Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يفصل هذا البروتوكول عزل السكان المناعيين وغير المحصنين الأحياء عن رئة الفأر في حالة مستقرة وبعد عدوى الأنفلونزا. كما يوفر استراتيجيات البوابات لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا الظهارية والنخاعية.

Abstract

تتعرض الرئة باستمرار لمسببات الأمراض والمحفزات البيئية الضارة الأخرى ، مما يجعلها عرضة للتلف والخلل الوظيفي وتطور الأمراض. كانت الدراسات التي تستخدم نماذج الفئران لعدوى الجهاز التنفسي والحساسية والتليف والسرطان حاسمة للكشف عن آليات تطور المرض وتحديد الأهداف العلاجية. ومع ذلك ، فإن معظم الدراسات التي ركزت على رئة الفأر تعطي الأولوية لعزل الخلايا المناعية أو الخلايا الظهارية ، بدلا من كلا المجموعتين في وقت واحد. هنا ، نصف طريقة لإعداد معلق شامل أحادي الخلية لكل من السكان المناعيين وغير المناعيين المناسب لقياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا المنشط بالفلورة. تشمل هذه المجموعات الخلايا الظهارية والخلايا البطانية والخلايا الليفية ومجموعة متنوعة من مجموعات الخلايا النخاعية الفرعية. يستلزم هذا بروتوكول غسل قصبات هوائية وتضخم لاحقة من الرئتين مع متباينة. ثم يتم هضم الرئتين في خليط liberase. تحرر طريقة المعالجة هذه مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المتنوعة وتؤدي إلى تعليق أحادي الخلية لا يتطلب تفككا يدويا ضد مرشح ، مما يعزز بقاء الخلية وينتج عنه أعداد كبيرة من الخلايا الحية لتحليلات المصب. في هذا البروتوكول ، نحدد أيضا مخططات البوابات للمجموعات الفرعية للخلايا الظهارية والنخاعية في كل من الرئتين الساذجة والمصابة بالإنفلونزا. يعد العزل المتزامن للخلايا المناعية الحية وغير المناعية أمرا أساسيا لاستجواب الحديث المتبادل بين الخلايا واكتساب فهم أعمق لبيولوجيا الرئة في الصحة والمرض.

Introduction

تتكون الرئة من الشعب الهوائية والحويصلات الهوائية والخلالية. توجد الخلايا المناعية وغير المناعية داخل هذه المقصورات للمساهمة في كل من وظيفة الرئة المتجانسة (تبادل الغازات) ودفاع المضيف ضد الإهانات البيئية ، مثل العدوى الفيروسية. الممرات الهوائية الكبيرة والصغيرة ، أو الشعب الهوائية والقصيبات الهوائية ، مبطنة بالخلايا الظهارية. الخلايا الظهارية السائدة في هذه المناطق هي الخلايا الهدية والهدبية المسؤولة عن إفراز الجزيئات الواقية وتسهيل إزالة الغشاء المخاطيالهدبي 1. الحويصلات الهوائية هي أكثر الهياكل البعيدة في الرئة ، مبطنة بنوعين من الخلايا الظهارية ، الخلايا السنخية من النوع الأول (ATIs) والخلايا السنخية من النوع الثاني (ATIIs). ATI هي المسؤولة عن تبادل الغازات ، وتقوم ATIIs بإفراز المواد الخافضة للتوتر السطحي وإعادة تدويرها لضمان التوتر السطحيالمناسب 2،3. تتجدد ATIIs ذاتية التجديد ويمكن أن تتمايز أيضا إلى ATI ، وهو دور مهم بشكل خاص بعد تلف الرئة4. بالإضافة إلى ذلك ، توفر ATIIs مكانة داعمة لنوع الخلايا المناعية الرئيسي الذي يملأ مكانة السنخية ، البلاعم السنخية (AMs) 5،6. خارج الظهارة ، تشكل الخلايا الليفية والخلايا البطانية والضامة الخلالية (IMs) (التي يمكن أن تكون مرتبطة بالأعصاب والأوعية) النسيجالخلالي 7،8،9،10. استجابة للعدوى والإصابة ، تموت العديد من خلايا الرئة ، وتتسلل الخلايا المناعية ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة والعدلات ، إلى الأنسجة11،12. تتمايز الخلايا الوحيدة المتسللة للرئة إلى البلاعم ويمكن أن تساهم في حجرة البلاعم على المدىالطويل 13.

الطرق الحالية لتحضير معلقات أحادية الخلية من رئة الفأر تعتمد بشكل عام على الكولاجيناز وتتطلب تفككا جسديا للأنسجة14. يمكن أن يؤدي هذا إلى انخفاض أعداد الخلايا غير المناعية القابلة للحياة. تعتمد بعض البروتوكولات لعزل الخلايا الظهارية على التباين وتنتج نسبا أعلى من الخلايا الظهارية الحية. ومع ذلك ، فإن هذه البروتوكولات عموما لا تحقق في غلة الخلايا المناعية وقابليتهاللحياة 15،16،17. قياس التدفق الخلوي هو طريقة شائعة تستخدم للتمييز بين مجموعات الخلايا داخل الأنسجة المهضومة. في خط الأساس ، يتم تحديد بوابات قياس التدفق الخلوي ل AMs و IMs والخلايا الوحيدة والعدلات بوضوح. ومع ذلك ، أثناء الالتهاب ، تصبح عملية البوابات متغيرة ويصعب تفسيرها بسبب الاستمرارية في التعبير عن علامة السطح للخلايا الوحيدة المتسللة التي تتمايز إلى ضامة. لذلك ، يحدد البروتوكول المقدم هنا أيضا استراتيجيات البوابات لتحديد مجموعات الخلايا النخاعية ذات الأهمية بعد الإصابة.

يعد التفكك القوي للخلايا الظهارية والنخاعية في الرئة أمرا ضروريا لتمييز وظائفها الاستتبابية والالتهابية. ستمكن طريقة عزل هذه الحجرات الخلوية بالتوازي من إجراء تحليلات نهائية لأنواع الخلايا الرئيسية التي تحافظ على الصحة وتدفع المرض. يمكن العثور على نظرة عامة تخطيطية على سير عمل هذا البروتوكول في الشكل 1.

Protocol

يتوافق هذا البروتوكول مع إرشادات اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في كلية الطب بجامعة هارفارد (أرقام المنح: R35GM150816 و P30DK043351). تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J التي تتراوح أعمارها بين 8-12 أسبوعا للتجارب. هذا البروتوكول مناسب أيضا للفئران الذكور. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير المواد

  1. قم بإذابة الإنزيمات الضرورية على الجليد ، بما في ذلك التباين والليبراز والحمض النووي.
  2. تحضير الكواشف الضرورية الأخرى. املأ حقنة سعة 10 مل ب 5 مل من 2 ملي EDTA في DPBS وقم بتركيبها بإبرة 27 جرام. املأ المحقنة سعة 1 مل ب DPBS وقم بتوصيل القسطرة.

2. حصاد الرئتين

  1. القتل الرحيم للفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق بمقدار 400-500 ملغم/كغ و25-100 ملغم/كغ خليط الكيتامين/زيلازين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). تابع التشريح بمجرد أن لا يستجيب الماوس لقرصة وسادة القدم (~ 5 دقائق).
    ملاحظة: يتم استخدام خليط الكيتامين / الزيلازين للقتل الرحيم بدلا من ثاني أكسيد الكربون لمنع النزيف الناجم عن الاختناق وتسلل الخلايا المناعية التي يمكن أن تربك النتائج.
  2. رش الماوس بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بتشريح الماوس باستخدام مقص جراحي ناعم وملقط # 7. قم بعمل شق في البطن باستخدام المقص واقطعه بشكل جانبي عبر الصفاق.
    1. قم بعمل قطع صغير في الحجاب الحاجز لتحرير الفراغ. اقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري السفلي من تجويف الجسم لكشف الرئتين والقلب.
  3. قم بنشر الرئتين ب 5 مل من 2 ملي EDTA في DPBS في حقنة 10 مل مزودة بإبرة 27 جرام. يتم إجراء التروية عن طريق دخول قاعدة القلب بالإبرة ، وتوجيهها من اليمين إلى البطين الأيسر ، وتوزيع السائل ببطء من المحقنة18.
    ملاحظة: يجب إجراء التروية ببطء لمنع تمزق الأوعية الدموية.
  4. افتح القفص الصدري عند القص عن طريق قطع جوانب القفص الصدري ، ثم اقطع عموديا من خلال القص لكشف القصبةالهوائية 19. قم بقص أكبر قدر ممكن من العضلات والأنسجة الضامة باستخدام مقص دقيق و # 7 ملقط دون ثقب القصبة الهوائية أو الرئتين.
  5. لف القصبة الهوائية في خياطة (مقاس 2-0) كما لو كنت تربطها ولكن دون شد. القصبة الهوائية بشكل جانبي وإدخال القسطرة. قم بتثبيت الخيط بإحكام حول القسطرة عن طريق سحب الخيط بإحكام. لا تدخل القسطرة التي يزيد طولها عن 1 سم في الرئة.
  6. تضخيم الرئتين ب 1 مل من DPBS. اسحب DPBS للخارج عن طريق سحب المحقنة ببطء. أعد نفخ الرئتين بنفس DPBS واسحب المحقنة مرة أخرى لحصاد سائل غسل القصبات الهوائية (BALF).
  7. افصل المحقنة عن القسطرة ، واترك القسطرة مدخلة. استغن عن BALF في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
  8. املأ نفس المحقنة سعة 1 مل ب 1 مل من التباين وأعد توصيلها بالقسطرة. قم بتوزيع المحقنة لتضخيم الرئتين مع التباين. أثناء إزالة القسطرة، شد الخيط حول القصبة الهوائية لمنع تسرب التباين.
  9. قطع القصبة الهوائية بشكل جانبي. قم بإزالة الرئتين من تجويف الجسم عن طريق قطع النسيج الضام على طول الجزء الخلفي من القفص الصدري أثناء استخدام الملقط لسحب الرئتين والقصبة الهوائية لأعلى.
  10. إزالة القلب من الرئتين. ضع الرئتين في 5 مل من DPBS على الثلج.
  11. في هذه الخطوة ، خذ BALF المنفصل وقم بالتدوير لأسفل عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. يمكن اقتباس المادة الطافية وتخزينها حسب الحاجة. يجب أن يكون هناك حبيبات خلية مرئية يمكن إعادة تعليقها في 100 ميكرولتر من RPMI.
    ملاحظة: يمكن للمرء أن ينتظر ما يصل إلى ساعتين للمضي قدما في الهضم ، مما يسمح بحصاد عدة فئران في وقت واحد.

3. هضم الرئتين

  1. تحضير مزيج الهضم. أضف 83 ميكروغرام / مل ليبراز (محلول مخزون 50 ميكرولتر) ، و 100 ميكروغرام / مل DNAse (محلول مخزون 15 ميكرولتر) في 3 مل من RPMI لكل رئة.
  2. قم بتشريح الفصوص الخمسة للرئتين وتخلص من أي نسيج ضام19،20. يقطع الرئة بالمقص لمدة 1 دقيقة على شريحة زجاجية.
  3. انقل الرئة المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام مقص التشريح. أضف حبيبات الخلية المستردة من BALF والمعلقة في RPMI في أنبوب الطرد المركزي. أضف 3 مل من مزيج الهضم إلى الأنبوب الذي يحتوي على العينة باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل.
  4. خليط هضم الرئة Pipet لأعلى ولأسفل 2-3 مرات. ضعها عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري عند 140 دورة في الدقيقة مع وضع أنابيب الهضم بزاوية 45 درجة لمدة 40 دقيقة.

4. تحضير تعليق الخلية الواحدة

  1. قم بإزالة أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل من شاكر المداري وضعها على الجليد. خليط هضم الرئة الماصة لأعلى ولأسفل 5-6 مرات. قم بالتصفية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل. اغسل أي خلايا متبقية من خلال الفلتر وقم بتحييد الإنزيمات باستخدام 10 مل 5٪ FBS في RPMI.
  2. تدور لمدة 5 دقائق 4 درجات مئوية عند 600 × جم. شفط المادة الطافية باستخدام شفاط فراغ أو ماصة. أعد تعليقه في 1 مل من محلول تحلل ACK واحتضانه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحلل خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). أضف 9 مل من PBS والماصة لأعلى ولأسفل.
  3. تدور لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية عند 600 × جم. شفط المطاف باستخدام شفاط مفرغ أو ماصة. أعد التعليق في 1 مل من المخزن المؤقت FACS (1٪ FBS في PBS) وقم بالترشيح من خلال شبكة 64 ميكرومتر في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة p1000.

5. قياس التدفق الخلوي وتحليلات المصب

  1. في حالة إجراء قياس التدفق الخلوي أو فرز الخلايا المنشطة بالفلورة في صفيحة مكونة من 96 بئرا ، قم بتلطيخ ما يقرب من 1-2 مليون خلية لكل بئر ، أو جزء بنسبة 8٪ من تعليق الرئة.
  2. قم بتدوير الخلايا لأسفل. يجب إجراء جميع الدورات في صفيحة 96 بئرا لمدة 2.5 دقيقة (4 درجات مئوية) عند 600 × جم. قم بنقر المادة الطافية واغسل الخلايا مرة واحدة عن طريق التعليق في 200 ميكرولتر من DPBS. تدور لأسفل ونقر.
  3. إذا كان سيتم تلطيخ الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي ، فتابع إجراء التلوين التالي.
    1. أعد تعليق الخلايا في بقعة الزومبي الحية / الميتة (1: 150) وكتلة Fc (1: 250) في 25 ميكرولتر من DPBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    2. قم بإعداد مزيج تلطيخ الأجسام المضادة بتركيز 2x في المخزن المؤقت FACS.
      ملاحظة: يجب أن يشتمل مزيج التلوين على جميع العلامات الموجودة في لوحة النخاع (الجدول 1) أو اللوحة الظهارية (الجدول 2) بتركيزاتها المشار إليها.
    3. أضف 25 ميكرولتر من مزيج التلوين إلى 25 ميكرولتر من تعليق الرئة في طبق واحتضنه على الثلج لمدة 30 دقيقة في الظلام. يجب أن يكون إجمالي حجم التلوين الآن 50 ميكرولتر ، ويجب أن تكون الأجسام المضادة الأولية في تركيزها النهائي 1x للتلطيخ.
    4. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، ثم قم بالتدوير لأسفل لمدة 2.5 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 600 × جم ، ثم قم بإخراج المادة الطافية. اغسل مرتين في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
    5. إذا كان التلوين داخل الخلايا مطلوبا ، فقم بإصلاح الخلايا باستخدام مجموعة أدوات التثبيت داخل الخلايا. إذا لم يكن التلوين داخل الخلايا مطلوبا ، فقد يتم تثبيت الخلايا لمدة 20 دقيقة في 4٪ PFA في DPBS.
    6. اغسل المثبت ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ثلاث مرات. يمكن تخزين العينات معلقة في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 2-3 أيام. قبل تشغيل العينات ، يمكن إضافة حبات العد لتحديد عدد الخلايا.
  4. إذا كان سيتم فرز الخلايا ، فتابع إجراء التلوين التالي.
    1. أعد تعليق الخلايا في مزيج الأجسام المضادة للتلطيخ 1x مع كتلة Fc (1: 250). احتضن لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
    2. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، ثم قم بالتدوير لأسفل لمدة 2.5 دقيقة عند 4 درجات مئوية عند 600 × جم ، ثم قم بإخراج المادة الطافية. اغسل ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وأعد تعليقه في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS قبل الفرز.
      ملاحظة: يوصى بإضافة صبغة قابلة للحياة ، مثل DAPI ، إلى الخلايا قبل الفرز.

النتائج

سيؤدي الهضم الناجح إلى ما يقرب من 20-25 مليون خلية مع قابلية للحياة بنسبة 90٪ -95٪. إذا تمت إضافة ما يقرب من 25,000 حبة عد إلى جزء 8٪ من الرئة ، فيجب أن تضر الخرزات بنسبة 1٪ -3٪ من الأحداث التي تم جمعها. بعد البوابات على الفردي ، يجب أن يكون ما يقرب من 90٪ -95٪ من الخلايا سلبية الزومبي ال?...

Discussion

يحدد هذا البروتوكول هضم رئة الفأر الذي يعزل ما يقرب من 20-25 مليون خلية لكل فأر مع قابلية للحياة بنسبة 90٪ -95٪. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح بجمع BALF لمزيد من التحليل. يتوافق تعليق الخلية الناتج مع تقنيات معملية متعددة ، بما في ذلك قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة ل?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (R35GM150816 و P30DK043351) ، ومؤسسة تشارلز إتش هود ، ومعهد هارفارد للخلايا الجذعية. نشكر ألكسندر مان وجميع الأعضاء الآخرين في مختبر فرانكلين على مساعدتهم ومشورتهم في تصميم وتحسين مخططات وتحليلات بوابات قياس التدفق الخلوي. نشكر أيضا نواة قياس التدفق الخلوي في كلية الطب بجامعة هارفارد. تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باستخدام FlowJo. تم إنشاء مخططات الشكل باستخدام BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe with Slip TipVWRBD309659
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)Fisher Scientific12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok TipVWR75846-756
123 count eBeads Counting BeadsThermo Scientific01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)USA Scientific 7112-3300
16% paraformaldehydeVWR100503-917
23 G needle with regular bevelVWR305194
27 G needle with regular bevelVWRBD305109
5 mL pipettes (disposable)Thermo Fisher Scientific170373
50 mL centrifuge tubesOlympus 28-108
96-well round bottom plateCorning3797
ACK lysing bufferGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11cBioLegend117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)BioLegend123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV CathetersVWR381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11bBioLegend101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45BioLegend103147
C57BL/6J mice Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PELife Technologies12170280
Cell strainersCorning352350
CentrifugeEppenodorfCentrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)Millipore SigmaDN25-100MGReconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
DispaseVWR76176-668Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)Fine Science Tools11297-00
Dissection scissorsFine Science Tools14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
eBioscience fixation kitLife Technologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
EthanolVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 AntibodyBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
Glass slidesFisher Scientific12-552-3
graduated reservoirUSA Scientific 1930-2235
Ice bucketCorning432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)DechraKetamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
LiberaseMillipore Sigma5401119001Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well platesFisher Scientific07-201-731
Orbital Incubator ShakerBarnstead Lab-LineSHKE4000
p1000 pipetteEppenodorf3123000063
p1000 tipsUSA Scientific 1122-1830
p200 pipetteEppenodorf3123000055
p200 tipsUSA Scientific 1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 AntibodyBioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32 BioLegend101302Referred to as "Fc block" in text
Spray bottleVWR23609-182
Suture (Size 2-0)VWR100190-026
UnderpadsVWR56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)PivetalSee ketamine hydrocholoride notes above. 
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102

References

  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -. D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745 (2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964 (2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773 (2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920 (1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761 (2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101 (2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544 (2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988 (2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676 (2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632 (2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652 (2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved