Enfoque integral para el aislamiento microbiano de túneles de hidradenitis supurativa

Resumen

Presentamos un método para aislar con éxito organismos fastidiosos y anaeróbicos de los tractos sinusales cutáneos (túneles) en tejidos extirpados de pacientes con hidradenitis supurativa.

Resumen

La hidradenitis supurativa (HS) es una afección debilitante caracterizada por nódulos y abscesos dolorosos, que progresan a tractos sinusales (túneles) dentro de las capas dérmicas de la piel, causando molestias significativas, secreción maloliente, desfiguración, contracturas y cicatrices, que disminuyen gravemente la calidad de vida. La HS se asocia con alteraciones en el microbioma de la piel, lo que afecta la regulación inmunitaria y la defensa de la piel contra las bacterias dañinas. A pesar de su prevalencia, la contribución del microbioma HS a la patología de la enfermedad y la respuesta limitada al tratamiento sigue siendo en gran medida desconocida. Hasta la fecha, múltiples estudios de secuenciación de ARNr 16S en tejido HS solo han logrado una granularidad a nivel de género, identificando un aumento en los anaerobios gramnegativos y una disminución en los comensales de la piel. Una comprensión más profunda de la disbiosis microbiana en individuos con HS es esencial para optimizar las estrategias de tratamiento. Esto requiere un enfoque doble para evaluar el microbioma HS, incluido el aislamiento de especies bacterianas, que a menudo se infrautilizan en los estudios traslacionales centrados en los trastornos de la piel. El aislamiento de microorganismos individuales del tejido HS es crucial para dilucidar el papel de las bacterias en la patogénesis de la HS. Aquí, destacamos los métodos reproducibles para aislar con éxito patógenos anaeróbicos del tejido del túnel HS, proporcionando el paso inicial y más crítico en la comprensión del papel bacteriano en HS. Este método allana el camino para la investigación específica sobre las contribuciones microbianas a la HS y para el desarrollo de estrategias de tratamiento más efectivas y personalizadas que aborden la compleja carga microbiana de esta afección crónica.

Introducción

La hidradenitis supurativa (HS) es una afección dermatológica común caracterizada por nódulos y abscesos que progresan a tractos sinusales (túneles) formados dentro de las capas dérmicas y subcutáneas de la piel, causando dolor significativo, produciendo secreción purulenta, desfiguración y secuelas psicosociales debilitantes ^1,2. La HS afecta de manera desproporcionada a las mujeres y a las personas con piel de color, que suele surgir al final de la adolescencia o en la adultez temprana². Los graves síntomas físicos de la enfermedad se ven agravados por su profundo impacto psicosocial, que incluye depresión, ansiedad y aislamiento social, que pueden disminuir gravemente la calidad de vida³. Los túneles HS formados en la etapa avanzada de la enfermedad disminuyen significativamente las probabilidades de respuesta de los pacientes a la terapia biológica actualmente aprobada, y la escisión quirúrgica sigue siendo el único enfoque de tratamiento ^4,5.

Múltiples estudios han caracterizado el microbioma asociado a los túneles HS, mostrando una prevalencia de patógenos anaerobios y una menor abundancia de comensales cutáneos ^6,7,8, con estudios recientes que identifican Porphyromonas spp. (tipo I) y Prevotella spp. (IV) en túneles, entre otros géneros⁹. Otro estudio encontró variación en el microbioma HS por la profundidad de la muestra de tejido, lo que confirma la singularidad de la composición microbiana en el tejido del túnel¹⁰. Además, se ha demostrado que la disbiosis afecta la respuesta inmune en la HS, implicando aún más el papel de los microbios en la patogénesis de la enfermedad 11,12,13,14. A pesar de que el tratamiento antibiótico sistémico prolongado con clindamicina, rifampicina y tetraciclinas está en uso y ha demostrado una reducción del número de túneles de drenaje en los pacientes afectados^15,16, los datos sobre patógenos anaerobios resistentes a antibióticos en la HS siguen siendo desconocidos. Hasta el momento, no se ha informado sobre el aislamiento de cepas bacterianas de los túneles de HS, lo que limita los estudios sobre nuevos tratamientos antimicrobianos y la evaluación en profundidad de la contribución de los patógenos a la patogénesis de la enfermedad de la HS. La estandarización de los métodos para el aislamiento de patógenos no solo facilitaría una visión real del papel de las bacterias en la patogénesis de la HS, sino que también permitiría la traducción hacia intervenciones más específicas y mejoradas.

Aquí, destacamos un método para aislar con éxito microorganismos del tejido del túnel HS. El aislamiento de especies bacterianas individuales es un paso inicial crucial para comprender su papel en la patología de HS. Este método allana el camino para la investigación específica sobre las contribuciones microbianas a la HS y para el desarrollo de estrategias de tratamiento más efectivas y personalizadas que aborden los patógenos bacterianos en esta afección crónica.

Protocolo

Este protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Miami (protocolo #20200187). Se obtiene el consentimiento informado de los pacientes (n = 18, edad media ± desviación estándar = 30,9 ± 9,4, 12 mujeres, 6 hombres) diagnosticados con túneles HS y/o de su(s) tutor(es) legal(es) antes del procedimiento después de una discusión previa de la investigación para permitir que se aborden cualquier inquietud o pregunta.

1. Recogida de muestras de pacientes

1. Antes de manipular el tejido extirpado, tome precauciones estériles estrictas para minimizar el riesgo de contaminación. La persona que manipule el tejido debe usar una bata de laboratorio, una mascarilla y un gorro quirúrgico y usar guantes e instrumentos estériles para manipular el tejido.
2. Para el control de la esterilidad, sumerja las pinzas preesterilizadas en autoclave en el vial de transporte anaeróbico antes de procesar el tejido (Tabla de materiales).
3. Recoja tejido de la piel, resecado quirúrgicamente por medio de un bisturí o láser de CO₂ , de las áreas afectadas de pacientes diagnosticados con túneles HS y colóquelo inmediatamente en una placa de Petri estéril con pinzas estériles para su posterior procesamiento.
4. Mientras esté en el centro quirúrgico o en el consultorio de la clínica ambulatoria, identifique los túneles dentro del tejido extirpado sondeando la piel con pinzas preesterilizadas en autoclave, como se muestra en la Figura 1A.
5. Tome biopsias en sacabocados de 6 mm a través de la piel de espesor completo del túnel identificado inmediatamente después de la escisión del tejido y sumérjalas en el medio tamponado semisólido con agentes reductores en los viales de vidrio de transporte del sistema anaeróbico para optimizar la supervivencia de las especies bacterianas anaeróbicas para su posterior análisis.
6. Transportar el tejido del túnel en los viales anaeróbicos al laboratorio sobre hielo.
7. Realice la documentación de muestra como se describe a continuación.
   1. El día del procedimiento, recopile información del paciente, incluidos los datos demográficos, la edad, la etnia/raza autoinformada y los medicamentos actuales, sin ningún identificador personal. Los sitios corporales del tejido resecado acompañan a un gráfico corporal, ya que los túneles HS pueden ocurrir en múltiples sitios del cuerpo. Tome fotografías del tejido extirpado de ambos lados de la muestra antes y después del procesamiento del tejido, documentando la ubicación de la biopsia generada a partir de un túnel. A su llegada al laboratorio, registre las muestras de tejido codificadas sin ningún identificador personal en una base de datos electrónica segura.

2. Procesamiento de la piel HS

1. Montaje y enchapado
   1. Use una bata de laboratorio y guantes, y ate el cabello para evitar la contaminación. Placas de agar sangre precalentadas, que incluyen agar sangre de Brucella Laked con agar kanamicina y vancomicina (LKV), agar tripticasa de soja (TSA II) agar sangre de oveja (SB) al 5%, infusión de cerebro y corazón (BHI) y agar alcohol feniletílico (PEA) con agar SB al 5% a 37 °C en una incubadora durante 10 min. Limpie la cabina de bioseguridad con etanol al 70% antes de procesar el tejido.
   2. Una vez que las placas de agar se hayan calentado, etiquete la base o el lado de la placa con el nombre de la muestra codificada y la fecha. Coloque las pinzas esterilizadas en autoclave, los bisturíes, los asas de inoculación preesterilizadas y las placas de agar en el gabinete de bioseguridad.
   3. Extraiga la biopsia con punción de 6 mm del vial de transporte anaeróbico con pinzas estériles sumergiendo las pinzas en el medio. Picar rápidamente el tejido en trozos pequeños, de aproximadamente 1 mm² cada uno, con un bisturí estéril. Coloque el tejido en un tubo de microcentrífuga estéril que contenga 500 μL de medio clostridial reforzado (RCM) y brevemente en vórtice.
      NOTA: No se utilizó la homogeneización porque las muestras estarían expuestas al ambiente aeróbico durante un período prolongado, lo que podría haber provocado una aireación adicional durante el proceso y una posible pérdida de bacterias anaeróbicas.
   4. Con un nuevo asa estéril, realice un rayado repetido de cuadrantes de la suspensión de tejido que contiene organismos bacterianos en las placas de agar TSA II 5% SB, LKV, PEA con 5% SB y BHI.
   5. Usando la suspensión de tejido picado restante, haga las reservas de glicerol agregando un 20% v/v de glicerol estéril y un 80% v/v de suspensión de tejido en un tubo criogénico. Almacene las existencias de glicerol a 80 °C. En el caso de que la viabilidad de las bacterias aisladas sea limitada, se pueden utilizar reservas de tejido para repetir el aislamiento.
   6. Coloque todas las placas en la incubadora a 37 °C en una cámara anaeróbica cerrada con un paquete de CO₂ . Revise las placas cada 2-3 días, esperando el crecimiento de los anaerobios 7-14 días después de la siembra. Documentar las morfologías de las colonias fotografiando las placas.
2. Bancos de tejidos
   1. Utilice una biopsia con sacabocados de 8 mm para recolectar muestras adicionales de piel de espesor completo a través del túnel y lejos del túnel para la muestra de formalina fija en parafina (FFPE) y la evaluación histológica, ya que es más probable que una muestra de tejido más grande capture el túnel completo.
   2. Conserve biopsias adicionales de 6 mm para ADN (ultracongelación), ARN (en ARN posterior) y aislamiento de proteínas (ultracongelación).
3. Mantenimiento de colonias
   1. Una vez que se observan las colonias en las placas originales, fotografíe las placas y tome nota de la morfología distintiva de la colonia¹⁷. En general, anticipe de 10 a 15 morfologías de colonias diferentes (ver Figura 1).
   2. Prepare placas de agar LKV, BHI, PEA precalentadas con 5% SB y TSA II 5% SB (Tabla de Materiales). Etiquete cada placa con la identificación de la muestra, la ubicación de la biopsia y la fecha.
   3. Con una punta de pipeta estéril, recoja una sola colonia y críela en zig-zag sobre el mismo tipo de placa en la que se detectó. A continuación, utilizando la misma punta de pipeta con la colonia como plantilla para una amplificación por PCR de ADNr de 16 s, siga los pasos que se indican a continuación.
   4. Repita el paso 2.3.3 utilizando las colonias seleccionadas de todos los tipos de placas de agar con una nueva punta de pipeta estéril y una colonia singular diferente de la morfología distinta de la placa original. De nuevo, inmediatamente después del rayado, utilice la punta de la pipeta con la colonia restante para sumergirla en un pocillo de placa de PCR dedicado, ya que esto proporcionará una plantilla para la amplificación de la PCR.
   5. Repita los pasos 2.3.3-2.3.4 para cada colonia distinta hasta que todas las colonias con morfologías específicas en los cuatro tipos de placas de agar hayan sido rayadas y se hayan inoculado simultáneamente los pocillos de PCR correspondientes.
   6. Guarde las placas de agar recién plateadas en la incubadora a 37 °C en una cámara anaeróbica cerrada con un paquete de CO₂ . Una vez que las colonias crezcan, asegúrese de la pureza de la colonia aislada antes de preservar las reservas bacterianas (ver más abajo). Si las colonias plateadas carecen de uniformidad, repita el paso 2.3.3. Realice el proceso de resiembra cada 4-5 días, dependiendo del crecimiento de la colonia, hasta que las colonias tengan una apariencia uniforme.
4. Identificación de especies bacterianas mediante secuenciación de amplicones de colonias de ADNr 16s
   1. Prepare una placa de PCR con una mezcla maestra compuesta por 2,5 μL de 10 μM 16S ADNr V1-V3 cebadores directos (5' AGAGTGATTCCTGGCTCAG-3') e inversos (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12,5 μL de 2x Master Mix polimerasa y 10 μL de agua libre de ADN microbiano por pocillo para un volumen total de 25 μL por colonia.
   2. Calcular el volumen de una mezcla maestra de PCR necesaria para la amplificación de todas las colonias seleccionadas, control negativo (sin plantilla) y control positivo: se puede utilizar cualquier cepa de laboratorio; comúnmente usamos Staphylococcus aureus USA300.
   3. Lleve una placa de PCR al gabinete de bioseguridad, cubriendo los pozos para evitar la contaminación. Utilice una sola colonia de una punta de pipeta estéril para la siembra. Vuelva a suspender inmediatamente la colonia con un riguroso remolino en el pozo designado con la mezcla maestra precargada. Utilice la misma punta de pipeta tanto para el subcultivo como para la toma de muestras para PCR.
   4. Repita el paso 2.4.3 para todas las colonias HS singulares y el control positivo.
   5. Realice la PCR con el siguiente protocolo: 95 °C durante 5 min para la desnaturalización inicial necesaria para lisar la colonia seleccionada, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 15 s, 54 °C durante 1 min, el uso del ciclo final de 4 °C es opcional. También se puede utilizar un termociclador con la misma configuración de programa.
   6. Ejecute electroforesis en gel con productos de qPCR amplificados para verificar el tamaño del amplicón, que se espera que sea de 311 pb (Figura 2). Purifique con éxito el fragmento de ADNr 16s amplificado con el kit de purificación de PCR según las instrucciones del fabricante.
   7. Envíe el producto de PCR purificado para la secuenciación de Sanger de ARN ribosómico 16S utilizando cebadores directos e inversos de ADNr 16S V1-V3.
5. Reservas bacterianas
   NOTA: Los anaerobios fastidiosos son conocidos por su limitada viabilidad en las placas de agar.
   1. Con el fin de asegurar la preservación de la cepa antes de obtener los resultados de la secuenciación, que confirmarán la identidad de la especie, genere placas de agar a partir de una sola colonia y confirme la pureza para generar stocks. Genere existencias directamente desde la placa de agar en paralelo con la optimización de las condiciones de crecimiento en los medios líquidos.
   2. Para preparar el caldo a partir de la placa generada en el paso 2.3, utilice un asa de inoculación estéril de 6 mm para recoger tantas colonias uniformes como sea posible. A continuación, resuspenda enérgicamente las bacterias en 800 μL de RCM con un 20% de glicerol estéril en criotubos y guárdelos a -80 °C para crear un stock bacteriano.
      NOTA: Este paso asegura la conservación oportuna de los patógenos fastidiosos antes de obtener la caracterización por datos de secuenciación.
   3. Realizar la optimización del crecimiento en cultivo líquido y generación de stocks a partir de una sola colonia una vez confirmada la clasificación de la cepa.

Resultados

En este estudio describimos un protocolo para el aislamiento y caracterización de bacterias anaerobias de túneles HS. Este protocolo es novedoso y notable por crear el potencial de probar la función y la virulencia de estas bacterias utilizando modelos de infección cutánea in vitro, ex vivo e in vivo para aumentar nuestra comprensión de la contribución microbiana a la patogénesis de la HS. En primer lugar, identificamos los túneles a partir de la piel ...

Discusión

En este estudio, presentamos un método novedoso para aislar y mantener las bacterias que colonizan los túneles HS. Este método reproducible no solo permitirá caracterizar en profundidad las cepas presentes en estas estructuras patológicas, sino que también permitirá estudios funcionales posteriores que exploren el papel de microbios específicos en la patogénesis de la HS. Los pasos críticos del protocolo incluyen la recolección y el transporte de tejidos en medios anaeróbicos...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6mm punch biospy	INTEGRA	33-36	Other suppliers can be used
8mm punch biospy	INTEGRA	33-37	Other suppliers can be used
Agarose	Sigma Aldrich	A9539	Other suppliers can be used
Anaerobic Chambers	BD	260672
Anaerobic Transport Media	Anaerobic Systems	AS-911
Brain heart Infusion Agar	Anaerobic Systems	AS-6426
CO2 gaspak	BD	260678
Difco Reinforced Clostridial Medium	BD	218081
Glycerol	SIGMA	G5516-1L	Other suppliers can be used
Hard shell PCR plates	BIO-RAD	HSP9601	Other suppliers can be used
Incubator	VWR	Symphony	Any callibrated incubator can be used
Inoculation loops	VWR	76544-926	Other suppliers can be used
LKV agar	HARDY Diagnostics	A60
Microbial DNA-Free Water	Qiagen	338132
Nunc CryoTube	Thermo scientific	377267	Other suppliers can be used
PCR (CFX Connect Real Time System)	BIO-RAD	CFX Connect Optics Module	Regular Themocycler can be used
PEA agar	HARDY Diagnostics	A93
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	BioLabs	M0492S
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Reinforced clostridia media	BD	218081
Thin Forceps	Millipore Sigma	F4017	Other suppliers can be used
Trypticase Soy Agar (TSA II) with 5% sheep blood	Thermo scientific	221261