Disociación de alto rendimiento e implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama

Resumen

Este protocolo describe un método eficiente y no quirúrgico para la implantación ortotópica de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer de mama en ratones. La técnica consiste en la disociación enzimática del tumor seguida de una inyección directa en las almohadillas de grasa mamaria, lo que permite una implantación de alto rendimiento. La validación exhaustiva garantiza la fidelidad del modelo, lo que facilita estudios rigurosos en varios subtipos de cáncer de mama.

Resumen

Los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) proporcionan un método clínicamente relevante para recapitular los tipos de células tumorales involucradas y el microambiente tumoral, que es esencial para avanzar en el conocimiento del cáncer de mama (CM). Además, los modelos PDX permiten el estudio de los efectos sistémicos de la BC, lo que no es posible con modelos in vitro. Los métodos tradicionales para implantar xenoinjertos de BC suelen implicar anestesia y procedimientos quirúrgicos estériles, que requieren mucho tiempo, son invasivos y limitan la escalabilidad de los modelos PDX en la investigación de BC. Este protocolo describe un método simple y escalable para la implantación ortotópica de BC PDX en ratones. Para el injerto de PDX se utilizó la cepa de ratón inmunodeficiente NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG). Las muestras humanas de BC obtenidas de pacientes con consentimiento del IRB se disociaron mecánica y enzimáticamente, y luego se resuspendieron en una solución de extracto de membrana basal (BME) y RPMI 1640. Los animales fueron inmovilizados mediante el desaliño y se aplicó crema depilatoria para eliminar el vello de las almohadillas de grasa en el cuarto pezón inguinal, seguido de una inyección. Aproximadamente 2 millones de células en una suspensión de 100 μL se inyectaron bilateralmente por vía ortotópica en las almohadillas de grasa mamaria utilizando una aguja de 26 G. En particular, no se requirió anestesia y el tiempo total del procedimiento fue de menos de 5 minutos, desde la preparación de la célula hasta la inyección. Después de un período de crecimiento de varios meses, los tumores se extirparon y se procesaron para su autenticación. La validación incluyó la evaluación del estado de los receptores mediante inmunohistoquímica con anticuerpos específicos para los receptores BC tradicionales (es decir, ER, PR, HER2). La morfología del tumor se confirmó con tinción de hematoxilina y eosina (H&E), que fue interpretada por un patólogo. La similitud genética con la muestra del paciente se verificó mediante secuenciación masiva de ARN y análisis de repeticiones cortas en tándem (STR). Este enfoque para el injerto y la validación de PDX respalda el desarrollo riguroso de modelos y la implantación de tumores de alto rendimiento, lo que permite estudios con buen poder estadístico en varios subtipos de BC.

Introducción

El cáncer de mama (CM) se diagnostica en más de 2 millones de mujeres en todo el mundo cada año¹. Con el fin de avanzar en la comprensión biológica básica de la CM y traducir con éxito las nuevas terapias a tratamientos aprobados, se necesitan modelos animales preclínicos que conserven las características definitorias de los tumores de los pacientes. Se ha demostrado que los xenoinjertos derivados del paciente (PDX) recapitulan la heterogeneidad tumoral con alta fidelidad cuando se implantan ortotópicamente, incluida la histopatología, la expresión del receptor y las aberraciones genéticas ^2,3,4. Es importante destacar que también retienen las células estromales que contribuyen al microambiente del tumor, como la vasculatura, las células inmunitarias y los fibroblastos asociados al cáncer. Sin embargo, son reemplazados gradualmente por células estromales del huésped murino con paso⁵. Las PDX también permiten el estudio de las complicaciones sistémicas derivadas del crecimiento tumoral, como la fatiga ^6,7, que actualmente no es posible con modelos in vitro.

Sin embargo, el éxito del injerto de BC PDX requiere una cepa de ratón inmunodeficiente, siendo la cepa más utilizada NSG (NOD.Cg-Prkdc^scid Il2rg^tm1Wjl/SzJ). Los ratones NSG están desprovistos de inmunidad adaptativa y exhiben una inmunidad innata altamente defectuosa⁸. El injerto de BC PDX se ha logrado en otras cepas inmunodeficientes, como SCID/Beige (CB17.Cg-Prkdc^{scidLyst bg-J}/Crl), con tasas de injerto similares⁴.

Los métodos tradicionales de implantación de BC PDX implican la implantación quirúrgica de un fragmento tumoral en la almohadilla de grasa mamaria⁹, y este enfoque conduce a un injerto exitoso a tasas favorables. Sin embargo, la necesidad de procedimientos quirúrgicos estériles y el uso de anestésicos hace que requiera mucho tiempo, lo que limita el número de ratones que se pueden implantar en un determinado período de tiempo. Dados los posibles beneficios predictivos de las PDX en las respuestas a los fármacos en los tumores y su uso en la medicina de precisión¹⁰, es vital contar con un flujo de trabajo sencillo y reproducible para implantar PDX de forma homogénea en ratones. Este artículo demuestra la disociación de tumores de mama humanos en una suspensión de una sola célula y la posterior inyección ortotópica en almohadillas de grasa mamaria de ratones inmunodeficientes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Este protocolo se adhiere a las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de West Virginia (WVU). Se utilizaron ratones hembra NOD.Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG), de 8 semanas o más y con un peso aproximado de 25 g, para las inyecciones de células tumorales. El tejido tumoral de cáncer de mama se obtuvo en el Instituto Oncológico de la Universidad de Virginia Occidental (Morgantown, WV) y por la Red Cooperativa de Tejido Humano del NCI bajo el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la WVU y el Comité de Revisión y Supervisión del Protocolo del Instituto del Cáncer de la WVU. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en condiciones asépticas dentro de un gabinete de seguridad biológica de Clase II, siguiendo los protocolos adecuados de equipo de protección personal (EPP). Los detalles de los animales, reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Disociación enzimática de alto rendimiento del tejido tumoral

1. Descongele y combine las enzimas H, R y A del kit de disociación de tumores humanos en un tubo C estéril. Agregue 200 μL de enzima H, 100 μL de enzima R y 25 μL de enzima A. Lleve el volumen final a ~5 mL agregando 4.7 mL de medio RPMI 1640 estéril al tubo C.
   NOTA: El medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco se puede utilizar en lugar de RPMI 1640.
2. Los fragmentos tumorales pueden cortarse y congelarse como se describe en los protocolos existentes⁹. Transfiera los fragmentos tumorales descongelados y el medio de congelación que los acompaña a la mitad de una placa de cultivo estéril de 100 mm. Con pinzas estériles, transfiera los fragmentos tumorales a un microtubo estéril de 5 ml.
   NOTA: Se puede utilizar una aguja hipodérmica estéril como alternativa a las pinzas. Se puede utilizar una placa de 35 mm en lugar de un microtubo de 5 mL.
3. Lave los fragmentos tumorales con 1-3 mL de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS, 1x). Manipule los fragmentos de la solución con pinzas para asegurar la eliminación completa del medio de congelación residual.
4. Transfiera los fragmentos lavados a un microtubo de 2 mL con pinzas. Aplique 1 mL de solución de antibiótico triple (TAB) a los fragmentos tumorales e incube durante 10 min a temperatura ambiente.
   NOTA: Este paso se puede omitir si lo desea. Se puede fabricar un caldo de TAB 10x disolviendo gentamicina al 1%, clindamicina al 1% y sulfato de polimixina B al 0,5% en PBS estéril 1x. Diluir a 1x solución de TAB en 1x PBS estéril.
5. Con pinzas estériles, transfiera los fragmentos desinfectados a un nuevo microtubo de 5 mL. Realice un segundo lavado con 1-3 mL de PBS estéril. Transfiera los fragmentos lavados a la mitad seca de la placa de cultivo de 100 mm del paso 1.2.
6. Con dos hojas de bisturí estériles No. 10, pique completamente el tejido tumoral. Transfiera los fragmentos tumorales picados a una cuchilla y deposítelos en el tubo C que contiene la solución enzimática preparada. Sujete firmemente la tapa del tubo hasta que se sienta un clic final.
7. Invierta el tubo C varias veces para asegurar una distribución uniforme de los fragmentos tumorales dentro de la solución enzimática.
8. Coloque el tubo C en el disociador mecánico. Invierta el tubo y asegúrese de que todo el contenido esté sumergido en el medio. El tubo estará en una posición invertida en la máquina.
   1. Asegure el tubo en una ranura con la parte dentada hacia el operador. Si corresponde, coloque el calentador alrededor del tubo.
9. Seleccione el programa 37C_h_TDK_3 en la interfaz de la pantalla táctil. Este programa funciona durante 60 minutos a 37 °C. Para tumores más blandos, se pueden usar 37C_h_TDK_1 o 2.
   NOTA: Para obtener la mayor eficiencia, se recomienda que los ratones estén preparados para la inyección durante este período de disociación mediante la aplicación de crema depilatoria en los sitios de inyección.
10. Una vez finalizado el programa de disociación, inspeccione el contenido del tubo. No deben quedar fragmentos tumorales visibles.
    NOTA: Si hay fragmentos, es posible que se requiera un tiempo de disociación adicional. En tales casos, ejecute el programa durante 20-30 minutos adicionales.
11. Una vez que se logre la disociación adecuada, centrifugue el tubo C a 200 x g durante 5-8 min a 4 °C para pellets las células disociadas. Retire con cuidado el sobrenadante mediante aspiración endouterina o una pipeta.
12. Vuelva a suspender el pellet de celda en 5-10 mL de medio RPMI fresco. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mL para facilitar la manipulación. Centrifugar la suspensión celular a 200 x g durante 5-8 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente el sobrenadante.
    NOTA: Este paso puede omitirse si el pellet de celda es pequeño. En tales casos, las células se resuspenden directamente en el volumen deseado de medios y luego se combinan con extracto de membrana basal (Matrigel) para minimizar la pérdida celular.
13. Vuelva a suspender el pellet de celda en un volumen de RPMI 1640, equivalente a la mitad del volumen de inyección final deseado. RPMI 1640 y Matrigel se combinarán en una proporción de 1:1 v/v, con un volumen de inyección final de 100 μL por sitio de inyección.
    NOTA: Para inyección bilateral en 4 ratones, el volumen total requerido es de 800 μL. Por lo tanto, vuelva a suspender las células en al menos 400 μL de RPMI 1640. Para tener en cuenta la posible pérdida de volumen, es aconsejable añadir un 20% adicional al volumen final, manteniendo la relación 1:1 v/v. Alternativamente, se puede utilizar DMEM o 1x PBS en lugar de RPMI 1640.
14. Cuente las células resuspendidas usando un hemocitómetro o un método automatizado. Diluir según sea necesario para lograr la concentración deseada para la inyección. Se sugiere un punto de partida de aproximadamente 1-2 millones de células por sitio de inyección.
15. En un tubo de microcentrífuga de fondo redondo de 2 mL, combine la cantidad deseada de suspensión celular diluida en RPMI con un volumen igual de Matrigel. Mezcle suavemente la suspensión mediante pipeteo repetido para garantizar la homogeneidad.
    NOTA: Siguiendo el paso anterior, añadir 400 μL de suspensión celular diluida a 400 μL de Matrigel. Tenga en cuenta el número de agujas de inyección que se utilizarán y tenga en cuenta las pérdidas de volumen asociadas. Mantén Matrigel en hielo en todo momento. No lo descongele hasta que las células se vuelvan a suspender, ya que se solidificará rápidamente. Se recomienda mantener alícuotas pequeñas (por ejemplo, 120 μL) para una descongelación rápida y combinación en un tubo de 2 mL.
16. Mantenga la suspensión celular en hielo hasta que esté lista para la inyección.

2. Inyección ortotópica de almohadilla de grasa mamaria inguinal de PDX disociado

1. Determine la masa de cada ratón utilizando una balanza calibrada. Aplique una capa delgada de crema depilatoria en el (los) sitio(s) de inyección objetivo. Con un bastoncillo de algodón estéril, masajee la crema con movimientos alternos en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj para facilitar la eliminación rápida del pelaje.
   1. Retire el exceso de pelo y la crema depilatoria con una esponja de gasa estéril empapada en solución salina. Asegure la depilación completa en el área de inyección.
      NOTA: No exceda los 60 segundos de exposición a la crema depilatoria para prevenir la irritación de la piel. Los ratones se pueden afeitar antes de la aplicación de la crema depilatoria para minimizar aún más el tiempo de exposición. Este paso se puede realizar durante la disociación tumoral para optimizar la eficiencia del tiempo y minimizar la duración del almacenamiento de la suspensión celular en hielo.
2. Realice una inspección visual exhaustiva de cada ratón para evaluar la aptitud para la inyección. Evalúe si hay signos de dolor, angustia, enfermedad u otras contraindicaciones.
3. Con una jeringa de 1 ml sin aguja adjunta, aspire suavemente la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo para garantizar la homogeneidad. Coloque una aguja de 26 g en la jeringa de 1 ml y extraiga el volumen de inyección deseado. Elimine las burbujas de aire de la jeringa dando golpecitos o movimientos suaves.
   NOTA: Se recomienda no exceder los 600 μL por jeringa para facilitar la inyección con una sola mano.
4. Coloque la jeringa preparada horizontalmente encima del recipiente de hielo, con la aguja orientada en dirección opuesta al operador. Coloque el recipiente de hielo y la aguja en el mismo lado que la mano dominante del operador o la mano de inyección preferida. Retire el ratón de su carcasa y desinfecte la zona de inyección con una almohadilla limpiadora con alcohol.
5. Sujete firmemente al ratón agarrando la piel dorsal firmemente por la nuca y la espalda. Asegure una inmovilización suficiente para exponer claramente las almohadillas de grasa mamaria. La almohadilla de grasa mamaria inguinal se extiende desde el pezón hasta la parte superior de la cadera. Se puede observar como un tejido blando y rosado en el área descrita debajo de la piel.
   NOTA: Un operador asistente puede usar pinzas de lados planos para pellizcar y elevar la piel que contiene la almohadilla de grasa. Esta técnica ayuda a garantizar que el operador que realiza la inyección se dirija con éxito a la almohadilla de grasa.
6. Coloque el ratón en posición supina. Inserte la aguja (biselada hacia arriba) en un ángulo de 45 grados, apuntando hacia la cadera aproximadamente 0,5-1 cm caudal a la almohadilla de grasa, ajustando la longitud de la aguja.
   1. Avance la aguja en la almohadilla de grasa. De forma controlada, inyectar el volumen deseado de suspensión celular. La velocidad de inyección eficiente ayudará a minimizar la agitación de los animales debido a la sujeción prolongada.
      NOTA: Para minimizar el sufrimiento del animal, la duración máxima de la sujeción manual continua no debe exceder los 30 s. Si la duración de la inmovilización supera los 30 s, el animal debe ser liberado en la jaula para que se recupere antes de un segundo intento.
7. Después de la inyección, gire la aguja 180 grados (bisel hacia abajo). Mantenga la posición de la aguja brevemente antes de la extracción lenta para minimizar la pérdida de células del sitio de inyección. Si se produce algún sangrado, aplique una gasa estándar o una gasa hemostática según sea necesario.
8. Repita los pasos 2.6 y 2.7 para la almohadilla de grasa contralateral si se requieren inyecciones bilaterales. Para varios animales, repita los pasos 2.2 a 2.7 según sea necesario.

3. Procedimientos de seguimiento

1. Deseche todos los objetos punzocortantes en los recipientes designados para objetos punzocortantes. Deseche todo el resto del contenido en contenedores de residuos adecuados.
2. Si se produce sangrado durante la inyección, vigile a los ratones durante al menos 1 hora después para asegurar la hemostasia.
3. Controla la masa corporal semanalmente. Evaluar el volumen del tumor una vez que el crecimiento se vuelve palpable.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Este estudio describe un enfoque eficiente y no quirúrgico para la implantación ortotópica de xenoinjertos de cáncer de mama derivados de pacientes en ratones. El tejido tumoral de mama se disoció utilizando enzimas específicas humanas y agitación mecánica, se resuspendió en una proporción de 1:1 v/v de Matrigel: RPMI 1640 y se inyectó ortotópicamente en las almohadillas de grasa mamaria inguinal de ratones NSG (Figura 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discusión

Este artículo presenta un método eficiente y de alto rendimiento para implantar ortotópicamente BC PDX en las almohadillas de grasa mamaria inguinal de ratones inmunodeficientes. Este flujo de trabajo optimizado permite a un solo investigador implantar PDX en docenas de ratones por día, lo que respalda estudios a gran escala y con la potencia adecuada. La capacidad de disociar e implantar simultáneamente múltiples PDX únicos también permite enfoques oncológicos de precisión. M?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL tuberculin syringe	BD	305945	sterile
1x phosphate buffered saline, pH 7.4	Gibco	10010023	sterile
2.0 mL round-bottom microcentrifuge tube	Eppendorf	0030123620	sterile
26 G needle, ½ in.	BD	305111	sterile
5.0 mL microtube	Eppendorf	0030119401	sterile
8+ week old NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	The Jackson Laboratory	#005557
Alcohol prep pads	Fisher Scientific	22-363-750	sterile
Basement membrane extract (Matrigel)	Cultrex	3632-005-02
Cotton-tipped applicators, 6 in.	Fisher Scientific	22-029-553	sterile
Curved Forceps with Medium Non-serrated Tips, 152 mm	Electron Microscopy Sciences	50-365-845	sterile
Depilatory cream	Nair
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237
gentleMACS Octo dissociator with heaters	Miltenyi Biotec	130-096-427
No. 10 scalpel blades	Fisher Scientific	12-000-162	sterile
Non-woven gauze sponges, 4x4 inch	Fisher Scientific	22-028-558	sterile
RPMI 1640 1x + L-Glutamine	Gibco	11875093	sterile
Tumor dissociation kit, human	Miltenyi Biotec	130-095-929