Комплексный подход к микробной изоляции из туннелей гнойного гидраденита

Резюме

Мы демонстрируем метод успешной изоляции привередливых и анаэробных организмов из кожных синусовых ходов (туннелей) в тканях, иссеченных у пациентов с гнойным гидраденитом.

Аннотация

Гнойный гидраденит (ГС) — это изнурительное состояние, характеризующееся болезненными узелками и абсцессами, прогрессирующими в синусовые тракты (туннели) в дермальных слоях кожи, вызывая значительный дискомфорт, неприятные выделения, обезображивание, контрактуры и рубцы, которые серьезно снижают качество жизни. СГ связан с изменениями в микробиоме кожи, влияя на иммунную регуляцию и защиту кожи от вредных бактерий. Несмотря на распространенность, вклад микробиома HS в патологию заболевания и ограниченный ответ на лечение остаются в значительной степени неизвестными. На сегодняшний день в ходе многочисленных исследований секвенирования 16S рРНК в тканях ГС была достигнута только зернистость на уровне рода, выявлено увеличение количества грамотрицательных анаэробов и уменьшение кожных комменсалов. Более глубокое понимание микробного дисбактериоза у людей с СГ имеет важное значение для оптимизации стратегий лечения. Это требует двустороннего подхода к оценке микробиома HS, включая выделение видов бактерий, которые часто недостаточно используются в трансляционных исследованиях, посвященных кожным заболеваниям. Выделение отдельных микроорганизмов из тканей ГС имеет решающее значение для выяснения роли бактерий в патогенезе ГС. В этой статье мы выделяем воспроизводимые методы успешной изоляции анаэробных патогенов из туннельной ткани ГС, обеспечивая первый и наиболее важный шаг в понимании роли бактерий в ГС. Этот метод прокладывает путь к целенаправленным исследованиям микробного вклада в СГ и к разработке более эффективных, персонализированных стратегий лечения, направленных на устранение сложного микробного бремени этого хронического заболевания.

Введение

Гнойный гидраденит (ГС) является распространенным дерматологическим заболеванием, характеризующимся узелками и абсцессами, которые прогрессируют в синусовые тракты (туннели), образующиеся в дермальном и подкожном слоях кожи, вызывая значительную боль, вызывая гнойные выделения, обезображивание и изнурительные психосоциальные последствия ^1,2. СГ непропорционально поражает женщин и лиц с цветной кожей, обычно возникающей в позднем подростковом или раннем взрослом возрасте². Тяжелые физические симптомы этого состояния усугубляются его глубокими психосоциальными последствиями, включая депрессию, тревогу и социальную изоляцию, которые могут серьезно снизить качество жизни³. Туннели ГС, сформированные на поздней стадии заболевания, значительно снижают вероятность ответа пациентов на апробированную в настоящее время биологическую терапию, а хирургическое иссечение остается единственным подходом к лечению ^4,5.

Многочисленные исследования охарактеризовали микробиом, связанный с туннелями HS, показав преобладание анаэробных патогенов и снижение численности кожных комменсалов ^6,7,8, при этом недавние исследования выявили Porphyromonas spp. (тип I) и Prevotella spp. (IV) в туннелях, среди других родов⁹. В другом исследовании была обнаружена вариабельность микробиома HS в зависимости от глубины забора образца ткани, что подтверждает уникальность микробного состава в ткани туннеля¹⁰. Кроме того, было показано, что дисбиоз влияет на иммунный ответ при СГ, что еще больше указывает на роль микробов в патогенезе заболевания 11,12,13,14. Несмотря на ^{то, что} длительное системное лечение антибиотиками клиндамицином, рифампицином и тетрациклинами используется и показало снижение количества дренажных туннелей у пациентов^с ГС, данные об устойчивых к антибиотикам анаэробных патогенах при ГС остаются неизвестными. До сих пор не сообщалось об изоляции штаммов бактерий из туннелей HS, что ограничивает исследования новых антимикробных методов лечения и углубленную оценку вклада патогенов в патогенез заболевания HS. Стандартизация методов выделения патогенов не только способствовала бы истинному пониманию роли бактерий в патогенезе СГ, но и позволила бы перейти к более целенаправленным и усовершенствованным вмешательствам.

В этой статье мы расскажем о методе успешной изоляции микроорганизмов из туннельной ткани HS. Выделение отдельных видов бактерий является решающим, начальным шагом в понимании их роли в патологии СГ. Этот метод прокладывает путь к целенаправленным исследованиям микробного вклада в СГ и к разработке более эффективных, персонализированных стратегий лечения, направленных на борьбу с бактериальными патогенами при этом хроническом состоянии.

протокол

Этот протокол был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) при Университете Майами (протокол #20200187). Информированное согласие получают от пациентов (n = 18, средний возраст ± стандартное отклонение = 30,9 ± 9,4, 12 женщин, 6 мужчин) с диагнозом HS-туннели и/или их законных опекунов до начала процедуры после предварительного обсуждения исследований, чтобы можно было решить любые опасения или вопросы.

1. Забор образцов у пациента

1. Перед обработкой иссеченной ткани соблюдайте строгие стерильные меры предосторожности, чтобы свести к минимуму риск заражения. Человек, работающий с тканью, должен быть одет в лабораторный халат, маску для лица и хирургическую шапочку, а также использовать стерильные перчатки и стерильные инструменты для работы с тканью.
2. Для контроля стерильности перед обработкой ткани погрузите предварительно автоклавированные щипцы в анаэробный транспортный флакон (Таблица материалов).
3. Соберите кожную ткань, хирургически резецированную с помощью скальпеля или лазера CO₂ , из пораженных участков пациентов с диагнозом HS-туннели и немедленно поместите ее в стерильную чашку Петри с помощью стерильных щипцов для дальнейшей обработки.
4. Находясь в хирургическом центре или амбулаторном кабинете клиники, определите туннели в иссеченных тканях, прощупывая кожу предварительно автоклавированными щипцами, как показано на рисунке 1A.
5. Сразу после иссечения тканей проведите 6-миллиметровую пункционную биопсию через полнотолщину кожи идентифицированного туннеля и погрузите в полутвердую буферную среду с восстановителями в анаэробной системе транспортных стеклянных флаконов для оптимизации выживаемости анаэробных видов бактерий для дальнейшего анализа.
6. Транспортировка туннельной ткани в анаэробных флаконах в лабораторию на льду.
7. Выполните разработку образца документации, как описано ниже.
   1. В день процедуры соберите информацию о пациенте, включая демографические данные, возраст, этническую принадлежность/расу и принимаемые лекарства, без каких-либо личных идентификаторов. Участки тела резецированной ткани сопровождают карту тела, поскольку туннели HS могут возникать на нескольких участках тела. Сделайте фотографии иссеченной ткани с обеих сторон образца до и после обработки ткани, документируя местоположение биопсии, полученной из туннеля. По прибытии в лабораторию занесите закодированные образцы тканей без каких-либо персональных идентификаторов в электронную защищенную базу данных.

2. Обработка кожи HS

1. Настройка и нанесение покрытия
   1. Наденьте лабораторный халат и перчатки, а также завяжите волосы, чтобы избежать загрязнения. Предварительно подогреть кровяные агаровые тарелки, в том числе агар Laked Brucella с агаром Канамицин и Ванкомицин (LKV), Триптиказ Соевый агар (TSA II) 5% Овечья кровь (SB), Brain Heart Infusion (BHI) и Фенилэтиловый спиртовой агар (PEA) с 5% SB агаром до 37 °C в инкубаторе в течение 10 минут. Перед обработкой салфетки очистите шкаф биобезопасности с 70% этанолом.
   2. После того, как агаровые пластины нагреются, наклейте на основание или боковую сторону пластины закодированное название образца и дату. Поместите в шкаф биобезопасности автоклавные щипцы, скальпели, предварительно стерилизованные петли для инокуляции и агаровые пластины.
   3. Извлеките 6-миллиметровый пунш-биопсию из анаэробного транспортного флакона с помощью стерильных щипцов, погрузив щипцы в среду. Быстро измельчите ткань на небольшие кусочки, примерно по 1 мм² каждая, с помощью стерильного скальпеля. Поместите ткань в стерильную микроцентрифужную пробирку, содержащую 500 μл армированной клостридиальной среды (RCM), и кратковременно сделайте вихрь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация не использовалась, потому что образцы подвергались воздействию аэробной среды в течение длительного периода времени, что могло привести к дополнительной аэрации во время процесса и потенциальной потере анаэробных бактерий.
   4. Используя новую стерильную петлю, выполните повторное полосирование квадрантной суспензии, содержащей бактериальные организмы, на агаровые планшеты TSA II 5% SB, LKV, PEA с 5% SB и BHI.
   5. Используя оставшуюся измельченную тканевую суспензию, сделать запасы глицерина, добавив в криопробирку 20% v/v стерильного глицерина и 80% v/v тканевой суспензии. Запасы глицерина хранятся при температуре 80 °C. В случае ограниченной жизнеспособности выделенных бактерий для повторения выделения можно использовать запасы тканей.
   6. Поместите все планшеты в инкубатор при температуре 37 °C в анаэробную камеру, закрытую пакетом CO₂ . Проверяйте пластины каждые 2-3 дня, ожидая роста анаэробов через 7-14 дней после нанесения покрытия. Документируйте морфологию колоний с помощью фотографирования пластин.
2. Хранение тканей
   1. Используйте 8-миллиметровую пункционную биопсию для сбора дополнительных образцов кожи на всю толщину через туннель и от него для образца с фиксированным парафином формалина (FFPE) и гистологической оценки, так как больший образец ткани с большей вероятностью захватит весь туннель.
   2. Сохраните дополнительные биопсии с точностью до 6 мм для ДНК (мгновенной заморозки), РНК (в РНК позже) и выделения белков (мгновенной заморозке).
3. Содержание колонии
   1. После того, как колонии будут замечены на оригинальных пластинах, сфотографируйте пластины и обратите внимание на четкую морфологию колоний¹⁷. В целом, можно предположить 10-15 различных морфологий колоний (см. рис. 1).
   2. Приготовьте предварительно подогретые пластины LKV, BHI, PEA с 5% SB и 5% SB агаровыми пластинами TSA II (Таблица материалов). Пометьте каждую табличку с указанием идентификатора образца, места проведения биопсии и даты.
   3. С помощью стерильного наконечника для пипетки возьмите одну колонию и проведите ею зигзагообразным движением по пластине того же типа, на которой она была обнаружена. Затем, используя один и тот же наконечник пипетки с колонией в качестве матрицы для ПЦР-амплификации 16s рДНК, выполните следующие действия.
   4. Повторите шаг 2.3.3, используя колонии, выбранные из всех типов агаровых планшетов, с новым стерильным наконечником пипетки и другой отдельной колонией, морфологией которой отличается от исходной пластины. Опять же, сразу после нанесения полос, используйте наконечник пипетки с оставшейся колонией, чтобы погрузить его в специальную лунку для ПЦР-планшета, так как это обеспечит шаблон для амплификации ПЦР.
   5. Повторяйте шаги 2.3.3-2.3.4 для каждой отдельной колонии до тех пор, пока все колонии со специфической морфологией во всех четырех типах агаровых пластин не будут проточены полосами и соответствующие лунки ПЦР не будут одновременно инокулированы.
   6. Храните только что покрытые агаровые пластины в инкубаторе при температуре 37 °C в анаэробной камере, закрытой пакетом CO₂ . Как только колонии вырастут, обеспечьте чистоту изолированной колонии, прежде чем сохранять бактериальные запасы (см. ниже). Если пластинчатые колонии не имеют однородности, повторите шаг 2.3.3. Выполняйте процесс повторного покрытия каждые 4-5 дней, в зависимости от роста колонии, пока колонии не станут однородными по внешнему виду.
4. Идентификация видов бактерий с помощью секвенирования колонии 16s рДНК с помощью ампликона
   1. Приготовьте ПЦР-планшет с мастер-смесью, состоящей из 2,5 мкл 10 мкМ 16S рДНК V1-V3 прямого (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') и обратного праймеров (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12,5 мкл 2x полимеразы Master Mix и 10 мкл воды без микробной ДНК на лунку общим объемом 25 мкл на колонию.
   2. Рассчитать необходимый для амплификации объем мастер-смеси ПЦР из всех выбранных колоний, отрицательный контроль (без шаблона) и положительный контроль - можно использовать любой лабораторный штамм; мы обычно используем Staphylococcus aureus USA300.
   3. Поднесите ПЦР-планшет в шкаф биобезопасности, накрыв лунки во избежание загрязнения. Для нанесения покрытия используйте одну колонию из стерильного наконечника для дозатора. Немедленно восстановите суспендию колонии с помощью тщательного закручивания в предназначенную лунку с предварительно заполненной мастер-смесью. Используйте один и тот же наконечник для пипетки как для субкультивирования, так и для отбора проб для ПЦР.
   4. Повторите шаг 2.4.3 для всех единичных колоний HS и положительного контроля.
   5. Провести ПЦР по следующему протоколу: 95 °C в течение 5 мин для начальной денатурации, необходимой для лизирования выбранной колонии, затем 40 циклов 95 °C в течение 15 с, 54 °C в течение 1 мин, использование заключительного цикла 4 °C не является обязательным. Термоамплификатор также можно использовать с теми же настройками программы.
   6. Запустите гель-электрофорез с амплифицированными продуктами количественной ПЦР для проверки размера ампликона, который, как ожидается, составит 311.о. (Рисунок 2). Компания Purify успешно амплифицировала фрагмент 16s рДНК с помощью набора для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
   7. Отправьте очищенный продукт ПЦР на секвенирование 16S рибосомальной РНК по Сэнгеру с использованием прямых и обратных праймеров 16S рДНК V1-V3.
5. Бактериальные запасы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Привередливые анаэробы известны своей ограниченной жизнеспособностью на агаровых пластинах.
   1. Чтобы обеспечить сохранность штамма до получения результатов секвенирования, которые подтвердят видовую идентичность, получить агаровые пластины из одной колонии и подтвердить чистоту для получения запасов. Создание заготовок непосредственно из агаровой пластины параллельно с оптимизацией условий роста в жидких средах.
   2. Чтобы приготовить подвой из планшета, созданного на шаге 2.3, используйте стерильную петлю для инокуляции диаметром 6 мм, чтобы собрать как можно больше однородных колоний. Затем энергично ресуспендируйте бактерии в 800 мкл RCM с 20% стерильным глицерином в криопробирках и храните их при температуре -80 °C для создания бактериального запаса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обеспечивает своевременное сохранение привередливых патогенов до получения характеристик с помощью данных секвенирования.
   3. Проведите оптимизацию роста ликвидной культуры и генерирование подвоев из одной колонии после подтверждения классификации штамма.

Результаты

В этом исследовании мы описываем протокол выделения и характеристики анаэробных бактерий из туннелей HS. Этот протокол является новым и примечательным тем, что создает потенциал для проверки функции и вирулентности этих бактерий с использованием моделей кожных инфе?...

Обсуждение

В этом исследовании мы представляем новый метод выделения и поддержания бактерий, колонизирующих туннели HS. Этот воспроизводимый метод позволит не только глубоко охарактеризовать штаммы, присутствующие в этих патологических структурах, но и провести последующие фу...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6mm punch biospy	INTEGRA	33-36	Other suppliers can be used
8mm punch biospy	INTEGRA	33-37	Other suppliers can be used
Agarose	Sigma Aldrich	A9539	Other suppliers can be used
Anaerobic Chambers	BD	260672
Anaerobic Transport Media	Anaerobic Systems	AS-911
Brain heart Infusion Agar	Anaerobic Systems	AS-6426
CO2 gaspak	BD	260678
Difco Reinforced Clostridial Medium	BD	218081
Glycerol	SIGMA	G5516-1L	Other suppliers can be used
Hard shell PCR plates	BIO-RAD	HSP9601	Other suppliers can be used
Incubator	VWR	Symphony	Any callibrated incubator can be used
Inoculation loops	VWR	76544-926	Other suppliers can be used
LKV agar	HARDY Diagnostics	A60
Microbial DNA-Free Water	Qiagen	338132
Nunc CryoTube	Thermo scientific	377267	Other suppliers can be used
PCR (CFX Connect Real Time System)	BIO-RAD	CFX Connect Optics Module	Regular Themocycler can be used
PEA agar	HARDY Diagnostics	A93
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	BioLabs	M0492S
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Reinforced clostridia media	BD	218081
Thin Forceps	Millipore Sigma	F4017	Other suppliers can be used
Trypticase Soy Agar (TSA II) with 5% sheep blood	Thermo scientific	221261