI 1640, équivalent à la moitié du volume d’injection final souhaité. RPMI 1640 et Matrigel seront combinés dans un rapport v/v de 1:1, avec un volume d’injection final de 100 μL par site d’injection.
    REMARQUE : Pour une injection bilatérale chez 4 souris, le volume total requis est de 800 μL. Par conséquent, remettre les cellules en suspension dans au moins 400 μL de RPMI 1640. Pour tenir compte d’une perte de volume potentielle, il est conseillé d’ajouter 20 % supplémentaires au volume final, en maintenant le rapport v/v de 1:1. Alternativement, DMEM ou 1x PBS peuvent être utilisés à la place du RPMI 1640.
14. Comptez les cellules remises en suspension à l’aide d’un hémocytomètre ou d’une méthode automatisée. Diluer au besoin pour obtenir la concentration souhaitée pour l’injection. Un point de départ d’environ 1 à 2 millions de cellules par site d’injection est suggéré.
15. Dans un tube de microcentrifugation à fond rond de 2 ml, mélanger la quantité désirée de suspension cellulaire diluée dans RPMI avec un volume égal de Matrigel. Mélangez délicatement la suspension par pipetage répété pour assurer l’homogénéité.
    REMARQUE : Après l’étape précédente, ajoutez 400 μL de suspension cellulaire diluée à 400 μL de Matrigel. Tenez compte du nombre d’aiguilles d’injection à utiliser et tenez compte des pertes de volume associées. Gardez Matrigel sur la glace en tout temps. Ne le décongelez pas tant que les cellules ne sont pas remises en suspension, car il se solidifiera rapidement. Recommandé de conserver de petites aliquotes (p. ex., 120 μL) pour une décongélation rapide et une combinaison dans un tube de 2 mL.
16. Maintenir la suspension cellulaire sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être injectée.

2. Injection orthotopique du coussinet adipeux mammaire inguinal de PDX dissocié

1. Déterminez la masse de chaque souris à l’aide d’une balance calibrée. Appliquez une fine couche de crème dépilatoire sur le(s) site(s) d’injection cible(s). À l’aide d’un coton-tige stérile, massez la crème en alternant dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour faciliter l’épilation rapide.
   1. Retirez l’excès de poils et la crème dépilatoire à l’aide d’une éponge de gaze stérile imbibée de solution saline. Assurer une épilation complète au niveau de la zone d’injection.
      REMARQUE : Ne dépassez pas 60 s d’exposition à la crème dépilatoire pour éviter l’irritation de la peau. Les souris peuvent être rasées avant l’application de la crème dépilatoire pour minimiser davantage le temps d’exposition. Cette étape peut être effectuée lors de la dissociation tumorale afin d’optimiser l’efficacité du temps et de minimiser la durée de stockage des cellules en suspension sur glace.
2. Effectuez une inspection visuelle approfondie de chaque souris pour évaluer l’aptitude à l’injection. Évaluez tout signe de douleur, de détresse, de maladie ou d’autres contre-indications.
3. À l’aide d’une seringue de 1 mL sans aiguille attachée, aspirez doucement la suspension cellulaire de haut en bas pour assurer l’homogénéité. Fixez une aiguille de 26 g à la seringue de 1 mL et prélevez le volume d’injection souhaité. Éliminez les bulles d’air de la seringue en tapotant doucement ou en effleurant.
   REMARQUE : Il est recommandé de ne pas dépasser 600 μL par seringue pour faciliter l’injection d’une seule main.
4. Placez la seringue préparée horizontalement sur le récipient à glace, l’aiguille orientée à l’opposé de l’opérateur. Placez le récipient à glace et l’aiguille du même côté que la main dominante ou la main d’injection préférée de l’opérateur. Retirez la souris de son logement et désinfectez la zone d’injection à l’aide d’un tampon nettoyant à base d’alcool.
5. Retenez solidement la souris en saisissant fermement la peau dorsale au niveau de la nuque et du dos. Assurez-vous d’une immobilisation suffisante pour exposer clairement les coussinets adipeux mammaires. Le coussinet adipeux mammaire inguinal s’étend du mamelon au sommet de la hanche. Il peut être observé sous la forme d’un tissu mou et rosâtre dans la zone décrite sous la peau.
   REMARQUE : Un assistant opérateur peut utiliser des pinces à côtés plats pour pincer et élever la peau contenant le coussinet adipeux. Cette technique permet de s’assurer que l’opérateur qui effectue l’injection cible correctement le coussinet adipeux.
6. Placez la souris en position couchée. Insérez l’aiguille (biseau vers le haut) à un angle de 45 degrés, pointant vers la hanche à environ 0,5 à 1 cm caudale du coussinet adipeux, en ajustant la longueur de l’aiguille.
   1. Avancez l’aiguille dans le coussinet adipeux. De manière contrôlée, injectez le volume souhaité de suspension cellulaire. Une vitesse d’injection efficace aidera à minimiser l’agitation des animaux due à une contention prolongée.
      REMARQUE : Pour minimiser la détresse de l’animal, la durée maximale de la contention manuelle continue ne doit pas dépasser 30 s. Si la durée de contention dépasse 30 s, l’animal doit être relâché dans la cage pour récupérer avant une deuxième tentative.
7. Après l’injection, faites pivoter l’aiguille de 180 degrés (biseau vers le bas). Maintenez brièvement la position de l’aiguille avant le retrait lent pour minimiser la perte de cellules du site d’injection. En cas de saignement, appliquez de la gaze standard ou de la gaze hémostatique si nécessaire.
8. Répétez les étapes 2.6 et 2.7 pour le coussinet adipeux controlatéral si des injections bilatérales sont nécessaires. Pour plusieurs animaux, répétez les étapes 2.2 à 2.7 au besoin.

3. Procédures de suivi

1. Jetez tous les objets tranchants dans les contenants désignés pour objets tranchants. Jetez tout le reste du contenu dans des conteneurs à déchets appropriés.
2. Si un saignement se produit pendant l’injection, surveiller les souris pendant au moins 1 heure par la suite pour s’assurer de l’hémostase.
3. Surveillez la masse corporelle sur une base hebdomadaire. Évaluez le volume de la tumeur une fois que la croissance devient palpable.

Résultats

Cette étude décrit une approche efficace et non chirurgicale pour l’implantation orthotopique de xénogreffes de cancer du sein dérivées de patientes chez la souris. Le tissu tumoral du sein a été dissocié à l’aide d’enzymes spécifiques à l’homme et d’une agitation mécanique, remis en suspension dans un rapport v/v de 1:1 de Matrigel : RPMI 1640, et injecté orthotopiquement dans les coussinets adipeux mammaires inguinaux de souris N...

Discussion

Cet article présente une méthode efficace et à haut débit pour implanter orthotopiquement des PDX BC dans les coussinets adipeux mammaires inguinaux de souris immunodéficientes. Ce flux de travail optimisé permet à un seul chercheur d’implanter des PDX dans des dizaines de souris par jour, ce qui permet des études à grande échelle et suffisamment puissantes. La capacité de dissocier et d’implanter simultanément plusieurs PDX uniques permet également des approches d’onc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe	BD	305945	sterile
1x phosphate buffered saline, pH 7.4	Gibco	10010023	sterile
2.0 mL round-bottom microcentrifuge tube	Eppendorf	0030123620	sterile
26 G needle, ½ in.	BD	305111	sterile
5.0 mL microtube	Eppendorf	0030119401	sterile
8+ week old NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	The Jackson Laboratory	#005557
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Basement membrane extract (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Cotton-tipped applicators, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553	sterile
Curved Forceps with Medium Non-serrated Tips, 152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	sterile
Depilatory cream	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociator with heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
No. 10 scalpel blades	Fisher Scientific	12-000-162	sterile
Non-woven gauze sponges, 4x4 inch	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutamine	Gibco	11875093	sterile
Tumor dissociation kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929