Umfassender Ansatz für die mikrobielle Isolierung aus Hidradenitis suppurativa-Tunneln

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode vor, mit der anspruchsvolle und anaerobe Organismen erfolgreich aus kutanen Sinusbahnen (Tunneln) in Geweben isoliert werden können, die von Patienten mit Hidradenitis Suppurativa exzidiert wurden.

Zusammenfassung

Hidradenitis Suppurativa (HS) ist eine schwächende Erkrankung, die durch schmerzhafte Knötchen und Abszesse gekennzeichnet ist, die zu den Nebenhöhlen (Tunneln) innerhalb der Hautschichten fortschreiten und erhebliche Beschwerden, übelriechenden Ausfluss, Entstellungen, Kontrakturen und Narbenbildung verursachen, die die Lebensqualität stark beeinträchtigen. HS wird mit Veränderungen des Hautmikrobioms in Verbindung gebracht, die sich auf die Immunregulation und die Abwehr der Haut gegen schädliche Bakterien auswirken. Trotz seiner Prävalenz ist der Beitrag des HS-Mikrobioms zur Krankheitspathologie und das begrenzte Ansprechen auf die Behandlung weitgehend unbekannt. Bisher haben mehrere 16S rRNA-Sequenzierungsstudien an HS-Gewebe nur eine Granularität auf Gattungsebene erreicht und eine Zunahme gramnegativer Anaerobier und eine Abnahme der Hautkommensalen festgestellt. Ein tieferes Verständnis der mikrobiellen Dysbiose bei Personen mit HS ist für die Optimierung von Behandlungsstrategien unerlässlich. Dies erfordert einen zweigleisigen Ansatz zur Bewertung des HS-Mikrobioms, einschließlich der Isolierung von Bakterienarten, die in translationalen Studien, die sich auf Hauterkrankungen konzentrieren, oft zu wenig genutzt werden. Die Isolierung einzelner Mikroorganismen aus HS-Gewebe ist entscheidend für die Aufklärung der Rolle von Bakterien in der HS-Pathogenese. Hier stellen wir reproduzierbare Methoden zur erfolgreichen Isolierung anaerober Krankheitserreger aus HS-Tunnelgewebe vor und stellen damit den ersten und wichtigsten Schritt zum Verständnis der bakteriellen Rolle bei HS dar. Diese Methode ebnet den Weg für die gezielte Erforschung der mikrobiellen Beiträge zur HS und für die Entwicklung effektiverer, personalisierter Behandlungsstrategien, die die komplexe mikrobielle Belastung durch diese chronische Erkrankung adressieren.

Einleitung

Hidradenitis Suppurativa (HS) ist eine häufige dermatologische Erkrankung, die durch Knötchen und Abszesse gekennzeichnet ist, die zu den Nebenhöhlen (Tunneln) fortschreiten, die sich in den dermalen und subkutanen Schichten der Haut bilden, erhebliche Schmerzen verursachen, eitrigen Ausfluss, Entstellungen und schwächende psychosoziale Folgen verursachen ^1,2. HS betrifft überproportional Frauen und Personen mit farbiger Haut, die typischerweise in der späten Jugend oder im frühen Erwachsenenalter auftreten². Die schweren körperlichen Symptome der Erkrankung werden durch ihre tiefgreifenden psychosozialen Auswirkungen wie Depressionen, Angstzustände und soziale Isolation verstärkt, die die Lebensqualität stark beeinträchtigen können³. HS-Tunnel, die im fortgeschrittenen Krankheitsstadium gebildet werden, verringern die Wahrscheinlichkeit, dass die Patienten auf die derzeit zugelassene biologische Therapie ansprechen, erheblich, und die chirurgische Exzision bleibt der einzige Behandlungsansatz ^4,5.

Mehrere Studien haben das Mikrobiom im Zusammenhang mit HS-Tunneln charakterisiert und eine Prävalenz anaerober Krankheitserreger und eine verminderte Abundanz von kutanen Kommensalen gezeigt ^6,7,8, wobei neuere Studien unter anderem Porphyromonas spp. (Typ I) und Prevotella spp. (IV) in Tunneln identifizierten⁹. Eine andere Studie fand eine Variation des HS-Mikrobioms durch die Tiefe der Gewebeprobenahme, was die Einzigartigkeit der mikrobiellen Zusammensetzung im Tunnelgewebe bestätigt¹⁰. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Dysbiose die Immunantwort bei HS beeinflusst, was die Rolle von Mikroben bei der Krankheitspathogenese weiter impliziert 11,12,13,14. Obwohl eine verlängerte systemische Antibiotikabehandlung mit Clindamycin, Rifampicin und Tetracyclinen im Einsatz ist und eine Verringerung der Anzahl der Drainagetunnel bei betroffenen Patienten gezeigt hat^15,16, sind die Daten zu antibiotikaresistenten anaeroben Erregern bei HS nach wie vor unbekannt. Bisher wurde nicht über die Isolierung von Bakterienstämmen aus HS-Tunneln berichtet, was Studien zu neuartigen antimikrobiellen Behandlungen und eine eingehende Bewertung des Beitrags von Krankheitserregern zur Krankheitspathogenese von HS einschränkt. Eine Standardisierung der Methoden zur Isolierung von Krankheitserregern würde nicht nur echte Einblicke in die bakterielle Rolle in der Pathogenese von HS ermöglichen, sondern auch eine Translation in Richtung gezielterer und verbesserter Interventionen ermöglichen.

Hier stellen wir eine Methode vor, mit der Mikroorganismen erfolgreich aus HS-Tunnelgewebe isoliert werden können. Die Isolierung einzelner Bakterienarten ist ein entscheidender erster Schritt, um ihre Rolle in der HS-Pathologie zu verstehen. Diese Methode ebnet den Weg für die gezielte Erforschung des mikrobiellen Beitrags zur HS und für die Entwicklung effektiverer, personalisierter Behandlungsstrategien, die sich mit bakteriellen Erregern bei dieser chronischen Erkrankung befassen.

Protokoll

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) an der Universität von Miami genehmigt (Protokoll #20200187). Die Einwilligungserklärung wird von Patienten (n = 18, mittleres Alter ± Standardabweichung = 30,9 ± 9,4, 12 Frauen, 6 Männer), bei denen vor dem Eingriff HS-Tunnel diagnostiziert wurden, und/oder ihrem/ihren Erziehungsberechtigten(n) nach vorheriger Diskussion der Forschung eingeholt, um Bedenken oder Fragen auszuräumen.

1. Entnahme von Patientenproben

1. Vor dem Umgang mit herausgeschnittenem Gewebe sollten strenge sterile Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, um das Risiko einer Kontamination zu minimieren. Die Person, die mit dem Gewebe umgeht, sollte einen Laborkittel, eine Gesichtsmaske und eine OP-Kappe tragen und sterile Handschuhe und sterile Instrumente verwenden, um das Gewebe zu handhaben.
2. Zur Sterilitätskontrolle tauchen Sie eine vorautoklavierte Pinzette in das anaerobe Transportfläschchen, bevor Sie das Gewebe verarbeiten (Materialtabelle).
3. Sammeln Sie Hautgewebe, das mit einem Skalpell oder CO₂ -Laser chirurgisch reseziert wurde, aus betroffenen Bereichen von Patienten, bei denen HS-Tunnel diagnostiziert wurden, und legen Sie es sofort mit einer sterilen Pinzette in eine sterile Petrischale zur weiteren Verarbeitung.
4. Identifizieren Sie im Operationszentrum oder in der Ambulanz Tunnel im exzidierten Gewebe, indem Sie die Haut mit einer präautoklavierten Pinzette untersuchen, wie in Abbildung 1A gezeigt.
5. Entnehmen Sie unmittelbar nach der Gewebeexzision 6-mm-Stanzbiopsien durch die Vollhaut des identifizierten Tunnels und tauchen Sie sie in das halbfeste gepufferte Medium mit Reduktionsmitteln in die Glasfläschchen des anaeroben Systems ein, um das Überleben anaerober Bakterienarten für die weitere Analyse zu optimieren.
6. Transportieren Sie das Tunnelgewebe in den anaeroben Fläschchen auf Eis ins Labor.
7. Führen Sie die Beispieldokumentation wie unten beschrieben durch.
   1. Sammeln Sie am Tag des Eingriffs Patienteninformationen, einschließlich demografischer Daten, Alter, selbstberichteter ethnischer Zugehörigkeit/Rasse und aktueller Medikamente, ohne persönliche Identifikatoren. Die Körperstellen des resezierten Gewebes begleiten ein Körperdiagramm, da HS-Tunnel an mehreren Körperstellen auftreten können. Machen Sie vor und nach der Gewebeaufbereitung Fotos von exzidiertem Gewebe von beiden Seiten der Probe und dokumentieren Sie den Ort der Biopsie, die aus einem Tunnel erzeugt wurde. Bei der Ankunft im Labor protokollieren Sie die codierten Gewebeproben ohne persönliche Identifikatoren in einer elektronischen, sicheren Datenbank.

2. HS-Hautverarbeitung

1. Einrichten und Plattieren
   1. Tragen Sie einen Laborkittel und Handschuhe und binden Sie die Haare, um eine Kontamination zu vermeiden. Vorwärmen von Blutagarplatten, einschließlich Laked Brucella Blutagar mit Kanamycin und Vancomycin (LKV) Agar, Trypticase Soja Agar (TSA II) 5% Schafblut (SB) Agar, Brain Heart Infusion (BHI) und Phenylethylalkohol Agar (PEA) mit 5% SB Agar auf 37 °C in einem Inkubator für 10 Minuten. Reinigen Sie die Biosicherheitswerkbank mit 70% Ethanol, bevor Sie das Gewebe verarbeiten.
   2. Sobald die Agarplatten erwärmt sind, beschriften Sie den Boden oder die Seite der Platte mit dem codierten Probennamen und dem Datum. Legen Sie autoklavierte Pinzetten, Skalpelle, vorsterilisierte Impfösen und Agarplatten in die Biosicherheitswerkbank.
   3. Entnehmen Sie die 6-mm-Stanzbiopsie mit einer sterilen Pinzette aus dem anaeroben Transportfläschchen, indem Sie die Pinzette in das Medium eintauchen. Schneiden Sie das Gewebe mit einem sterilen Skalpell schnell in kleine Stücke von jeweils ca. 1 mm² . Das Gewebe in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μl verstärktem Clostridienmedium (RCM) geben und kurz vortexen.
      HINWEIS: Die Homogenisierung wurde nicht verwendet, da die Proben über einen längeren Zeitraum der aeroben Umgebung ausgesetzt gewesen wären, was zu einer zusätzlichen Belüftung während des Prozesses und einem möglichen Verlust anaerober Bakterien hätte führen können.
   4. Führen Sie mit einer neuen sterilen Schleife wiederholte Quadrantenstreifen der Gewebesuspension, die bakterielle Organismen enthält, auf die TSA II 5 % SB-, LKV-, PEA- mit 5 % SB- und BHI-Agarplatten durch.
   5. Stellen Sie unter Verwendung der restlichen gehackten Gewebesuspension Glycerinbrühen her, indem Sie 20 % v/v steriles Glycerin und 80 % v/v Gewebesuspension in ein Kryoröhrchen geben. Lagern Sie die Glycerinvorräte bei 80 °C. Bei eingeschränkter Lebensfähigkeit isolierter Bakterien können Gewebebestände verwendet werden, um die Isolierung zu wiederholen.
   6. Stellen Sie alle Platten in den Inkubator bei 37 °C in eine anaerobe Kammer, die mit einer CO₂ -Packung umschlossen ist. Überprüfen Sie die Platten alle 2-3 Tage und erwarten Sie das Wachstum der Anaerobier 7-14 Tage nach der Beschichtung. Dokumentieren Sie die Morphologien der Kolonie, indem Sie Platten fotografieren.
2. Gewebebanken
   1. Verwenden Sie eine 8-mm-Stanzbiopsie, um zusätzliche Hautproben in voller Dicke durch den Tunnel und außerhalb des Tunnels für die FFPE-Probe (Fixed Paraffin Embedded) und die histologische Bewertung zu entnehmen, da eine größere Gewebeprobe mit größerer Wahrscheinlichkeit den gesamten Tunnel erfasst.
   2. Bewahren Sie zusätzliche 6-mm-Stanzbiopsien für DNA (Snap Frozen), RNA (später in RNA) und Proteinisolierung (Snap Frozen) auf.
3. Erhaltung der Kolonie
   1. Sobald die Kolonien auf den Originalplatten beobachtet sind, fotografieren Sie die Platten und notieren Sie sich die ausgeprägte Morphologie der Kolonie¹⁷. Im Allgemeinen sollten Sie mit 10-15 verschiedenen Koloniemorphologien rechnen (siehe Abbildung 1).
   2. Bereiten Sie vorgewärmte LKV-, BHI-, PEA-Platten mit 5 % SB und TSA II 5 % SB-Agarplatten vor (Materialtabelle). Beschriften Sie jedes Plattenetikett mit der Proben-ID, dem Ort der Biopsie und dem Datum.
   3. Nehmen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne Kolonie auf und streichen Sie sie in einer Zickzackbewegung auf dieselbe Art von Platte, auf der sie nachgewiesen wurde. Verwenden Sie dann dieselbe Pipettenspitze mit der Kolonie als Vorlage für eine 16s-rDNA-PCR-Amplifikation und führen Sie die folgenden Schritte aus.
   4. Schritt 2.3.3 wird mit den Kolonien, die aus allen Arten von Agarplatten ausgewählt wurden, mit einer neuen sterilen Pipettenspitze und einer anderen singulären Kolonie mit der von der ursprünglichen Platte abweichenden Morphologie wiederholt. Auch hier gilt: Verwenden Sie unmittelbar nach dem Streifen die Pipettenspitze mit der verbleibenden Kolonie, um sie in eine spezielle PCR-Plattenvertiefung zu tauchen, da dies eine Vorlage für die PCR-Amplifikation bietet.
   5. Die Schritte 2.3.3 bis 2.3.4 werden für jede einzelne Kolonie wiederholt, bis alle Kolonien mit spezifischen Morphologien in allen vier Arten von Agarplatten gestreift und die entsprechenden PCR-Vertiefungen gleichzeitig inokuliert wurden.
   6. Lagern Sie die neu plattierten Agarplatten im Inkubator bei 37 °C in einer anaeroben Kammer, die mit einer CO₂ -Packung umschlossen ist. Sobald die Bienenvölker gewachsen sind, stellen Sie die Reinheit der isolierten Kolonie sicher, bevor Sie die Bakterienbestände aufbewahren (siehe unten). Sind die plattierten Kolonien nicht gleichmäßig, so ist Schritt 2.3.3 zu wiederholen. Führen Sie den Neubeschichtungsprozess je nach Kolonenwachstum alle 4-5 Tage durch, bis die Völker einheitlich aussehen.
4. Identifizierung von Bakterienarten durch 16s-rDNA-Kolonie-Amplikon-Sequenzierung
   1. Bereiten Sie eine PCR-Platte mit einem Mastermix vor, der aus 2,5 μl 10 μM 16S rDNA V1-V3 vorwärts (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') und umgekehrten Primern (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12,5 μl 2x Master Mix Polymerase und 10 μl mikrobiellem DNA-freiem Wasser pro Vertiefung für ein Gesamtvolumen von 25 μl pro Kolonie besteht.
   2. Berechnen Sie das Volumen eines PCR-Mastermixes, das für die Amplifikation aus allen ausgewählten Kolonien, der Negativkontrolle (kein Template) und der Positivkontrolle erforderlich ist - jeder Laborstamm kann verwendet werden; Wir verwenden häufig Staphylococcus aureus USA300.
   3. Bringen Sie eine PCR-Platte zur Biosicherheitswerkbank und decken Sie die Vertiefungen ab, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie für die Beschichtung eine einzelne Kolonie aus einer sterilen Pipettenspitze. Suspendieren Sie die Kolonie sofort wieder durch rigoroses Schwenken in die dafür vorgesehene Vertiefung mit dem vorgefüllten Mastermix. Verwenden Sie dieselbe Pipettenspitze sowohl für die Subkultivierung als auch für die Probenahme für die PCR.
   4. Schritt 2.4.3 ist für alle singulären HS-Kolonien und die Positivkontrolle zu wiederholen.
   5. Führen Sie die PCR mit dem folgenden Protokoll durch: 95 °C für 5 Minuten für die anfängliche Denaturierung, die zur Lyse der ausgewählten Kolonie erforderlich ist, gefolgt von 40 Zyklen mit 95 °C für 15 s, 54 °C für 1 Minute, die Verwendung des abschließenden 4 °C-Zyklus ist optional. Ein Thermocycler kann auch mit den gleichen Programmeinstellungen verwendet werden.
   6. Führen Sie eine Gelelektrophorese mit amplifizierten qPCR-Produkten durch, um die Größe des Amplikons zu überprüfen, die voraussichtlich 311 bp betragen wird (Abbildung 2). Reinigen Sie erfolgreich ein amplifiziertes 16s-rDNA-Fragment mit dem PCR-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   7. Senden Sie das gereinigte PCR-Produkt für die ribosomale 16S-RNA-Sanger-Sequenzierung mit 16S rDNA V1-V3-Forward- und Reverse-Primern.
5. Bakterien-Vorräte
   HINWEIS: Die anspruchsvollen Anaerobier sind dafür bekannt, dass sie auf den Agarplatten nur begrenzt lebensfähig sind.
   1. Um die Konservierung des Stammes vor dem Erhalt von Sequenzierungsergebnissen zu gewährleisten, die die Artidentität bestätigen, Agarplatten aus einer einzigen Kolonie zu generieren und die Reinheit zu bestätigen, um Bestände zu erzeugen. Generieren Sie Vorräte direkt aus der Agarplatte, parallel zur Optimierung der Wachstumsbedingungen in den flüssigen Medien.
   2. Um den Fond aus der in Schritt 2.3 erzeugten Platte vorzubereiten, verwenden Sie eine sterile 6-mm-Impfschlaufe, um so viele gleichmäßige Kolonien wie möglich zu entnehmen. Anschließend werden die Bakterien in 800 μl RCM mit 20 % sterilem Glycerin in Kryoröhrchen kräftig resuspendiert und bei -80 °C gelagert, um einen Bakterienvorrat zu bilden.
      HINWEIS: Dieser Schritt gewährleistet die rechtzeitige Konservierung anspruchsvoller Krankheitserreger, bevor die Charakterisierung durch Sequenzierungsdaten erfolgt.
   3. Optimierung des Wachstums der Flüssigkultur und der Generierung von Stamm aus einer einzigen Kolonie, sobald die Klassifizierung des Stammes bestätigt ist.

Ergebnisse

In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von anaeroben Bakterien aus HS-Tunneln. Dieses Protokoll ist neuartig und zeichnet sich dadurch aus, dass es das Potenzial bietet, die Funktion und Virulenz dieser Bakterien unter Verwendung von in vitro-, ex vivo- und in vivo-Hautinfektionsmodellen zu testen, um unser Verständnis des mikrobiellen Beitrags zur Pathogenese von HS zu verbessern. Zunächst identifizierten wir die ...

Diskussion

In dieser Studie stellen wir eine neuartige Methode zur Isolierung und Aufrechterhaltung von Bakterien vor, die HS-Tunnel besiedeln. Diese reproduzierbare Methode wird nicht nur eine detaillierte Charakterisierung der in diesen pathologischen Strukturen vorhandenen Stämme ermöglichen, sondern auch nachfolgende funktionelle Studien zur Erforschung der Rolle spezifischer Mikroben in der Pathogenese von HS. Zu den kritischen Schritten des Protokolls gehören die Gewebeentnahme und der Tra...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6mm punch biospy	INTEGRA	33-36	Other suppliers can be used
8mm punch biospy	INTEGRA	33-37	Other suppliers can be used
Agarose	Sigma Aldrich	A9539	Other suppliers can be used
Anaerobic Chambers	BD	260672
Anaerobic Transport Media	Anaerobic Systems	AS-911
Brain heart Infusion Agar	Anaerobic Systems	AS-6426
CO2 gaspak	BD	260678
Difco Reinforced Clostridial Medium	BD	218081
Glycerol	SIGMA	G5516-1L	Other suppliers can be used
Hard shell PCR plates	BIO-RAD	HSP9601	Other suppliers can be used
Incubator	VWR	Symphony	Any callibrated incubator can be used
Inoculation loops	VWR	76544-926	Other suppliers can be used
LKV agar	HARDY Diagnostics	A60
Microbial DNA-Free Water	Qiagen	338132
Nunc CryoTube	Thermo scientific	377267	Other suppliers can be used
PCR (CFX Connect Real Time System)	BIO-RAD	CFX Connect Optics Module	Regular Themocycler can be used
PEA agar	HARDY Diagnostics	A93
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	BioLabs	M0492S
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Reinforced clostridia media	BD	218081
Thin Forceps	Millipore Sigma	F4017	Other suppliers can be used
Trypticase Soy Agar (TSA II) with 5% sheep blood	Thermo scientific	221261