نهج شامل لعزل الميكروبات من أنفاق التهاب الغدد العرقية القيحي

Summary

نعرض طريقة لعزل الكائنات الحية الحساسة واللاهوائية بنجاح من المسالك الجيبية الجلدية (الأنفاق) في الأنسجة المستقاطة من المرضى الذين يعانون من التهاب الغدد العرقية القيحي.

Abstract

التهاب الغدد العرقية القيحي (HS) هو حالة منهكة تتميز بعقيدات وخراجات مؤلمة ، تتطور إلى المسالك الجيبية (الأنفاق) داخل طبقات الجلد ، مما يسبب إزعاجا كبيرا ، وإفرازات كريهة الرائحة ، وتشوه ، وتقلصات ، وتندب ، مما يقلل بشدة من نوعية الحياة. يرتبط النظام المنسق بتغيرات في ميكروبيوم الجلد ، مما يؤثر على تنظيم المناعة ودفاع الجلد ضد البكتيريا الضارة. على الرغم من انتشاره ، إلا أن مساهمة ميكروبيوم HS في أمراض المرض والاستجابة المحدودة للعلاج لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. حتى الآن ، حققت دراسات تسلسل 16S rRNA المتعددة على أنسجة HS حبيبات على مستوى الجنس فقط ، مما حدد زيادة في اللاهوائية سالبة الجرام وانخفاض في تكامل الجلد. يعد الفهم الأعمق لخلل الانحياض الميكروبي لدى الأفراد المصابين بالنظام البسيط أمرا ضروريا لتحسين استراتيجيات العلاج. يتطلب ذلك نهجا ذا شقين لتقييم ميكروبيوم HS ، بما في ذلك عزل الأنواع البكتيرية ، والتي غالبا ما تكون غير مستغلة بشكل كاف في الدراسات الانتقالية التي تركز على اضطرابات الجلد. يعد عزل الكائنات الحية الدقيقة الفردية عن أنسجة HS أمرا بالغ الأهمية لتوضيح دور البكتيريا في التسبب في HS. هنا ، نسلط الضوء على الطرق القابلة للتكرار لعزل مسببات الأمراض اللاهوائية بنجاح من أنسجة نفق HS ، مما يوفر الخطوة الأولية والأكثر أهمية في فهم الدور البكتيري في HS. تمهد هذه الطريقة الطريق لإجراء أبحاث مستهدفة في المساهمات الميكروبية في HS ولتطوير استراتيجيات علاج أكثر فعالية وشخصية تعالج العبء الميكروبي المعقد لهذه الحالة المزمنة.

Introduction

التهاب الغدد العرقية القيحي (HS) هو حالة جلدية شائعة تتميز بالعقيدات والخراجات التي تتطور إلى المسالك الجيبية (الأنفاق) التي تتشكل داخل الطبقات الجلدية وتحت الجلد ، مما يسبب ألما شديدا ، وينتج عنه إفرازات قيحية ، وتشوه ، وعواقب نفسية اجتماعية منهكة^1،2. يؤثر HS بشكل غير متناسب على النساء والأفراد ذوي البشرة الملونة ، وعادة ما يظهر في أواخر المراهقة أو أوائل مرحلة^{البلوغ 2}. تتفاقم الأعراض الجسدية الشديدة للحالة بسبب تأثيرها النفسي والاجتماعي العميق ، بما في ذلك الاكتئاب والقلق والعزلة الاجتماعية ، والتي يمكن أن تقلل بشدة من نوعية^{الحياة 3}. تقلل أنفاق HS التي تشكلت في مرحلة المرض المتقدمة بشكل كبير من احتمالات استجابة المرضى للعلاج البيولوجي المعتمد حاليا ، ويظل الاستئصال الجراحي هو نهج العلاج الوحيد^4،5.

تميزت دراسات متعددة بالميكروبيوم المرتبط بأنفاق HS ، مما يدل على انتشار مسببات الأمراض اللاهوائية وانخفاض وفرة الروابط الجلدية^6،7،8 ، مع الدراسات الحديثة التي حددت Porphyromonas spp. (النوع الأول) و Prevotella spp. (IV) في الأنفاق ، من بين أجناس أخرى⁹. وجدت دراسة أخرى تباينا في ميكروبيوم HS من خلال عمق أخذ عينات الأنسجة ، مما يؤكد تفرد التركيب الميكروبي في أنسجة النفق¹⁰. بالإضافة إلى ذلك ، ثبت أن dysbiosis يؤثر على الاستجابة المناعية في HS ، مما يزيد من تورط دور الميكروبات في التسبب في المرض^{11،12،13،14}. على الرغم من استخدام العلاج المطول بالمضادات الحيوية الجهازية باستخدام الكليندامايسين والريفامبيسين والتتراسيكلين وأظهر انخفاضا في عدد أنفاق التصريف في المرضى المصابين^15،16 ، إلا أن البيانات المتعلقة بمسببات الأمراض اللاهوائية المقاومة للمضادات الحيوية في HS لا تزال غير معروفة. حتى الآن ، لم يتم الإبلاغ عن عزل السلالات البكتيرية من أنفاق HS ، مما يحد من الدراسات حول العلاجات الجديدة المضادة للميكروبات والتقييم المتعمق لمساهمة مسببات الأمراض في التسبب في مرض HS. لن يؤدي توحيد طرق عزل مسببات الأمراض إلى تسهيل الرؤى الحقيقية للدور البكتيري في التسبب في HS فحسب ، بل سيسمح أيضا بالترجمة نحو تدخلات أكثر استهدافا وتحسينا.

هنا ، نسلط الضوء على طريقة لعزل الكائنات الحية الدقيقة بنجاح من أنسجة نفق HS. يعد عزل الأنواع البكتيرية الفردية خطوة أولية حاسمة في فهم دورها في أمراض النظام المنسق. تمهد هذه الطريقة الطريق للبحث المستهدف في المساهمات الميكروبية في HS ولتطوير استراتيجيات علاج أكثر فعالية وشخصية تعالج مسببات الأمراض البكتيرية في هذه الحالة المزمنة.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في جامعة ميامي (البروتوكول #20200187). يتم الحصول على الموافقة المستنيرة من المرضى (ن = 18 ، متوسط العمر ± الانحراف المعياري = 30.9 ± 9.4 ، 12 أنثى ، 6 ذكور) تم تشخيص إصابتهم بأنفاق HS و / أو الأوصياء القانونيين عليهم قبل الإجراء بعد المناقشة السابقة للبحث للسماح بمعالجة أي مخاوف أو أسئلة.

1. جمع عينة المريض

1. قبل التعامل مع الأنسجة المستأصلة ، استخدم احتياطات معقمة صارمة لتقليل مخاطر التلوث. يجب على الفرد الذي يتعامل مع الأنسجة ارتداء معطف المختبر وقناع الوجه والقبعة الجراحية واستخدام قفازات معقمة وأدوات معقمة للتعامل مع الأنسجة.
2. للتحكم في العقم ، قم بغمر الملقط المعقم مسبقا في قارورة النقل اللاهوائية قبل معالجة الأنسجة (جدول المواد).
3. اجمع أنسجة الجلد ، التي تم استئصالها جراحيا عن طريق مشرط أو ليزر ثاني أكسيد الكربون₂ ، من المناطق المصابة للمرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بأنفاق HS ووضعها على الفور في طبق بتري معقم باستخدام ملقط معقم لمزيد من المعالجة.
4. أثناء وجودك في مركز الجراحة أو مكتب العيادة الخارجية ، حدد الأنفاق داخل الأنسجة المستأصلة عن طريق فحص الجلد باستخدام ملقط معقم مسبقا ، كما هو موضح في الشكل 1 أ.
5. خذ خزعات مثقبة مقاس 6 مم من خلال الجلد كامل السماكة للنفق المحدد مباشرة بعد استئصال الأنسجة واغمرها في الوسائط المخزنة شبه الصلبة مع عوامل الاختزال في قوارير زجاجية لنقل النظام اللاهوائي لتحسين بقاء الأنواع البكتيرية اللاهوائية لمزيد من التحليل.
6. انقل أنسجة النفق في القوارير اللاهوائية إلى المختبر على الجليد.
7. قم بإجراء عينة من الوثائق كما هو موضح أدناه.
   1. في يوم الإجراء ، اجمع معلومات المريض ، بما في ذلك التركيبة السكانية والعمر والعرق / العرق المبلغ عنه ذاتيا والأدوية الحالية ، دون أي معرفات شخصية. ترافق مواقع الجسم من الأنسجة المقطوعة مخطط الجسم ، حيث يمكن أن تحدث أنفاق HS في مواقع متعددة من الجسم. التقط صورا للأنسجة المستأصلة من جانبي العينة قبل وبعد معالجة الأنسجة، مع توثيق موقع الخزعة الناتجة عن النفق. عند الوصول إلى المختبر ، قم بتسجيل عينات الأنسجة المشفرة بدون أي معرفات شخصية في قاعدة بيانات إلكترونية آمنة.

2. معالجة الجلد HS

1. الإعداد والطلاء
   1. ارتد معطف المختبر والقفازات واربط الشعر لتجنب التلوث. أطباق أجار الدم الدافئة مسبقا ، بما في ذلك أجار Laked Brucella Blood agar مع Kanamycin و Vancomycin (LKV) agar و Trypticase Soy agar (TSA II) 5٪ Sheep Blood (SB) agar و Brain Heart Infusion (BHI) و Phenylethyl alcohol agar (PEA) مع 5٪ SB agar إلى 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 10 دقائق. نظف خزانة السلامة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل معالجة الأنسجة.
   2. بمجرد تسخين ألواح الأجار ، قم بتسمية قاعدة أو جانب اللوحة باسم العينة المشفرة والتاريخ. ضع ملقط معقم ومشارط وحلقات تلقيح معقمة مسبقا وألواح أجار في خزانة السلامة الحيوية.
   3. قم بإزالة الخزعة المثقوبة مقاس 6 مم من قارورة النقل اللاهوائية باستخدام ملقط معقم عن طريق غمر الملقط في الوسط. قم بتقطيع الأنسجة بسرعة إلى قطع صغيرة ، حوالي 1 مم² لكل منها ، باستخدام مشرط معقم. ضع الأنسجة في أنبوب معقم لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة يحتوي على 500 ميكرولتر من الوسط المطثي المقوى (RCM) ودوامة لفترة وجيزة.
      ملاحظة: لم يتم استخدام التجانس لأن العينات ستتعرض للبيئة الهوائية لفترة طويلة ، مما قد يؤدي إلى تهوية إضافية أثناء العملية وفقدان محتمل للبكتيريا اللاهوائية.
   4. باستخدام حلقة معقمة جديدة ، قم بإجراء خطوط رباعية متكررة لتعليق الأنسجة الذي يحتوي على كائنات بكتيرية على TSA II 5٪ SB و LKV و PEA مع 5٪ SB و BHI أجار.
   5. باستخدام معلق الأنسجة المفرومة المتبقي ، اصنع مخزونات الجلسرين عن طريق إضافة 20٪ من الجلسرين المعقم و 80٪ من تعليق الأنسجة الخامسة / الحجمي في أنبوب التبريد. قم بتخزين مخزون الجلسرين في 80 درجة مئوية. في حالة محدودية صلاحية البكتيريا المعزولة ، يمكن استخدام مخزون الأنسجة لتكرار العزلة.
   6. ضع جميع الألواح في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في غرفة لاهوائية محاطة بعبوة ثاني أكسيد الكربون. افحص الألواح كل 2-3 أيام ، مع توقع نمو اللاهوائية بعد 7-14 يوما من الطلاء. توثيق أشكال المستعمرات عن طريق تصوير اللوحات.
2. بنك الأنسجة
   1. استخدم خزعة مثقبة مقاس 8 مم لجمع عينات جلدية إضافية كاملة السماكة عبر النفق وبعيدا عن النفق لعينة من البارافين الثابت الفورمالين (FFPE) والتقييم النسيجي ، حيث من المرجح أن تلتقط عينة أكبر من الأنسجة النفق الكامل.
   2. احتفظ بخزعات مثقبة إضافية مقاس 6 مم للحمض النووي (المجمد المفاجئ) ، والحمض النووي الريبي (في الحمض النووي الريبي لاحقا) ، وعزل البروتين (المجمد المفاجئ).
3. صيانة المستعمرة
   1. بمجرد ملاحظة المستعمرات على اللوحات الأصلية ، قم بتصوير اللوحات ولاحظ مورفولوجيا المستعمرة^{المميزة 17}. بشكل عام ، توقع 10-15 شكلا مختلفا للمستعمرات (انظر الشكل 1).
   2. قم بإعداد ألواح أجار LKV و BHI و PEA الدافئة مسبقا مع ألواح أجار SB 5٪ SB و TSA II 5٪ SB (جدول المواد). قم بتسمية كل ملصق لوحة بمعرف العينة وموقع الخزعة والتاريخ.
   3. باستخدام طرف ماصة معقمة، التقط مستعمرة واحدة وقم بتحريكها بحركة متعرجة على نفس نوع اللوحة التي تم اكتشافها عليها. بعد ذلك ، باستخدام نفس طرف الماصة مع المستعمرة كقالب لتضخيم 16s rDNA PCR ، اتبع الخطوات أدناه.
   4. كرر الخطوة 2.3.3 باستخدام المستعمرات المختارة من جميع أنواع ألواح الأجار بطرف ماصة معقم جديد ومستعمرة مفردة مختلفة من التشكل المميز عن اللوحة الأصلية. مرة أخرى ، مباشرة بعد الخطوط ، استخدم طرف الماصة مع المستعمرة المتبقية لغمرها في بئر مخصص للوحة PCR ، حيث سيوفر هذا نموذجا لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
   5. كرر الخطوات 2.3.3-2.3.4 لكل مستعمرة متميزة حتى يتم ربط جميع المستعمرات ذات الأشكال المحددة في جميع الأنواع الأربعة من ألواح الأجار وتلقيح آبار تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابلة في وقت واحد.
   6. قم بتخزين ألواح الأجار المطلية حديثا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في غرفة لاهوائية محاطة بعبوة ثاني أكسيد الكربون₂ . بمجرد نمو المستعمرات ، تأكد من نقاء المستعمرة المعزولة قبل الحفاظ على المخزونات البكتيرية (انظر أدناه). إذا كانت المستعمرات المطلية تفتقر إلى التوحيد ، كرر الخطوة 2.3.3. قم بإجراء عملية إعادة الطلاء كل 4-5 أيام ، اعتمادا على نمو المستعمرة ، حتى تصبح المستعمرات موحدة المظهر.
4. تحديد الأنواع البكتيرية عن طريق تسلسل أمبليكون مستعمرة rDNA 16s
   1. قم بإعداد لوحة PCR بمزيج رئيسي يتكون من 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر 16S rDNA V1-V3 للأمام (5 'AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') والبادئات العكسية (5 'AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3' ؛ 10 ميكرومتر) ، 12.5 ميكرولتر من 2x Master Mix polymerase و 10 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الميكروبي لكل بئر لحجم إجمالي يبلغ 25 ميكرولتر لكل مستعمرة.
   2. حساب حجم المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوب للتضخيم من جميع المستعمرات المختارة ، والتحكم السلبي (بدون قالب) ، والتحكم الإيجابي - يمكن استخدام أي سلالة مختبرية ؛ نستخدم عادة المكورات العنقودية الذهبية USA300.
   3. أحضر لوحة PCR إلى خزانة السلامة الحيوية ، وتغطي الآبار لتجنب التلوث. استخدم مستعمرة واحدة من طرف ماصة معقمة للطلاء. أعد تعليق المستعمرة على الفور مع دوامة صارمة في البئر المعين باستخدام المزيج الرئيسي المملوء مسبقا. استخدم نفس طرف الماصة لكل من الزراعة الفرعية وأخذ العينات من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
   4. كرر الخطوة 2.4.3 لجميع مستعمرات HS المفردة والتحكم الإيجابي.
   5. قم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البروتوكول التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للتمسخ الأولي المطلوب لتحلل المستعمرة المختارة ، متبوعا ب 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 54 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، استخدام دورة 4 درجات مئوية النهائية اختياري. يمكن أيضا استخدام جهاز تدوير حراري بنفس إعدادات البرنامج.
   6. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام مع منتجات qPCR المضخمة للتحقق من حجم الضخم ، والذي من المتوقع أن يكون 311 نقطة أساس (الشكل 2). نجح Purify في تضخيم جزء 16s rDNA باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   7. أرسل منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المنقى ل 16S RNA الريبوسومي Sanger باستخدام بادئات 16S rDNA V1-V3 الأمامية والخلفية.
5. مخزون بكتيري
   ملاحظة: تشتهر الكائنات اللاهوائية الحساسة بقدرتها المحدودة على ألواح الأجار.
   1. من أجل ضمان الحفاظ على السلالة قبل الحصول على نتائج التسلسل ، والتي ستؤكد هوية الأنواع ، تولد صفائح أجار من مستعمرة واحدة وتؤكد النقاء لتوليد المخزونات. قم بتوليد مخزونات مباشرة من لوحة الأجار بالتوازي مع تحسين ظروف النمو في الوسط السائل.
   2. لتحضير المخزون من اللوحة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.3 ، استخدم حلقة تلقيح معقمة مقاس 6 مم لالتقاط أكبر عدد ممكن من المستعمرات الموحدة. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق البكتيريا بقوة في 800 ميكرولتر من RCM مع 20٪ جلسرين معقم في أنابيب التبريد وتخزينها عند -80 درجة مئوية لإنشاء مخزون بكتيري.
      ملاحظة: تضمن هذه الخطوة الحفاظ في الوقت المناسب على مسببات الأمراض الحساسة قبل الحصول على التوصيف عن طريق تسلسل البيانات.
   3. قم بتحسين النمو في الاستزراع السائل وتوليد المخزونات من مستعمرة واحدة بمجرد تأكيد تصنيف السلالة.

النتائج

في هذه الدراسة ، نصف بروتوكولا لعزل وتوصيف البكتيريا اللاهوائية من أنفاق HS. هذا البروتوكول جديد وملحوظ لخلق القدرة على اختبار وظيفة هذه البكتيريا وضراوتها باستخدام نماذج عدوى الجلد في المختبر وخارج الجسم الحي وفي الجسم الحي لزيادة فهمنا للمساهمة الميكرو...

Discussion

في هذه الدراسة ، نقدم طريقة جديدة لعزل البكتيريا والحفاظ عليها في استعمار أنفاق HS. لن تسمح هذه الطريقة القابلة للتكرار فقط بالتوصيف العميق للسلالات الموجودة في هذه الهياكل المرضية ، ولكنها ستمكن أيضا من الدراسات الوظيفية اللاحقة لاستكشاف دور ميكروبات معينة في التسبب ف?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6mm punch biospy	INTEGRA	33-36	Other suppliers can be used
8mm punch biospy	INTEGRA	33-37	Other suppliers can be used
Agarose	Sigma Aldrich	A9539	Other suppliers can be used
Anaerobic Chambers	BD	260672
Anaerobic Transport Media	Anaerobic Systems	AS-911
Brain heart Infusion Agar	Anaerobic Systems	AS-6426
CO2 gaspak	BD	260678
Difco Reinforced Clostridial Medium	BD	218081
Glycerol	SIGMA	G5516-1L	Other suppliers can be used
Hard shell PCR plates	BIO-RAD	HSP9601	Other suppliers can be used
Incubator	VWR	Symphony	Any callibrated incubator can be used
Inoculation loops	VWR	76544-926	Other suppliers can be used
LKV agar	HARDY Diagnostics	A60
Microbial DNA-Free Water	Qiagen	338132
Nunc CryoTube	Thermo scientific	377267	Other suppliers can be used
PCR (CFX Connect Real Time System)	BIO-RAD	CFX Connect Optics Module	Regular Themocycler can be used
PEA agar	HARDY Diagnostics	A93
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	BioLabs	M0492S
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Reinforced clostridia media	BD	218081
Thin Forceps	Millipore Sigma	F4017	Other suppliers can be used
Trypticase Soy Agar (TSA II) with 5% sheep blood	Thermo scientific	221261