Abordagem abrangente para isolamento microbiano de túneis de hidradenite supurativa

Resumo

Apresentamos um método para isolar com sucesso organismos fastidiosos e anaeróbicos de tratos sinusais cutâneos (túneis) em tecidos excisados de pacientes com hidradenite supurativa.

Resumo

A hidradenite supurativa (HS) é uma condição debilitante marcada por nódulos e abscessos dolorosos, progredindo para tratos sinusais (túneis) dentro das camadas dérmicas da pele, causando desconforto significativo, secreção fétida, desfiguração, contraturas e cicatrizes, que diminuem severamente a qualidade de vida. A HS está associada a alterações no microbioma da pele, afetando a regulação imunológica e a defesa da pele contra bactérias nocivas. Apesar de sua prevalência, a contribuição do microbioma HS para a patologia da doença e a resposta limitada ao tratamento permanecem amplamente desconhecidas. Até o momento, vários estudos de sequenciamento de rRNA 16S no tecido HS alcançaram apenas granularidade em nível de gênero, identificando um aumento nos anaeróbios Gram-negativos e uma diminuição nos comensais da pele. Uma compreensão mais profunda da disbiose microbiana em indivíduos com HS é essencial para otimizar as estratégias de tratamento. Isso requer uma abordagem em duas frentes para avaliar o microbioma HS, incluindo o isolamento de espécies bacterianas, que muitas vezes são subutilizadas em estudos translacionais focados em doenças da pele. Isolar microrganismos individuais do tecido HS é crucial para elucidar o papel das bactérias na patogênese da HS. Aqui, destacamos métodos reprodutíveis para isolar com sucesso patógenos anaeróbicos do tecido do túnel HS, fornecendo a etapa inicial e mais crítica na compreensão do papel bacteriano no HS. Este método abre caminho para pesquisas direcionadas sobre contribuições microbianas para a HS e para o desenvolvimento de estratégias de tratamento mais eficazes e personalizadas que abordam a complexa carga microbiana dessa condição crônica.

Introdução

A hidradenite supurativa (HS) é uma condição dermatológica comum caracterizada por nódulos e abscessos que progridem para tratos sinusais (túneis) formados nas camadas dérmica e subcutânea da pele, causando dor significativa, produzindo secreção purulenta, desfiguração e sequelas psicossociais debilitantes ^1,2. A EH afeta desproporcionalmente mulheres e indivíduos com pele de cor, surgindo tipicamente no final da adolescência ou início da idade^{adulta 2}. Os sintomas físicos graves da condição são agravados por seu profundo impacto psicossocial, incluindo depressão, ansiedade e isolamento social, que podem diminuir severamente a qualidade de vida³. Os túneis de HS formados no estágio avançado da doença diminuem significativamente as chances de resposta dos pacientes à terapia biológica atualmente aprovada, e a excisão cirúrgica continua sendo a única abordagem de tratamento ^4,5.

Múltiplos estudos têm caracterizado o microbioma associado aos túneis de HS, mostrando uma prevalência de patógenos anaeróbios e uma abundância reduzida de comensais cutâneos ^6,7,8, com estudos recentes identificando Porphyromonas spp. (tipo I) e Prevotella spp. (IV) em túneis, entre outros gêneros⁹. Outro estudo encontrou variação no microbioma HS pela profundidade da amostragem do tecido, confirmando a singularidade da composição microbiana no tecido do túnel¹⁰. Além disso, a disbiose demonstrou afetar a resposta imune na HS, implicando ainda mais o papel dos micróbios na patogênese da doença 11,12,13,14. Embora o tratamento antibiótico sistêmico prolongado com clindamicina, rifampicina e tetraciclinas esteja em uso e tenha mostrado uma redução do número de túneis de drenagem nos pacientes afetados^15,16, os dados sobre patógenos anaeróbios resistentes a antibióticos na HS permanecem desconhecidos. Até agora, o isolamento de cepas bacterianas dos túneis de HS não foi relatado, limitando os estudos sobre novos tratamentos antimicrobianos e a avaliação aprofundada da contribuição dos patógenos para a patogênese da doença de HS. A padronização de métodos para isolamento de patógenos não apenas facilitaria insights verdadeiros sobre o papel bacteriano na patogênese da HS, mas também permitiria a tradução para intervenções mais direcionadas e aprimoradas.

Aqui, destacamos um método para isolar com sucesso microrganismos do tecido do túnel HS. Isolar espécies bacterianas individuais é um passo inicial crucial para entender seu papel na patologia HS. Este método abre caminho para pesquisas direcionadas sobre as contribuições microbianas para a HS e para o desenvolvimento de estratégias de tratamento mais eficazes e personalizadas que abordam patógenos bacterianos nessa condição crônica.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade de Miami (protocolo #20200187). O consentimento informado é obtido de pacientes (n = 18, idade média ± desvio padrão = 30,9 ± 9,4, 12 mulheres, 6 homens) diagnosticados com túneis de HS e/ou seu(s) responsável(is) legal(is) antes do procedimento após discussão prévia da pesquisa para permitir que quaisquer preocupações ou questões sejam abordadas.

1. Coleta de amostras de pacientes

1. Antes de manusear o tecido excisado, use precauções estéreis rigorosas para minimizar o risco de contaminação. O indivíduo que manuseia o tecido deve usar jaleco, máscara facial e touca cirúrgica e usar luvas estéreis e instrumentos estéreis para manusear o tecido.
2. Para controle de esterilidade, mergulhe a pinça pré-autoclavada no frasco de transporte anaeróbico antes de processar o tecido (Tabela de Materiais).
3. Colete tecido cutâneo, ressecado cirurgicamente por meio de bisturi ou laser de CO₂ , de áreas afetadas de pacientes diagnosticados com túneis de HS e coloque-o imediatamente em uma placa de Petri estéril usando uma pinça estéril para processamento posterior.
4. Enquanto estiver no centro cirúrgico ou no consultório ambulatorial, identifique os túneis dentro do tecido excisado sondando a pele com uma pinça pré-autoclavada, conforme mostrado na Figura 1A.
5. Faça biópsias por punção de 6 mm através da pele de espessura total do túnel identificado imediatamente após a excisão do tecido e mergulhe no meio tamponado semissólido com agentes redutores nos frascos de vidro de transporte do sistema anaeróbico para otimizar a sobrevivência de espécies bacterianas anaeróbicas para análise posterior.
6. Transportar o tecido do túnel nos frascos anaeróbicos para o laboratório no gelo.
7. Execute a documentação de exemplo conforme descrito abaixo.
   1. No dia do procedimento, colete informações do paciente, incluindo dados demográficos, idade, etnia/raça auto-relatada e medicamentos atuais, sem quaisquer identificadores pessoais. Os locais corporais do tecido ressecado acompanham um gráfico corporal, pois os túneis HS podem ocorrer em vários locais do corpo. Tire fotografias do tecido excisado de ambos os lados da amostra antes e depois do processamento do tecido, documentando a localização da biópsia gerada a partir de um túnel. Na chegada ao laboratório, registre as amostras de tecido codificadas sem quaisquer identificadores pessoais em um banco de dados eletrônico seguro.

2. Processamento da pele do HS

1. Configuração e chapeamento
   1. Use jaleco e luvas e amarre o cabelo para evitar contaminação. Placas de ágar sangue pré-quente, incluindo ágar Laked Brucella Blood com ágar canamicina e vancomicina (LKV), ágar tripticase soja (TSA II) ágar 5% de sangue de ovelha (SB), infusão cerebral e coração (BHI) e ágar álcool feniletil (PEA) com ágar 5% SB a 37 °C em uma incubadora por 10 min. Limpe o gabinete de biossegurança com etanol a 70% antes do processamento do tecido.
   2. Assim que as placas de ágar estiverem aquecidas, rotule a base ou o lado da placa com o nome da amostra codificada e a data. Coloque pinças autoclavadas, bisturis, alças de inoculação pré-esterilizadas e placas de ágar no gabinete de biossegurança.
   3. Remova a biópsia por punção de 6 mm do frasco de transporte anaeróbico com pinça estéril, submergindo a pinça no meio. Corte rapidamente o tecido em pedaços pequenos, de aproximadamente 1 mm² cada, usando um bisturi estéril. Coloque o tecido em um tubo de microcentrífuga estéril contendo 500 μL de meio clostridial reforçado (RCM) e faça um vórtice brevemente.
      NOTA: A homogeneização não foi utilizada porque as amostras seriam expostas ao ambiente aeróbio por um período prolongado, o que poderia levar a aeração adicional durante o processo e perda potencial de bactérias anaeróbias.
   4. Usando uma nova alça estéril, execute repetidas listras de quadrante da suspensão de tecido contendo organismos bacterianos nas placas de ágar TSA II 5% SB, LKV, PEA com 5% SB e BHI.
   5. Usando a suspensão de tecido picado restante, faça estoques de glicerol adicionando 20% de glicerol estéril v / v e 80% de suspensão de tecido v / v em um criotubo. Armazene os estoques de glicerol a 80 °C. No caso de viabilidade limitada de bactérias isoladas, os estoques de tecidos podem ser usados para repetir o isolamento.
   6. Colocar todas as placas na incubadora a 37 °C numa câmara anaeróbia fechada com uma embalagem de CO₂ . Verifique as placas a cada 2-3 dias, esperando o crescimento de anaeróbios 7-14 dias após o revestimento. Documente as morfologias das colônias fotografando placas.
2. Banco de tecidos
   1. Use uma biópsia por punção de 8 mm para coletar amostras adicionais de pele de espessura total através do túnel e longe do túnel para amostra de embebido em parafina fixa em formalina (FFPE) e avaliação histológica, pois uma amostra de tecido maior tem maior probabilidade de capturar o túnel completo.
   2. Preserve biópsias por punção adicionais de 6 mm para DNA (congelamento), RNA (no RNA posteriormente) e isolamento de proteínas (congelamento).
3. Manutenção de colônias
   1. Uma vez que as colônias são observadas nas placas originais, fotografe as placas e anote a morfologia distinta da colônia¹⁷. Em geral, antecipe 10-15 morfologias de colônias diferentes (ver Figura 1).
   2. Prepare LKV, BHI, PEA pré-aquecido com placas de ágar 5% SB e TSA II 5% SB (Tabela de Materiais). Rotule cada etiqueta da placa com o ID da amostra, localização da biópsia e data.
   3. Usando uma ponta de pipeta estéril, pegue uma única colônia e risque-a em zigue-zague no mesmo tipo de placa em que foi detectada. Em seguida, usando a mesma ponta de pipeta com a colônia como modelo para uma amplificação de PCR de rDNA de 16s, siga as etapas abaixo.
   4. Repita a etapa 2.3.3 usando as colônias selecionadas de todos os tipos de placas de ágar com uma nova ponta de pipeta estéril e uma colônia singular diferente da morfologia distinta da placa original. Novamente, imediatamente após o estriamento, use a ponta da pipeta com a colônia restante para submergi-la em um poço de placa de PCR dedicado, pois isso fornecerá um modelo para amplificação de PCR.
   5. Repita as etapas 2.3.3-2.3.4 para cada colônia distinta até que todas as colônias com morfologias específicas em todos os quatro tipos de placas de ágar tenham sido listradas e os poços de PCR correspondentes tenham sido inoculados simultaneamente.
   6. Conservar as placas de ágar-ágar recém-plaqueadas na incubadora a 37 °C numa câmara anaeróbia fechada com uma embalagem de CO₂ . Uma vez que as colônias crescem, garanta a pureza da colônia isolada antes de preservar os estoques bacterianos (veja abaixo). Se as colônias plaqueadas não tiverem uniformidade, repita a etapa 2.3.3. Execute o processo de replaqueamento a cada 4-5 dias, dependendo do crescimento da colônia, até que as colônias tenham uma aparência uniforme.
4. Identificação de espécies bacterianas por sequenciamento de amplicon de colônias de rDNA 16s
   1. Prepare uma placa de PCR com uma mistura principal composta por 2,5 μL de 10 μM 16S rDNA V1-V3 direto (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') e primers reversos (5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12,5 μL de polimerase 2x Master Mix e 10 μL de água microbiana livre de DNA por poço para um volume total de 25 μL por colônia.
   2. Calcular o volume de uma mistura principal de PCR necessária para amplificação de todas as colónias seleccionadas, controlo negativo (sem molde) e controlo positivo - pode ser utilizada qualquer estirpe de laboratório; comumente usamos Staphylococcus aureus USA300.
   3. Traga uma placa de PCR para o gabinete de biossegurança, cobrindo os poços para evitar contaminação. Use uma única colônia de uma ponta de pipeta estéril para o revestimento. Ressuspenda imediatamente a colônia com um giro rigoroso no poço designado com a mistura master pré-preenchida. Use a mesma ponta de pipeta para subcultura e amostragem para PCR.
   4. Repita a etapa 2.4.3 para todas as colônias HS singulares e controle positivo.
   5. Execute PCR com o seguinte protocolo: 95 °C por 5 min para desnaturação inicial necessária para lisar a colônia selecionada, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 15 s, 54 °C por 1 min, o uso do ciclo final de 4 °C é opcional. Um termociclador também pode ser usado com as mesmas configurações do programa.
   6. Execute eletroforese em gel com produtos de qPCR amplificados para verificar o tamanho do amplicon, que deve ser de 311 pb (Figura 2). Purifique com sucesso o fragmento de rDNA lificado de 16s com o kit de purificação PCR de acordo com as instruções do fabricante.
   7. Envie o produto de PCR purificado para sequenciamento de RNA ribossômico Sanger 16S usando primers diretos e reversos 16S rDNA V1-V3.
5. Estoques bacterianos
   NOTA: Os anaeróbios fastidiosos são conhecidos por sua viabilidade limitada nas placas de ágar.
   1. A fim de garantir a preservação da cepa antes da obtenção dos resultados do sequenciamento, que confirmarão a identidade da espécie, gere placas de ágar a partir de uma única colônia e confirme a pureza para gerar estoques. Gere estoques diretamente da placa de ágar em paralelo com a otimização das condições de crescimento no meio líquido.
   2. Para preparar o estoque a partir da placa gerada na etapa 2.3, use uma alça de inoculação estéril de 6 mm para coletar o maior número possível de colônias uniformes. Em seguida, ressuspenda vigorosamente as bactérias em 800 μL de RCM com 20% de glicerol estéril em criotubos e armazene-as a -80 °C para criar um estoque bacteriano.
      NOTA: Esta etapa garante a preservação oportuna de patógenos exigentes antes de obter a caracterização por sequenciamento de dados.
   3. Realizar a otimização do crescimento em cultura líquida e geração de estoques a partir de uma única colônia, uma vez confirmada a classificação da cepa.

Resultados

Neste estudo, descrevemos um protocolo para o isolamento e caracterização de bactérias anaeróbias de túneis de HS. Este protocolo é novo e notável por criar o potencial de testar a função e a virulência dessas bactérias usando modelos de infecção de pele in vitro, ex vivo e in vivo para aumentar nossa compreensão da contribuição microbiana para a patogênese da HS. Primeiro, identificamos os túneis da pele ressecada sondando-os com pinças est?...

Discussão

Neste estudo, apresentamos um novo método para isolar e manter bactérias colonizando túneis de HS. Este método reprodutível não só permitirá a caracterização aprofundada das cepas presentes nessas estruturas patológicas, mas também permitirá estudos funcionais subsequentes explorando o papel de micróbios específicos na patogênese da HS. As etapas críticas do protocolo incluem coleta e transporte de tecidos em meio anaeróbico, o que facilita a preservação de microrgani...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6mm punch biospy	INTEGRA	33-36	Other suppliers can be used
8mm punch biospy	INTEGRA	33-37	Other suppliers can be used
Agarose	Sigma Aldrich	A9539	Other suppliers can be used
Anaerobic Chambers	BD	260672
Anaerobic Transport Media	Anaerobic Systems	AS-911
Brain heart Infusion Agar	Anaerobic Systems	AS-6426
CO2 gaspak	BD	260678
Difco Reinforced Clostridial Medium	BD	218081
Glycerol	SIGMA	G5516-1L	Other suppliers can be used
Hard shell PCR plates	BIO-RAD	HSP9601	Other suppliers can be used
Incubator	VWR	Symphony	Any callibrated incubator can be used
Inoculation loops	VWR	76544-926	Other suppliers can be used
LKV agar	HARDY Diagnostics	A60
Microbial DNA-Free Water	Qiagen	338132
Nunc CryoTube	Thermo scientific	377267	Other suppliers can be used
PCR (CFX Connect Real Time System)	BIO-RAD	CFX Connect Optics Module	Regular Themocycler can be used
PEA agar	HARDY Diagnostics	A93
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	BioLabs	M0492S
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Reinforced clostridia media	BD	218081
Thin Forceps	Millipore Sigma	F4017	Other suppliers can be used
Trypticase Soy Agar (TSA II) with 5% sheep blood	Thermo scientific	221261