화농한선염 터널에서 미생물 분리를 위한 포괄적인 접근법

요약

우리는 화농한선염 환자로부터 절제된 조직의 피부 부비동(터널)에서 까다롭고 혐기성 유기체를 성공적으로 분리하는 방법을 보여줍니다.

초록

화농한선염(HS)은 고통스러운 결절과 농양이 특징인 쇠약해지는 상태로, 피부 진피층 내의 부비동(터널)으로 진행되어 심각한 불편함, 악취가 나는 분비물, 기형, 구축 및 흉터를 유발하여 삶의 질을 심각하게 떨어뜨립니다. HS는 피부 마이크로바이옴의 변화와 관련이 있으며, 면역 조절과 해로운 박테리아에 대한 피부 방어에 영향을 미칩니다. 이 질병의 만연에도 불구하고, HS 마이크로바이옴이 질병 병리학에 기여하고 치료에 대한 제한된 반응은 크게 알려지지 않았습니다. 현재까지 HS 조직에 대한 여러 16S rRNA 염기서열분석 연구는 그람 음성 혐기성 세포의 증가와 피부 공성의 감소를 확인하면서 속 수준의 세분화만을 달성했습니다. HS 환자의 미생물 세균 불균형에 대한 심층적인 이해는 치료 전략을 최적화하는 데 필수적입니다. 이를 위해서는 피부 질환에 초점을 맞춘 중개 연구에서 종종 활용되지 않는 박테리아 종의 분리를 포함하여 HS 마이크로바이옴을 평가하기 위한 두 가지 접근 방식이 필요합니다. HS 조직에서 개별 미생물을 분리하는 것은 HS 발병기전에서 박테리아의 역할을 밝히는 데 중요합니다. 여기에서는 HS 터널 조직에서 혐기성 병원체를 성공적으로 분리하기 위한 재현 가능한 방법을 강조하여 HS에서 박테리아의 역할을 이해하는 데 있어 가장 초기이자 가장 중요한 단계를 제공합니다. 이 방법은 HS에 대한 미생물의 기여에 대한 표적 연구와 이 만성 질환의 복잡한 미생물 부담을 해결하는 보다 효과적이고 개인화된 치료 전략을 개발하기 위한 길을 열어줍니다.

서문

화농한선염(HS)은 결절과 농양이 피부의 진피층과 피하층 내에 형성된 부비동(터널)으로 진행되어 심한 통증을 유발하고, 화농성 분비물, 기형 기형을 유발하며, 쇠약해지는 심리사회적 후유증을 특징으로 하는 흔한 피부과 질환이다 ^1,2. HS는 여성과 유색인종 피부를 가진 개인에게 불균형적으로 영향을 미치며, 일반적으로 청소년기 후반 또는 성인 초기에 발생합니다². 이 질환의 심각한 신체적 증상은 우울증, 불안, 사회적 고립을 포함한 심오한 심리사회적 영향으로 인해 더욱 악화되며, 이는 삶의 질을 심각하게 떨어뜨릴 수 있습니다³. 질병이 진행된 단계에서 형성된 HS 터널은 현재 승인된 생물학적 요법에 대한 환자의 반응 확률을 현저히 감소시키며, 외과적 절제가 유일한 치료 방법으로 남아 있다 ^4,5.

여러 연구에서 HS 터널과 관련된 마이크로바이옴을 특성화하여 혐기성 병원체의 유병률과 피부 공생체의 풍부함 감소를 보여주었으며 ^6,7,8 최근 연구에서는 터널에서 Porphyromonas spp. (type I) 및 Prevotella spp. (IV)를 확인했습니다⁹. 또 다른 연구에서는 조직 샘플링의 깊이에 따른 HS 마이크로바이옴의 변동을 발견하여 터널 조직 내 미생물 구성의 고유성을 확인했습니다¹⁰. 또한, dysbiosis는 HS의 면역 반응에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이는 질병 발병기전에서 미생물의 역할을 더욱 암시합니다 11,12,13,14. 클린다마이신(clindamycin), 리팜피신(rifampicin) 및 테트라사이클린(tetracycline)을 이용한 장기간의 전신 항생제 치료가 사용되고 있으며 영향을 받은 환자에서 배액 터널의 수가 감소한 것으로 나타났지만^15,16, HS의 항생제 내성 혐기성 병원체에 대한 데이터는 아직 알려지지 않았습니다. 지금까지 HS 터널에서 박테리아 균주를 분리하는 것은 보고되지 않았으며, 이는 새로운 항균 치료에 대한 연구와 HS의 질병 발병에 대한 병원체의 기여도에 대한 심층 평가에 대한 연구를 제한하고 있습니다. 병원체 분리 방법의 표준화는 HS의 발병기전에서 박테리아의 역할에 대한 진정한 통찰력을 촉진할 뿐만 아니라 보다 표적화되고 개선된 중재로 전환할 수 있습니다.

여기에서는 HS 터널 조직에서 미생물을 성공적으로 분리하는 방법을 강조합니다. 개별 박테리아 종을 분리하는 것은 HS 병리학에서 박테리아 종의 역할을 이해하는 데 중요한 초기 단계입니다. 이 방법은 HS에 대한 미생물의 기여에 대한 표적 연구와 이 만성 질환에서 박테리아 병원체를 다루는 보다 효과적이고 개인화된 치료 전략을 개발하기 위한 길을 열어줍니다.

프로토콜

이 프로토콜은 마이애미 대학교의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다(프로토콜 #20200187). HS 터널 진단을 받은 환자(n = 18, 평균 연령 ± 표준 편차 = 30.9 ± 9.4, 여성 12명, 남성 6명) 및/또는 이전 연구 논의 후 시술 전에 법적 보호자로부터 정보에 입각한 동의를 얻어 우려 사항이나 질문을 해결할 수 있습니다.

1. 환자 샘플 수집

1. 절제된 조직을 취급하기 전에 오염 위험을 최소화하기 위해 엄격한 멸균 예방 조치를 취하십시오. 조직을 다루는 개인은 실험실 가운, 안면 마스크 및 수술 모자를 착용해야 하며 멸균 장갑과 멸균 기구를 사용하여 조직을 취급해야 합니다.
2. 무균 제어를 위해 조직을 처리하기 전에 사전 오토클레이브 된 겸자를 혐기성 운송 바이알에 담그십시오 (Table of Materials).
3. HS 터널로 진단된 환자의 영향을 받은 부위에서 메스 또는 CO₂ 레이저를 사용하여 외과적으로 절제된 피부 조직을 수집하고 추가 처리를 위해 멸균 겸자를 사용하여 멸균 페트리 접시에 즉시 넣습니다.
4. 수술 센터 또는 외래 환자 클리닉 사무실에 있는 동안 그림 1A와 같이 사전 오토클레이브 겸자로 피부를 조사하여 절제된 조직 내의 터널을 식별합니다.
5. 조직 절제 직후 식별된 터널의 전체 두께 피부를 통해 6mm 펀치 생검을 수행하고 혐기성 시스템 운반 유리 바이알의 환원제가 포함된 반고체 완충 매체에 담궈 추가 분석을 위해 혐기성 박테리아 종의 생존을 최적화합니다.
6. 혐기성 바이알의 터널 조직을 얼음 위의 실험실로 운반합니다.
7. 아래 설명된 대로 샘플 설명서를 수행합니다.
   1. 시술 당일에는 개인 식별자 없이 인구 통계, 연령, 자가 보고한 민족/인종, 현재 복용 중인 약물을 포함한 환자 정보를 수집합니다. 절제된 조직의 신체 부위는 신체 차트와 함께 제공되며, HS 터널은 여러 신체 부위에서 발생할 수 있습니다. 조직 처리 전후로 샘플의 양쪽에서 절제된 조직의 사진을 찍어 터널에서 생성된 생검의 위치를 문서화합니다. 실험실에 도착하면 개인 식별자 없이 암호화된 조직 샘플을 안전한 전자 데이터베이스에 기록합니다.

2. HS 피부 가공

1. 설정 및 도금
   1. 실험복과 장갑을 착용하고 머리를 묶어 오염을 방지하십시오. 카나마이신 및 반코마이신(LKV) 한천이 함유된 Laked Brucella Blood 한천, TSA II(Trypticase Soy 한천) 5% 양혈(SB) 한천, Brain Heart Infusion(BHI) 및 5% SB 한천이 포함된 페닐에틸 알코올 한천(PEA)을 포함한 사전 예열 혈액 한천을 10분 동안 인큐베이터에서 37°C까지 가열합니다. 조직을 처리하기 전에 70% 에탄올로 생물 안전 캐비닛을 청소하십시오.
   2. 한천 플레이트가 따뜻해지면 플레이트의 바닥이나 측면에 코딩된 샘플 이름과 날짜를 표시합니다. 오토클레이브 집게, 메스, 사전 멸균된 접종 루프 및 한천 플레이트를 생물 안전 캐비닛에 놓습니다.
   3. 멸균 집게가 있는 혐기성 수송 바이알에서 겸자를 배지에 담가 6mm 펀치 생검을 제거합니다. 멸균 메스를 사용하여 조직을 각각 약 1mm² 의 작은 조각으로 빠르게 자릅니다. 500μL의 RCM(Reinforced Clostridial medium)이 포함된 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 조직을 넣고 잠시 와류를 일으킵니다.
      참고: 샘플이 장기간 호기성 환경에 노출되어 공정 중 추가 폭기 및 혐기성 박테리아의 잠재적 손실로 이어질 수 있기 때문에 균질화가 사용되지 않았습니다.
   4. 새로운 멸균 루프를 사용하여 TSA II 5% SB, LKV, PEA 및 5% SB 및 BHI 한천 플레이트에 박테리아 유기체가 포함된 조직 현탁액의 반복적인 사분면 줄무늬를 수행합니다.
   5. 남은 다진 조직 현탁액을 사용하여 크라이오튜브에 20% v/v 멸균 글리세롤과 80% v/v 조직 현탁액을 첨가하여 글리세롤 스톡을 만듭니다. 글리세롤 재고는 80 ° C에서 보관하십시오. 분리된 박테리아의 생존력이 제한된 경우, 조직 스톡을 사용하여 분리를 반복할 수 있습니다.
   6. 인큐베이터의 모든 플레이트를 CO₃₇ 팩으로 둘러싸인 혐기성 챔버에 2°C로 놓습니다. 2-3일마다 플레이트를 점검하고 도금 후 7-14일 동안 혐기성 물질이 자랄 것으로 예상합니다. 플레이트를 촬영하여 군체 형태를 문서화합니다.
2. 조직 은행
   1. 8mm 펀치 생검을 사용하여 더 큰 조직 샘플이 전체 터널을 캡처할 가능성이 더 높기 때문에 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 샘플 및 조직학적 평가를 위해 터널을 통해 터널에서 멀리 떨어진 곳에서 추가 전체 두께 피부 샘플을 수집합니다.
   2. DNA(스냅 동결), RNA(나중에 RNA에서) 및 단백질 분리(스냅 동결)에 대한 추가 6mm 펀치 생검을 보존합니다.
3. 식민지 유지 관리
   1. 원래 판에서 군체가 관찰되면 판을 촬영하고 뚜렷한 군체 형태¹⁷을 기록하십시오. 일반적으로 10-15개의 서로 다른 군체 형태를 예상합니다( 그림 1 참조).
   2. 5% SB 및 TSA II 5% SB 한천 플레이트로 예열된 LKV, BHI, PEA를 준비합니다(재료 표). 각 플레이트 라벨에 샘플 ID, 생검 위치 및 날짜를 표시합니다.
   3. 멸균 피펫 팁을 사용하여 단일 콜로니를 집어 들고 검출된 동일한 유형의 플레이트에 지그재그 동작으로 줄무늬를 만듭니다. 그런 다음 콜로니와 동일한 피펫 팁을 16s rDNA PCR 증폭을 위한 템플릿으로 사용하여 아래 단계를 따릅니다.
   4. 새로운 멸균 피펫 팁과 원래 플레이트와 다른 형태의 다른 단일 콜로니가 있는 모든 유형의 한천 플레이트에서 선택한 콜로니를 사용하여 2.3.3단계를 반복합니다. 다시 말하지만, 줄무늬 직후 피펫 팁을 나머지 콜로니와 함께 사용하여 PCR 증폭을 위한 템플릿을 제공하므로 전용 PCR 플레이트에 잘 담그십시오.
   5. 4가지 유형의 한천 플레이트 모두에서 특정 형태를 가진 모든 콜로니가 줄무늬가 생기고 해당 PCR 웰이 동시에 접종될 때까지 각 개별 콜로니에 대해 2.3.3-2.3.4 단계를 반복합니다.
   6. 새로 도금된 한천 플레이트를 CO₃₇ 팩으로 둘러싸인 혐기성 챔버의 인큐베이터에 2 °C로 보관하십시오. 군체가 성장하면 박테리아 스톡을 보존하기 전에 격리된 군집의 순도를 확인하십시오(아래 참조). 도금된 콜로니가 균일성이 부족하면 2.3.3단계를 반복합니다. 군체의 모양이 균일해질 때까지 군체 성장에 따라 4-5일마다 재도금 과정을 수행하십시오.
4. 16s rDNA 콜로니 앰플리콘 염기서열분석을 통한 박테리아 종 식별
   1. 2.5 μL의 10 μM 16S rDNA V1-V3 정방향(5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3') 및 역방향 프라이머(5' AGAGTTTGATTCCTGGCTCAG-3'; 10 μM), 12.5 μL의 2x 마스터 믹스 중합효소 및 10 μL의 미생물 DNA가 없는 물로 구성된 마스터 믹스로 PCR 플레이트를 준비하여 콜로니당 총 부피 25 μL를 제공합니다.
   2. 선택된 모든 콜로니, 음성 대조군(템플릿 없음) 및 양성 대조군에서 증폭에 필요한 PCR 마스터 믹스의 부피를 계산합니다 - 모든 실험실 균주를 사용할 수 있습니다. 우리는 일반적으로 황색포도상구균 USA300을 사용합니다.
   3. PCR 플레이트를 생물 안전 캐비닛으로 가져와 오염을 방지하기 위해 웰을 덮습니다. 도금을 위해 멸균 피펫 팁의 단일 콜로니를 사용하십시오. 미리 채워진 마스터 믹스와 함께 지정된 우물에 엄격하게 소용돌이치면서 식민지를 즉시 다시 현탁시킵니다. PCR을 위한 subculturing 및 sampling에 동일한 피펫 팁을 사용하십시오.
   4. 모든 특이 HS 콜로니 및 양성 대조군에 대해 2.4.3단계를 반복합니다.
   5. 뒤에 오는 프로토콜로 PCR를 실행하십시오: 선정한 식민지를 용해하기 위하여 요구된 처음 변성을 위해 5 분 동안 95 °C, 15 s 동안 95 °C, 1 분 동안 54 °C의 40 주기에 선행해, 마지막 4 °C 주기의 사용은 선택 사항입니다. thermocycler는 동일한 프로그램 설정과 함께 사용할 수도 있습니다.
   6. 증폭된 qPCR 산물로 겔 전기영동을 실행하여 311bp로 예상되는 앰플리콘의 크기를 확인합니다(그림 2). 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트로 16s rDNA 단편을 성공적으로 증폭했습니다.
   7. 16S rDNA V1-V3 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 16S 리보솜 RNA Sanger 염기서열분석을 위해 정제된 PCR 제품을 보냅니다.
5. 박테리아 스톡(Bacterial stocks)
   참고: 까다로운 혐기성 동물은 한천 플레이트에서 제한된 생존력으로 알려져 있습니다.
   1. 종 정체성을 확인하는 염기서열분석 결과를 얻기 전에 균주 보존을 보장하기 위해 단일 콜로니에서 한천 플레이트를 생성하고 순도를 확인하여 스톡을 생성합니다. 액체 매체의 성장 조건 최적화와 병행하여 한천 플레이트에서 직접 스톡을 생성합니다.
   2. 2.3단계에서 생성된 플레이트에서 스톡을 준비하려면 6mm 멸균 접종 루프를 사용하여 가능한 한 많은 균일한 콜로니를 선택합니다. 그런 다음 냉동 튜브에 20% 멸균 글리세롤과 함께 800μL의 RCM에 박테리아를 격렬하게 재현탁시키고 -80°C에서 보관하여 박테리아 스톡을 만듭니다.
      참고: 이 단계는 염기서열분석 데이터를 통해 특성을 파악하기 전에 까다로운 병원체를 적시에 보존할 수 있도록 합니다.
   3. 균주의 분류가 확인되면 단일 군체에서 액체 배양의 성장과 재고 생성을 최적화합니다.

결과

이 연구에서는 HS 터널에서 혐기성 박테리아를 분리하고 특성화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 HS의 발병에 대한 미생물 기여도에 대한 이해를 높이기 위해 시험관내, 체외외 및 생체 내 피부 감염 모델을 사용하여 이러한 박테리아의 기능과 독성을 테스트할 수 있는 가능성을 창출하는 데 새롭고 주목할 만합니다. 먼저, 절제된...

토론

이 연구에서는 HS 터널에 서식하는 박테리아를 격리하고 유지하는 새로운 방법을 제시합니다. 이 재현 가능한 방법은 이러한 병리학적 구조에 존재하는 균주를 심층적으로 특성화할 수 있을 뿐만 아니라 HS의 발병기전에서 특정 미생물의 역할을 탐구하는 후속 기능 연구도 가능하게 합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계에는 조직 수집 및 혐기성 배지에서의 수송이 포함되?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
6mm punch biospy	INTEGRA	33-36	Other suppliers can be used
8mm punch biospy	INTEGRA	33-37	Other suppliers can be used
Agarose	Sigma Aldrich	A9539	Other suppliers can be used
Anaerobic Chambers	BD	260672
Anaerobic Transport Media	Anaerobic Systems	AS-911
Brain heart Infusion Agar	Anaerobic Systems	AS-6426
CO2 gaspak	BD	260678
Difco Reinforced Clostridial Medium	BD	218081
Glycerol	SIGMA	G5516-1L	Other suppliers can be used
Hard shell PCR plates	BIO-RAD	HSP9601	Other suppliers can be used
Incubator	VWR	Symphony	Any callibrated incubator can be used
Inoculation loops	VWR	76544-926	Other suppliers can be used
LKV agar	HARDY Diagnostics	A60
Microbial DNA-Free Water	Qiagen	338132
Nunc CryoTube	Thermo scientific	377267	Other suppliers can be used
PCR (CFX Connect Real Time System)	BIO-RAD	CFX Connect Optics Module	Regular Themocycler can be used
PEA agar	HARDY Diagnostics	A93
Q5 High Fidelity 2X Master Mix	BioLabs	M0492S
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
Reinforced clostridia media	BD	218081
Thin Forceps	Millipore Sigma	F4017	Other suppliers can be used
Trypticase Soy Agar (TSA II) with 5% sheep blood	Thermo scientific	221261