Dissociação de alto rendimento e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama

Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente e não cirúrgico para a implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama em camundongos. A técnica envolve a dissociação enzimática do tumor seguida de injeção direta nas bolsas de gordura mamária, permitindo a implantação de alto rendimento. A validação abrangente garante a fidelidade do modelo, facilitando estudos rigorosos em vários subtipos de câncer de mama.

Resumo

Os xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) fornecem um método clinicamente relevante para recapitular os tipos de células envolvidas no tumor e o microambiente tumoral, o que é essencial para o avanço do conhecimento do câncer de mama (CM). Além disso, os modelos PDX permitem o estudo dos efeitos sistêmicos do CB, o que não é possível usando modelos in vitro. Os métodos tradicionais para implantar xenoenxertos de BC geralmente envolvem anestesia e procedimentos cirúrgicos estéreis, que são demorados, invasivos e limitam a escalabilidade dos modelos PDX na pesquisa de CB. Este protocolo descreve um método simples e escalável para o implante ortotópico de BC PDXs em camundongos. A cepa de camundongo imunodeficiente NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) foi usada para enxerto de PDX. Amostras de BC humanas obtidas de pacientes consentidas com IRB foram mecanicamente e enzimaticamente dissociadas e, em seguida, ressuspensas em uma solução de extrato de membrana basal (BME) e RPMI 1640. Os animais foram contidos por scruffing e creme depilatório foi aplicado para remover os pelos das bolsas de gordura no quarto mamilo inguinal, seguido de injeção. Aproximadamente 2 milhões de células em uma suspensão de 100 μL foram injetadas bilateralmente ortotopicamente nas bolsas de gordura mamária usando uma agulha 26 G. Notavelmente, nenhum anestésico foi necessário e o tempo total do procedimento foi inferior a 5 min, desde a preparação da célula até a injeção. Após um período de crescimento de vários meses, os tumores foram excisados e processados para autenticação. A validação incluiu a avaliação do status do receptor usando imuno-histoquímica com anticorpos específicos para receptores BC tradicionais (ou seja, ER, PR, HER2). A morfologia do tumor foi confirmada com coloração de hematoxilina e eosina (H&E), que foi interpretada por um patologista. A similaridade genética com a amostra de pacientes foi verificada por meio de sequenciamento de RNA em massa e análise de repetição curta em tandem (STR). Essa abordagem para enxerto e validação de PDX suporta o desenvolvimento rigoroso de modelos e implantação de tumor de alto rendimento, permitindo estudos bem capacitados em vários subtipos de CB.

Introdução

O câncer de mama (CM) é diagnosticado em mais de 2 milhões de mulheres em todo o mundo a cada ano¹. Para avançar na compreensão biológica básica do CM e traduzir com sucesso novas terapias para tratamentos aprovados, são necessários modelos animais pré-clínicos que retenham as características definidoras dos tumores do paciente. Foi demonstrado que os xenoenxertos derivados de pacientes (PDXs) recapitulam a heterogeneidade do tumor com alta fidelidade quando implantados ortotopicamente, incluindo histopatologia, expressão de receptores e aberrações genéticas ^2,3,4. É importante ressaltar que eles também retêm células estromais que contribuem para o microambiente do tumor, como vasculatura, células imunes e fibroblastos associados ao câncer. Embora sejam gradualmente substituídos por células estromais hospedeiras murinas com passagem⁵. As PDXs também permitem o estudo de complicações sistêmicas decorrentes do crescimento tumoral, como a fadiga ^6,7, o que atualmente não é possível com o uso de modelos in vitro.

O enxerto BC PDX bem-sucedido, no entanto, requer uma cepa de camundongo imunodeficiente, com a cepa mais comumente usada sendo NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl / SzJ). Os camundongos NSG são desprovidos de imunidade adaptativa e exibem imunidade inata altamente defeituosa⁸. O enxerto de BC PDX foi alcançado em outras cepas imunodeficientes, como SCID/Beige (CB17.Cg-Prkdc^scidLyst^bg-J/Crl), com taxas de enxerto semelhantes⁴.

Os métodos tradicionais de implantação de BC PDXs envolvem a implantação cirúrgica de um fragmento tumoral na bolsa de gordura mamária⁹, e essa abordagem leva a um enxerto bem-sucedido em taxas favoráveis. No entanto, a necessidade de procedimentos cirúrgicos estéreis e uso de anestésicos torna isso demorado, limitando assim o número de camundongos que podem ser implantados em uma determinada janela de tempo. Dados os potenciais benefícios preditivos dos PDXs de respostas a medicamentos em tumores e uso em medicina de precisão¹⁰, é vital ter um fluxo de trabalho simples e reprodutível para implantar PDXs de forma homogênea em camundongos. Este artigo demonstra a dissociação de tumores de mama humanos em uma única suspensão celular e subsequente injeção ortotópica em bolsas de gordura mamárias de camundongos imunodeficientes.

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Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da West Virginia University (WVU). Camundongos fêmeas NOD.Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG), com 8 semanas ou mais e pesando aproximadamente 25 g, foram usados para injeções de células tumorais. O tecido tumoral do câncer de mama foi adquirido no West Virginia University Cancer Institute (Morgantown, WV) e pela NCI Cooperative Human Tissue Network sob o protocolo aprovado do WVU Institutional Review Board e o WVU Cancer Institute Protocol Review and Monitoring Committee. O consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes. Todos os procedimentos foram conduzidos em condições assépticas dentro de uma cabine de segurança biológica Classe II, seguindo protocolos apropriados de equipamentos de proteção individual (EPI). Os detalhes dos animais, reagentes e equipamentos usados neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Dissociação enzimática de alto rendimento do tecido tumoral

1. Descongele e combine as enzimas H, R e A do kit de dissociação de tumores humanos em um tubo C estéril. Adicione 200 μL de enzima H, 100 μL de enzima R e 25 μL de enzima A. Traga o volume final para ~ 5 mL adicionando 4,7 mL de meio estéril RPMI 1640 ao tubo C.
   NOTA: O Modified Eagle Medium (DMEM) da Dulbecco pode ser usado no lugar do RPMI 1640.
2. Os fragmentos tumorais podem ser cortados e congelados conforme descrito nos protocolos existentes⁹. Transferir fragmentos tumorais descongelados e o meio de congelação que o acompanha para a metade de uma placa de cultura estéril de 100 mm. Usando uma pinça estéril, transfira os fragmentos do tumor para um microtubo estéril de 5 mL.
   NOTA: Uma agulha hipodérmica estéril pode ser usada como alternativa à pinça. Um prato de 35 mm pode ser usado no lugar de um microtubo de 5 mL.
3. Lave os fragmentos tumorais com 1-3 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS, 1x). Manipule os fragmentos na solução usando uma pinça para garantir a remoção completa do meio de congelamento residual.
4. Transfira os fragmentos lavados para um microtubo de 2 mL usando uma pinça. Aplique 1 mL de solução tripla de antibiótico (TAB) nos fragmentos tumorais e incube por 10 min em temperatura ambiente.
   NOTA: Esta etapa pode ser ignorada, se desejado. O estoque 10x TAB pode ser feito dissolvendo 1% de gentamicina, 1% de clindamicina e 0,5% de sulfato de polimixina B em 1x PBS estéril. Diluir para solução 1x TAB em 1x PBS estéril.
5. Usando uma pinça estéril, transfira os fragmentos desinfetados para um novo microtubo de 5 mL. Faça uma segunda lavagem com 1-3 mL de PBS estéril. Transferir os fragmentos lavados para a metade seca da placa de cultura de 100 mm a partir do passo 1.2.
6. Usando duas lâminas de bisturi nº 10 estéreis, pique bem o tecido tumoral. Transfira os fragmentos tumorais picados para uma lâmina e deposite-os no tubo C contendo a solução enzimática preparada. Aperte bem a tampa do tubo até sentir um clique final.
7. Inverta o tubo C várias vezes para garantir uma distribuição uniforme dos fragmentos tumorais dentro da solução enzimática.
8. Coloque o tubo C no dissociador mecânico. Inverta o tubo e certifique-se de que todo o conteúdo esteja submerso no meio. O tubo estará em uma posição invertida na máquina.
   1. Prenda o tubo em uma ranhura com a parte recuada voltada para o operador. Se aplicável, coloque o aquecedor ao redor do tubo.
9. Selecione o programa 37C_h_TDK_3 na interface da tela sensível ao toque. Este programa opera por 60 min a 37 °C. Para tumores mais moles, 37C_h_TDK_1 ou 2 podem ser usados.
   NOTA: Para maior eficiência, recomenda-se que os camundongos sejam preparados para injeção durante este período de dissociação, aplicando creme depilatório nos locais de injeção.
10. Após a conclusão do programa de dissociação, inspecione o conteúdo do tubo. Nenhum fragmento tumoral visível deve permanecer.
    NOTA: Se houver fragmentos, pode ser necessário um tempo adicional de dissociação. Nesses casos, execute o programa por mais 20 a 30 minutos.
11. Uma vez alcançada a dissociação adequada, centrifugue o tubo C a 200 x g durante 5-8 min a 4 °C para granular as células dissociadas. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando aspiração a vácuo ou uma pipeta.
12. Ressuspenda o pellet celular em 5-10 mL de meio RPMI fresco. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL para facilitar a manipulação. Centrifugue a suspensão da célula a 200 x g durante 5-8 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
    NOTA: Esta etapa pode ser omitida se o pellet da célula for pequeno. Nesses casos, as células são ressuspensas diretamente no volume desejado de meio e, em seguida, combinadas com extrato de membrana basal (Matrigel) para minimizar a perda celular.
13. Ressuspenda o pellet celular em um volume de RPMI 1640, equivalente à metade do volume final de injeção desejado. RPMI 1640 e Matrigel serão combinados em uma proporção de 1:1 v/v, com um volume final de injeção de 100 μL por local de injeção.
    NOTA: Para injeção bilateral em 4 camundongos, o volume total necessário é de 800 μL. Portanto, ressuspenda as células em pelo menos 400 μL de RPMI 1640. Para contabilizar a perda de volume potencial, é aconselhável adicionar mais 20% ao volume final, mantendo a relação 1:1 v/v. Alternativamente, DMEM ou 1x PBS podem ser usados no lugar do RPMI 1640.
14. Conte as células ressuspensas usando um hemocitômetro ou método automatizado. Diluir conforme necessário para atingir a concentração desejada para a injeção. Sugere-se um ponto de partida de aproximadamente 1-2 milhões de células por local de injeção.
15. Em um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL, combine a quantidade desejada de suspensão de células diluídas em RPMI com um volume igual de Matrigel. Misture suavemente a suspensão por pipetagem repetida para garantir a homogeneidade.
    NOTA: Seguindo a etapa anterior, adicione 400 μL de suspensão celular diluída a 400 μL de Matrigel. Considere o número de agulhas de injeção a serem usadas e considere as perdas de volume associadas. Mantenha Matrigel no gelo o tempo todo. Não descongele até que as células sejam ressuspensas, pois ele se solidificará rapidamente. Recomendado para manter pequenas alíquotas (por exemplo, 120 μL) para descongelamento rápido e combinação em tubo de 2 mL.
16. Mantenha a suspensão celular congelada até estar pronta para a injeção.

2. Injeção ortotópica de almofada de gordura mamária inguinal de PDX dissociado

1. Determine a massa de cada mouse usando uma balança calibrada. Aplique uma fina camada de creme depilatório no(s) local(is) de injeção alvo. Usando um cotonete estéril, massageie o creme alternadamente no sentido horário e anti-horário para facilitar a remoção rápida do pelo.
   1. Remova o excesso de pelo e o creme depilatório usando uma esponja de gaze estéril embebida em solução salina. Garanta a depilação completa na área de injeção.
      NOTA: Não exceda 60 s de exposição ao creme depilatório para evitar irritação da pele. Os ratos podem ser barbeados antes da aplicação do creme depilatório para minimizar ainda mais o tempo de exposição. Esta etapa pode ser realizada durante a dissociação do tumor para otimizar a eficiência do tempo e minimizar a duração do armazenamento da suspensão celular no gelo.
2. Realize uma inspeção visual completa de cada camundongo para avaliar a aptidão para a injeção. Avalie quaisquer sinais de dor, angústia, doença ou outras contra-indicações.
3. Usando uma seringa de 1 mL sem agulha acoplada, aspire suavemente a suspensão celular para cima e para baixo para garantir a homogeneidade. Coloque uma agulha de 26 G na seringa de 1 ml e retire o volume de injeção pretendido. Elimine quaisquer bolhas de ar da seringa batendo suavemente ou sacudindo suavemente.
   NOTA: Recomenda-se não exceder 600 μL por seringa para facilitar a injeção com uma mão.
4. Coloque a seringa preparada horizontalmente em cima do recipiente de gelo, com a agulha orientada para longe do operador. Posicione o recipiente de gelo e a agulha do mesmo lado da mão dominante do operador ou da mão de injeção preferida. Remova o mouse de seu alojamento e desinfete a área de injeção usando uma almofada de limpeza com álcool.
5. Contenha o mouse com segurança segurando a pele dorsal firmemente na nuca e nas costas. Garanta imobilização suficiente para expor claramente as bolsas de gordura mamárias. A almofada de gordura mamária inguinal se estende do mamilo até o topo do quadril. Pode ser observado como tecido macio e rosado na área descrita sob a pele.
   NOTA: Um operador assistente pode usar uma pinça de lado plano para beliscar e elevar a pele que contém a almofada de gordura. Essa técnica ajuda a garantir que o operador que realiza a injeção atinja com sucesso a almofada de gordura.
6. Coloque o mouse em decúbito dorsal. Insira a agulha (chanfrar para cima) em um ângulo de 45 graus, apontando para o quadril aproximadamente 0,5-1 cm caudal à almofada de gordura, ajustando o comprimento da agulha.
   1. Avance a agulha para a almofada de gordura. De forma controlada, injetar o volume desejado de suspensão celular. A velocidade de injeção eficiente ajudará a minimizar a agitação animal devido à contenção prolongada.
      NOTA: Para minimizar o sofrimento do animal, a duração máxima da contenção manual contínua não deve exceder 30 s. Se a duração da contenção exceder 30 s, o animal deve ser solto na gaiola para se recuperar antes de uma segunda tentativa.
7. Após a injeção, gire a agulha 180 graus (chanfro para baixo). Mantenha a posição da agulha brevemente antes de retirar lentamente para minimizar a perda de células do local da injeção. Se ocorrer algum sangramento, aplique gaze padrão ou gaze hemostática conforme necessário.
8. Repita as etapas 2.6 e 2.7 para a bolsa de gordura contralateral se forem necessárias injeções bilaterais. Para vários animais, repita as etapas 2.2 a 2.7 conforme necessário.

3. Procedimentos de acompanhamento

1. Descarte todos os objetos cortantes em recipientes designados para objetos cortantes. Descarte todos os outros conteúdos em recipientes de lixo adequados.
2. Se ocorrer sangramento durante a injeção, monitore os camundongos por pelo menos 1 h depois para garantir a hemostasia.
3. Monitore a massa corporal semanalmente. Avalie o volume do tumor quando o crescimento se tornar palpável.

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Resultados

Este estudo descreve uma abordagem eficiente e não cirúrgica para o implante ortotópico de xenoenxertos de câncer de mama derivados de pacientes em camundongos. O tecido tumoral da mama foi dissociado usando enzimas humanas específicas e agitação mecânica, ressuspenso em uma proporção de 1:1 v/v de Matrigel: RPMI 1640 e injetado ortotopicamente nas bolsas de gordura mamárias inguinais de camundongos NSG (Figura 1 e...

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Discussão

Este artigo apresenta um método eficiente e de alto rendimento para implantar ortotopicamente BC PDXs nas bolsas de gordura mamárias inguinais de camundongos imunodeficientes. Esse fluxo de trabalho otimizado permite que um único pesquisador implante PDXs em dezenas de camundongos por dia, apoiando estudos em larga escala e com poder adequado. A capacidade de dissociar e implantar simultaneamente vários PDXs exclusivos também permite abordagens oncológicas de precisão. Além da ef...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe	BD	305945	sterile
1x phosphate buffered saline, pH 7.4	Gibco	10010023	sterile
2.0 mL round-bottom microcentrifuge tube	Eppendorf	0030123620	sterile
26 G needle, ½ in.	BD	305111	sterile
5.0 mL microtube	Eppendorf	0030119401	sterile
8+ week old NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	The Jackson Laboratory	#005557
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Basement membrane extract (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Cotton-tipped applicators, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553	sterile
Curved Forceps with Medium Non-serrated Tips, 152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	sterile
Depilatory cream	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociator with heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
No. 10 scalpel blades	Fisher Scientific	12-000-162	sterile
Non-woven gauze sponges, 4x4 inch	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutamine	Gibco	11875093	sterile
Tumor dissociation kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929