Meme kanseri hasta kaynaklı ksenogreftlerin yüksek verimli dissosiyasyonu ve ortotopik implantasyonu

Özet

Bu protokol, farelerde meme kanseri hastasından türetilen ksenogreftlerin ortotopik implantasyonu için etkili, cerrahi olmayan bir yöntemi tanımlar. Teknik, enzimatik tümör ayrışmasını ve ardından meme yağ yastıkçıklarına doğrudan enjeksiyonu içerir ve yüksek verimli implantasyonu mümkün kılar. Kapsamlı doğrulama, çeşitli meme kanseri alt tiplerinde titiz çalışmaları kolaylaştırarak model aslına uygunluğunu sağlar.

Özet

Hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX'ler), meme kanseri (BC) bilgisini ilerletmek için gerekli olan, tümörle ilgili hücre tiplerini ve tümör mikroçevresini özetlemek için klinik olarak ilgili bir yöntem sağlar. Ek olarak, PDX modelleri, in vitro modeller kullanılarak mümkün olmayan BC sistemik etkilerinin incelenmesini sağlar. BC ksenogreftlerinin implante edilmesi için geleneksel yöntemler tipik olarak zaman alıcı, invaziv olan ve BC araştırmalarında PDX modellerinin ölçeklenebilirliğini sınırlayan anestezi ve steril cerrahi prosedürleri içerir. Bu protokol, farelerde BC PDX'lerin ortotopik implantasyonu için basit ve ölçeklenebilir bir yöntemi tanımlar. PDX aşılaması için immün yetmezliği olan fare suşu NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) kullanıldı. IRB onaylı hastalardan elde edilen insan BC örnekleri mekanik ve enzimatik olarak ayrıştırıldı, daha sonra bir bazal membran özütü (BME) ve RPMI 1640 çözeltisi içinde yeniden süspanse edildi. Hayvanlar tırmıklama ile zaptedildi ve dördüncü kasık meme ucundaki yağ yastıkçıklarından tüyleri çıkarmak için tüy dökücü krem uygulandı, ardından enjeksiyon yapıldı. 100 μL'lik bir süspansiyonda yaklaşık 2 milyon hücre, 26 G'lik bir iğne kullanılarak meme yağ yastıkçıklarına iki taraflı olarak ortotopik olarak enjekte edildi. Özellikle, anestezik gerekmedi ve hücre hazırlığından enjeksiyona kadar toplam işlem süresi 5 dakikanın altındaydı. Birkaç aylık bir büyüme döneminden sonra, tümörler eksize edildi ve kimlik doğrulama için işlendi. Doğrulama, geleneksel BC reseptörleri (ör., ER, PR, HER2) için spesifik antikorlarla immünohistokimya kullanılarak reseptör durum değerlendirmesini içeriyordu. Tümör morfolojisi hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması ile doğrulandı ve bu durum bir patolog tarafından yorumlandı. Hasta örneğine genetik benzerlik, toplu RNA dizilimi ve kısa tandem tekrar (STR) analizi ile doğrulandı. PDX aşılama ve validasyonuna yönelik bu yaklaşım, modellerin titiz bir şekilde geliştirilmesini ve yüksek verimli tümör implantasyonunu destekleyerek, çeşitli BC alt tiplerinde iyi güçlü çalışmalara olanak tanır.

Giriş

Meme kanseri (BC) her yıl dünya çapında 2 milyondan fazla kadında teşhis edilmektedir¹. BC'nin temel biyolojik anlayışını ilerletmek ve yeni terapötikleri onaylanmış tedavilere başarılı bir şekilde dönüştürmek için, hasta tümörlerinin tanımlayıcı özelliklerini koruyan klinik öncesi hayvan modelleri gereklidir. Hasta kaynaklı ksenogreftlerin (PDX'ler), histopatoloji, reseptör ekspresyonu ve genetik anormallikler dahil olmak üzere orttopik olarak implante edildiğinde tümör heterojenliğini yüksek doğrulukla özetlediği gösterilmiştir ^2,3,4. Daha da önemlisi, damar sistemi, bağışıklık hücreleri ve kanserle ilişkili fibroblastlar gibi tümörün mikro çevresine katkıda bulunan stromal hücreleri de tutarlar. Bununla birlikte, yavaş yavaş 5 ile murin konakçı stromal hücreler ile^{değiştirilirler.} PDX'ler ayrıca, şu anda in vitro modeller kullanılarak mümkün olmayan yorgunluk ^6,7 gibi tümör büyümesinden kaynaklanan sistemik komplikasyonların incelenmesini de sağlar.

Bununla birlikte, başarılı BC PDX aşılaması, en yaygın olarak kullanılan suş NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ) olmak üzere immün yetmezliği olan bir fare suşu gerektirir. NSG fareleri adaptif bağışıklıktan yoksundur ve oldukça kusurlu doğuştan gelen bağışıklık sergiler⁸. BC PDX aşılaması, SCID/Bej (CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/Crl) gibi diğer immün yetmezlik suşlarında benzer aşılama oranlarıyla elde edilmiştir⁴.

BC PDX'leri implante etmenin geleneksel yöntemleri, bir tümör parçasının meme yağ yastığına⁹ cerrahi olarak implante edilmesini içerir ve bu yaklaşım, uygun oranlarda başarılı bir aşılamaya yol açar. Bununla birlikte, steril cerrahi prosedürlere ve anestezik kullanımına duyulan ihtiyaç, onu zaman alıcı hale getirir, böylece belirli bir zaman aralığında implante edilebilecek fare sayısını sınırlar. PDX'lerin tümörlerdeki ilaç yanıtlarının ve hassas tıpta kullanımın potansiyel öngörücü faydaları göz önüne alındığında¹⁰, PDX'leri fareler arasında homojen bir şekilde implante etmek için basit ve tekrarlanabilir bir iş akışına sahip olmak hayati önem taşır. Bu makale, insan meme tümörlerinin tek hücreli bir süspansiyona ayrışmasını ve ardından immün yetmezliği olan farelerin meme yağ yastıklarına ortotopik enjeksiyonu göstermektedir.

Protokol

Bu protokol, West Virginia Üniversitesi (WVU) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen yönergelere bağlıdır. Tümör hücresi enjeksiyonları için 8 haftalık veya daha büyük yaşta ve yaklaşık 25 g ağırlığında dişi NOD.Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG) fareleri kullanıldı. Meme kanseri tümör dokusu, West Virginia Üniversitesi Kanser Enstitüsü'nde (Morgantown, WV) ve NCI Kooperatif İnsan Dokusu Ağı tarafından onaylanmış WVU Kurumsal İnceleme Kurulu protokolü ve WVU Kanser Enstitüsü Protokolü İnceleme ve İzleme Komitesi kapsamında temin edildi. Hastalardan bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Tüm prosedürler, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) protokolleri izlenerek Sınıf II biyolojik güvenlik kabini içinde aseptik koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Tümör dokusunun yüksek verimli enzimatik ayrışması

1. İnsan tümör ayrışma kitinden H, R ve A enzimlerini steril bir C-tüpünde çözün ve birleştirin. 200 μL enzim H, 100 μL enzim R ve 25 μL enzim A ekleyin. C-tüpüne 4.7 mL steril RPMI 1640 ortamı ekleyerek son hacmi ~ 5 mL'ye getirin.
   NOT: Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'u (DMEM), RPMI 1640 yerine kullanılabilir.
2. Tümör fragmanları mevcut protokol^9'da tarif edildiği gibi kesilebilir ve dondurulabilir. Çözülmüş tümör parçalarını ve beraberindeki dondurma ortamını 100 mm'lik steril bir kültür kabının yarısına aktarın. Steril forseps kullanarak, tümör parçalarını steril 5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.
   NOT: Forsepslere alternatif olarak steril bir hipodermik iğne kullanılabilir. 5 mL'lik bir mikrotüp yerine 35 mm'lik bir tabak kullanılabilir.
3. Tümör parçalarını 1-3 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS, 1x) ile yıkayın. Artık dondurma ortamının tamamen çıkarılmasını sağlamak için forseps kullanarak çözeltideki parçaları manipüle edin.
4. Yıkanan parçaları forseps kullanarak 2 mL'lik bir mikrotüpe aktarın. Tümör parçalarına 1 mL üçlü antibiyotik (TAB) solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
   NOT: İstenirse bu adım atlanabilir. %1 gentamisin, %1 klindamisin ve %0.5 polimiksin B sülfatın steril 1x PBS'de çözülmesiyle 10x TAB stoğu yapılabilir. Steril 1x PBS'de 1x TAB çözeltisine seyreltin.
5. Steril forseps kullanarak, dezenfekte edilmiş parçaları yeni bir 5 mL mikrotüpe aktarın. 1-3 mL steril PBS ile ikinci bir yıkama yapın. Yıkanan parçaları, adım 1.2'den itibaren 100 mm'lik kültür kabının kuru yarısına aktarın.
6. İki steril No. 10 neşter bıçağı kullanarak, tümör dokusunu iyice kıyın. Kıyılmış tümör parçalarını bir bıçağa aktarın ve bunları hazırlanan enzim çözeltisini içeren C-tüpüne yerleştirin. Son bir tık sesi hissedilene kadar tüp kapağını güvenli bir şekilde sabitleyin.
7. Enzim çözeltisi içinde tümör parçalarının eşit dağılımını sağlamak için C-tüpünü birkaç kez ters çevirin.
8. C-tüpünü mekanik ayırıcıya yerleştirin. Tüpü ters çevirin ve tüm içeriğin ortama daldırıldığından emin olun. Tüp, makinede ters konumda olacaktır.
   1. Boruyu, girintili kısım operatöre bakacak şekilde bir yuvaya sabitleyin. Varsa, ısıtıcıyı borunun etrafına yerleştirin.
9. Dokunmatik ekran arayüzünden 37C_h_TDK_3 programını seçin. Bu program 37 °C'de 60 dakika boyunca çalışır. Daha yumuşak tümörler için 37C_h_TDK_1 veya 2 kullanılabilir.
   NOT: En yüksek verim için, farelerin bu ayrışma döneminde enjeksiyon bölgelerine tüy dökücü krem sürülerek enjeksiyona hazırlanmaları önerilir.
10. Ayrışma programının tamamlanmasının ardından, tüp içeriğini inceleyin. Görünür tümör parçaları kalmamalıdır.
    NOT: Parçalar varsa, ek ayrışma süresi gerekebilir. Bu gibi durumlarda, programı 20-30 dakika daha çalıştırın.
11. Yeterli ayrışma sağlandıktan sonra, ayrışmış hücreleri peletlemek için C-tüpünü 200 x g'da 4 ° C'de 5-8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı vakum aspirasyonu veya pipet kullanarak dikkatlice çıkarın.
12. Hücre peletini 5-10 mL taze RPMI ortamında yeniden süspanse edin. Daha kolay manipülasyon için hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 200 x g'da 4 ° C'de 5-8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin.
    NOT: Hücre peleti küçükse bu adım atlanabilir. Bu gibi durumlarda, hücreler doğrudan istenen hacimde yeniden süspanse edilir ve daha sonra hücre kaybını en aza indirmek için bazal membran özütü (Matrigel) ile birleştirilir.
13. Hücre peletini, istenen son enjeksiyon hacminin yarısına eşdeğer olan RPMI 1640'lık bir hacimde yeniden süspanse edin. RPMI 1640 ve Matrigel, enjeksiyon bölgesi başına 100 μL'lik bir nihai enjeksiyon hacmi ile 1: 1 v / v oranında birleştirilecektir.
    NOT: 4 farede bilateral enjeksiyon için gereken toplam hacim 800 μL'dir. Bu nedenle, hücreleri en az 400 μL RPMI 1640 içinde yeniden süspanse edin. Potansiyel hacim kaybını hesaba katmak için, 1:1 v/v oranını koruyarak nihai hacme %20 daha eklenmesi önerilir. Alternatif olarak, RPMI 1640 yerine DMEM veya 1x PBS kullanılabilir.
14. Bir hemositometre veya otomatik yöntem kullanarak yeniden askıya alınan hücreleri sayın. Enjeksiyon için istenen konsantrasyonu elde etmek için gerektiği kadar seyreltin. Enjeksiyon bölgesi başına yaklaşık 1-2 milyon hücrelik bir başlangıç noktası önerilmektedir.
15. 2 mL'lik yuvarlak tabanlı bir mikrosantrifüj tüpünde, RPMI'de istenen miktarda seyreltilmiş hücre süspansiyonunu eşit hacimde Matrigel ile birleştirin. Homojenliği sağlamak için süspansiyonu tekrar tekrar pipetleyerek nazikçe karıştırın.
    NOT: Önceki adımı takiben, 400 μL Matrigel'e 400 μL seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. Kullanılacak enjeksiyon iğnelerinin sayısını göz önünde bulundurun ve ilgili hacim kayıplarını hesaba katın. Matrigel'i her zaman buz üzerinde tutun. Hücreler yeniden süspanse edilene kadar çözmeyin, çünkü hızlı bir şekilde katılaşacaktır. 2 mL'lik tüpte hızlı çözülme ve kombinasyon için küçük alikotların (örn., 120 μL) korunması önerilir.
16. Enjeksiyona hazır olana kadar hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutun.

2. Dissosiyated PDX'in ortotopik kasık meme yağ yastığı enjeksiyonu

1. Kalibre edilmiş bir terazi kullanarak her farenin kütlesini belirleyin. Hedef enjeksiyon bölge(ler)ine ince bir tabaka tüy dökücü krem sürün. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, kürkün hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırmak için kreme saat yönünde ve saat yönünün tersine değişen hareketlerle masaj yapın.
   1. Steril tuzlu suya batırılmış gazlı bez süngeri kullanarak fazla kürkü ve tüy dökücü kremi çıkarın. Enjeksiyon bölgesinde epilasyonun tamamen yapıldığından emin olun.
      NOT: Cilt tahrişini önlemek için tüy dökücü krem maruziyetini 60 saniyeyi aşmayın. Maruz kalma süresini daha da en aza indirmek için tüy dökücü krem uygulanmadan önce fareler tıraş edilebilir. Bu adım, zaman verimliliğini optimize etmek ve buz üzerinde hücre süspansiyonu depolama süresini en aza indirmek için tümör ayrışması sırasında gerçekleştirilebilir.
2. Enjeksiyona uygunluğu değerlendirmek için her farenin kapsamlı bir görsel incelemesini yapın. Herhangi bir ağrı belirtisi olup olmadığını değerlendirin, sıkıntı, hastalık, veya diğer kontrendikasyonlar.
3. Takılı bir iğne olmadan 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, homojenliği sağlamak için hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı nazikçe aspire edin. 1 mL şırıngaya 26 G'lik bir iğne takın ve istenen enjeksiyon hacmini geri çekin. Hafifçe vurarak veya hafifçe vurarak şırıngadaki hava kabarcıklarını ortadan kaldırın.
   NOT: Tek elle enjeksiyonu kolaylaştırmak için şırınga başına 600 μL'yi aşmamanız önerilir.
4. Hazırlanan şırıngayı, iğne operatörden uzağa bakacak şekilde buz kabının üzerine yatay olarak yerleştirin. Buz kabını ve iğneyi, operatörün baskın eli veya tercih ettiği enjeksiyon eli ile aynı tarafa yerleştirin. Fareyi yuvasından çıkarın ve bir alkol temizleme pedi kullanarak enjeksiyon alanını dezenfekte edin.
5. Sırt derisini ense ve sırttan sıkıca kavrayarak fareyi güvenli bir şekilde tutun. Meme yağ yastıkçıklarını net bir şekilde ortaya çıkarmak için yeterli immobilizasyon sağlayın. Kasık meme yağ yastığı meme başından kalçanın tepesine kadar uzanır. Deri altında tarif edilen bölgede yumuşak, pembemsi bir doku olarak gözlenebilir.
   NOT: Bir yardımcı operatör, yağ yastığını içeren cildi sıkıştırmak ve yükseltmek için düz kenarlı forseps kullanabilir. Bu teknik, enjeksiyonu gerçekleştiren operatörün yağ pedini başarılı bir şekilde hedeflemesini sağlamaya yardımcı olur.
6. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin. İğneyi (eğim yukarı) 45 derecelik bir açıyla, kalçaya doğru yağ yastığına yaklaşık 0,5-1 cm kaudal bakacak şekilde yerleştirin ve iğne uzunluğunu ayarlayın.
   1. İğneyi yağ yastığının içine ilerletin. Kontrollü bir şekilde, istenen hacimde hücre süspansiyonu enjekte edin. Verimli enjeksiyon hızı, uzun süreli kısıtlamadan kaynaklanan hayvan ajitasyonunu en aza indirmeye yardımcı olacaktır.
      NOT: Hayvan sıkıntısını en aza indirmek için, sürekli manuel kısıtlamanın maksimum süresi 30 saniyeyi geçmemelidir. Kısıtlama süresi 30 saniyeyi aşarsa, hayvan ikinci bir denemeden önce iyileşmesi için kafese bırakılmalıdır.
7. Enjeksiyondan sonra iğneyi 180 derece döndürün (eğim aşağı). Enjeksiyon bölgesinden hücre kaybını en aza indirmek için yavaş çekilmeden önce iğne pozisyonunu kısa bir süre koruyun. Herhangi bir kanama olursa, gerektiği gibi standart gazlı bez veya hemostatik gazlı bez uygulayın.
8. Bilateral enjeksiyonlar gerekiyorsa, kontralateral yağ yastığı için 2.6 ve 2.7 adımlarını tekrarlayın. Birden fazla hayvan için, 2.2-2.7 adımlarını gerektiği kadar tekrarlayın.

3. Takip prosedürleri

1. Tüm kesici aletleri belirtilen kesici alet kaplarına atın. Diğer tüm içerikleri uygun atık kaplarına atın.
2. Enjeksiyon sırasında kanama meydana gelirse, hemostazı sağlamak için fareleri en az 1 saat izleyin.
3. Vücut kütlesini haftalık olarak izleyin. Büyüme hissedilir hale geldiğinde tümör hacmini değerlendirin.

Sonuçlar

Bu çalışma, farelerde hasta kaynaklı meme kanseri ksenogreftlerinin ortotopik implantasyonu için etkili ve cerrahi olmayan bir yaklaşımı özetlemektedir. Meme tümör dokusu, insana özgü enzimler ve mekanik ajitasyon kullanılarak ayrıştırıldı, Matrigel: RPMI 1640'ın 1: 1 v / v oranında yeniden süspanse edildi ve NSG farelerinin kasık meme yağ yastıklarına orttopik olarak enjekte edildi (Şekil 1 ve

Tartışmalar

Bu makale, immün yetmezliği olan farelerin kasık meme yağ yastıklarına BC PDX'leri ortototopik olarak implante etmek için verimli, yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Bu optimize edilmiş iş akışı, tek bir araştırmacının PDX'leri günde düzinelerce fareye implante etmesini sağlayarak büyük ölçekli ve yeterli güçte çalışmaları destekler. Birden fazla benzersiz PDX'i aynı anda ayrıştırma ve implante etme kapasitesi, hassas onkoloji yaklaşımlarını da...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe	BD	305945	sterile
1x phosphate buffered saline, pH 7.4	Gibco	10010023	sterile
2.0 mL round-bottom microcentrifuge tube	Eppendorf	0030123620	sterile
26 G needle, ½ in.	BD	305111	sterile
5.0 mL microtube	Eppendorf	0030119401	sterile
8+ week old NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	The Jackson Laboratory	#005557
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Basement membrane extract (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Cotton-tipped applicators, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553	sterile
Curved Forceps with Medium Non-serrated Tips, 152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	sterile
Depilatory cream	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociator with heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
No. 10 scalpel blades	Fisher Scientific	12-000-162	sterile
Non-woven gauze sponges, 4x4 inch	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutamine	Gibco	11875093	sterile
Tumor dissociation kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929