АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе подробно описывается выделение живых иммунных и неиммунных популяций из легких мышей в стабильном состоянии и после гриппозной инфекции. Он также предоставляет стратегии гейтинга для идентификации субпопуляций эпителиальных и миелоидных клеток.

Аннотация

Легкие постоянно подвергаются воздействию патогенов и других вредных раздражителей окружающей среды, что делает его уязвимым к повреждениям, дисфункции и развитию заболеваний. Исследования с использованием мышиных моделей респираторных инфекций, аллергии, фиброза и рака сыграли решающую роль в выявлении механизмов прогрессирования заболевания и определении терапевтических мишеней. Тем не менее, большинство исследований, сосредоточенных на легких мышей, отдают приоритет выделению либо иммунных клеток, либо эпителиальных клеток, а не обеих популяций одновременно. В данной работе мы описываем метод получения комплексной суспензии одиночных клеток как иммунных, так и неиммунных популяций, пригодных для проточной цитометрии и сортировки клеток, активируемых флуоресценцией. Эти популяции включают эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты и различные субпопуляции миелоидных клеток. Этот протокол влечет за собой бронхоальвеолярный лаваж и последующее раздувание легких с диспаузой. Затем легкие перевариваются в смеси либеразы. Этот метод обработки высвобождает множество различных типов клеток и приводит к получению суспензии одиночных клеток, которая не требует ручной диссоциации против фильтра, способствуя выживанию клеток и получая большое количество живых клеток для последующего анализа. В этом протоколе мы также определяем схемы стробирования для субпопуляций эпителиальных и миелоидных клеток как в наивных, так и в инфицированных гриппом легких. Одновременная изоляция живых иммунных и неиммунных клеток является ключом к исследованию межклеточных перекрестных помех и более глубокому пониманию биологии легких в здоровье и болезнях.

Введение

Легкое состоит из дыхательных путей, альвеол и интерстиция. Иммунные и неиммунные клетки находятся в этих компартментах, способствуя как гомеостатической функции легких (газообмену), так и защите организма от вредных факторов окружающей среды, таких как вирусная инфекция. Большие и малые дыхательные пути, или бронхи и бронхиолы, выстланы эпителиальными клетками. Преобладающими эпителиальными клетками в этих областях являются булавы и реснитчатые клетки, которые отвечают за секрецию защитных молекул и облегчение мукоцилиарного клиренса1. Альвеолы являются наиболее дистальными структурами в легких, выстланными двумя типами эпителиальных клеток: альвеолярными клетками I типа (ATI) и альвеолярными клетками II типа (ATII). ATI отвечают за газообмен, а ATII выделяют и перерабатывают поверхностно-активные вещества для обеспечения соответствующего поверхностного натяжения 2,3. ATII являются самообновляющимися и могут также дифференцироваться в ATI, что особенно актуально после повреждения легких4. Кроме того, ATII обеспечивают поддерживающую нишу для основного типа иммунных клеток, населяющих альвеолярную нишу, альвеолярных макрофагов (АМ)5,6. Помимо эпителия, фибробласты, эндотелиальные клетки и интерстициальные макрофаги (ИМ) (которые могут быть связаны как с нервами, так и с сосудами) составляют интерстиций 7,8,9,10. В ответ на инфекцию и повреждение многочисленные клетки легких погибают, а иммунные клетки, включая моноциты и нейтрофилы, проникают в ткань11,12. Моноциты, инфильтрирующие легкие, дифференцируются в макрофаги и могут вносить свой вклад в компартмент макрофагов в долгосрочной перспективе13.

Современные методы получения суспензий одиночных клеток из легкого мыши, как правило, основаны на коллагеназе и требуют физической диссоциации ткани14. Это может привести к низкому количеству жизнеспособных неиммунных клеточных популяций. Некоторые протоколы выделения эпителиальных клеток основаны на диспазе и позволяют получить более высокие доли живых эпителиальных клеток; Тем не менее, эти протоколы, как правило, не исследуют выход и жизнеспособность иммунных клеток 15,16,17. Проточная цитометрия является распространенным методом, используемым для различения клеточных популяций в переваренной ткани. На исходном уровне проточное цитометрическое стробирование для АМ, ИМ, моноцитов и нейтрофилов четко очерчено. Однако во время воспаления процесс гейтирования становится изменчивым и сложным для интерпретации из-за континуума экспрессии поверхностных маркеров инфильтрирующих моноцитов, дифференцирующихся в макрофаги. Таким образом, представленный здесь протокол также описывает стратегии гейтирования для идентификации популяций миелоидных клеток, представляющих интерес после инфицирования.

Надежная диссоциация эпителиальных и миелоидных клеток легких имеет важное значение для определения их гомеостатических и воспалительных функций. Метод параллельной изоляции этих клеточных компартментов позволит проводить последующий анализ ключевых типов клеток, которые поддерживают здоровье и вызывают заболевания. Схематический обзор рабочего процесса этого протокола можно найти на рисунке 1.

протокол

Этот протокол соответствует рекомендациям Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию в Гарвардской медицинской школе (номера грантов: R35GM150816 и P30DK043351). Для экспериментов использовали самок мышей C57BL/6J в возрасте 8-12 недель. Этот протокол подходит и для самцов мышей. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Подготовка материалов

  1. Разморозьте на льду необходимые ферменты, в том числе диспазу, либеразу и ДНК.
  2. Подготовьте другие необходимые реактивы. Наполните шприц объемом 10 мл 5 мл 2 мМ ЭДТА в DPBS и установите на него иглу 27 G. Наполните шприц объемом 1 мл DPBS и прикрепите катетер.

2. Забор легких

  1. Усыпите мышь путем внутрибрюшинного введения 400-500 мг/кг и 25-100 мг/кг смеси кетамина/ксилазина (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Приступайте к вскрытию, когда мышь перестает реагировать на защемление подушечки ноги (~5 минут).
    Примечание: Смесь кетамина и ксилазина используется для эвтаназии вместо углекислого газа, чтобы предотвратить вызванное удушьем кровотечение и инфильтрацию иммунных клеток, которая может исказить результаты.
  2. Опрыскайте мышь 70% этанолом. Препарируйте мышь с помощью тонких хирургических ножниц и щипцов #7. Сделайте надрез в области живота с помощью ножниц и разрежьте сбоку через брюшину.
    1. Сделайте небольшой надрез в диафрагме, чтобы выпустить вакуум. Вырежьте диафрагму и нижнюю грудную клетку из полости тела, чтобы обнажить легкие и сердце.
  3. Перфузируют легкие 5 мл 2 мМ ЭДТА в DPBS в шприц объемом 10 мл с иглой 27 G. Перфузия выполняется путем введения иглой в основание сердца, направленной справа в левый желудочек, и медленного дозирования жидкости из шприца18.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия должна выполняться медленно, чтобы предотвратить разрыв сосудистой системы.
  4. Вскройте грудную клетку на грудине, отрезав боковые стороны грудной клетки, затем разрежьте вертикально через грудину, чтобы обнажить трахею19. Отрежьте как можно больше мышц и соединительной ткани с помощью тонких ножниц и щипцов #7, не прокалывая трахею или легкие.
  5. Оберните трахею швом (размер 2-0) как бы перевязывайте ее, но не затягивая. Процедите трахею латерально и вставьте катетер. Плотно закрепите шов вокруг катетера, плотно натянув шовный материал. Не вводите катетер более чем на 1 см в легкое.
  6. Накачайте легкие 1 мл DPBS. Извлеките DPBS, медленно потянув за шприц. Повторно накачайте легкие тем же DPBS и еще раз оттяните шприц для сбора бронхоальвеолярного лаважа жидкости (BALF).
  7. Отсоедините шприц от катетера, оставив катетер вставленным. Выдавите BALF в микроцентрифужную пробирку.
  8. Наполните тот же шприц объемом 1 мл 1 мл жидкостью и снова приложите его к катетеру. Дозируйте шприц для надувания легких с диспажем. Во время удаления катетера затяните шов вокруг трахеи, чтобы предотвратить вытекание отхождения.
  9. Разрежьте трахею сбоку. Удалите легкие из полости тела, разрезав соединительную ткань вдоль задней части грудной клетки, при этом с помощью щипцов вытяните легкие и трахею вверх.
  10. Удалите сердце из легких. Поместите легкие в 5 мл DPBS на лед.
  11. На этом этапе возьмите отделенный BALF и отжимайте при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Надосадочная жидкость может быть аликвотирована и сохранена по мере необходимости. Должна быть видимая клеточная гранула, которую можно ресуспендировать в 100 мкл RPMI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно подождать до 2 часов, чтобы приступить к пищеварению, что позволяет собирать несколько мышей одновременно.

3. Переваривание легких

  1. Приготовьте смесь для дайджеста. Добавьте 83 мкг/мл либеразы (50 мкл стокового раствора) и 100 мкг/мл ДНКазы (15 мкл стокового раствора) в 3 мл RPMI на легкое.
  2. Рассеките пять долей легких и отбросьте всю соединительную ткань19,20. Разрубите легкое ножницами в течение 1 минуты на предметном стекле.
  3. Переложите измельченное легкое в центрифужную пробирку объемом 50 мл с помощью ножниц для препарирования. Добавьте гранулу ячейки, извлеченную из BALF и ресуспендированную в RPMI, в центрифужную трубку. Добавьте 3 мл смеси для дигеста в пробирку с образцом с помощью серологической пипетки объемом 5 мл.
  4. Пипеткой переваривайте легкую смесь вверх и вниз 2-3 раза. Поместите при температуре 37 °C в орбитальный шейкер со скоростью 140 об/мин с метантеночными трубками, расположенными под углом 45 градусов, на 40 минут.

4. Приготовление одноклеточной суспензии

  1. Извлеките пробирки центрифуги объемом 50 мл из орбитального шейкера и положите их на лед. Пипеткой переваривайте легкую смесь вверх и вниз 5-6 раз. Отфильтруйте через сетчатый фильтр 70 μм в новую пробирку объемом 50 мл. Промойте все оставшиеся клетки через фильтр и нейтрализуйте ферменты 10 мл 5% FBS в RPMI.
  2. Отжим 5 мин при 4 °C при 600 x g. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора или пипетки. Ресуспендировать в 1 мл буфера для лизиса ACK и инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре для лизиса эритроцитов (эритроцитов). Добавьте 9 мл PBS и проводите пипеткой вверх и вниз.
  3. Отжим в течение 5 минут при 4 °C при 600 x g. Аспират надосадочная жидкость с помощью вакуумного аспиратора или пипетки. Ресуспендируйте в 1 мл буфера FACS (1% FBS в PBS) и отфильтруйте через меш 64 мкм в микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки p1000.

5. Проточная цитометрия и последующие анализы

  1. При выполнении проточной цитометрии или флуоресцентно-активируемой сортировки клеток в 96-луночном планшете окрашивайте примерно 1-2 миллиона клеток на лунку, или 8% фракцию легочной суспензии.
  2. Вращаем ячейки вниз. Все вращения в 96-луночном планшете должны выполняться в течение 2,5 мин (4 °C) при 600 x g. Стряхните надосадочную жидкость и промойте ячейки один раз, повторно суспендируя 200 мкл DPBS. Вращайте вниз и проведите пальцем.
  3. Если клетки необходимо окрашивать для анализа проточной цитометрии, следует выполнить следующую процедуру окрашивания.
    1. Ресуспендировать клетки в живых/мертвых Zombie stain (1:150) и блоке Fc (1:250) в 25 мкл DPBS на 10 мин при комнатной температуре в темноте.
    2. Приготовьте смесь для окрашивания антител в 2-кратной концентрации в буфере FACS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивающая смесь должна включать в себя все маркеры миелоидной панели (Таблица 1) или эпителиальной панели (Таблица 2) в их указанных концентрациях.
    3. Добавьте 25 μл красящей смеси к 25 μл легочной суспензии в тарелке и выдерживайте на льду в течение 30 минут в темноте. Общий объем окрашивания теперь должен составлять 50 мкл, а концентрация первичных антител должна составлять 1x красящую.
    4. Добавьте 150 μL буфера FACS, уменьшите в течение 2,5 минут при 4 °C при 600 x g и стряхните надосадочную жидкость. Дважды промойте в 200 мкл буфера FACS.
    5. Если требуется внутриклеточное окрашивание, зафиксируйте клетки с помощью набора для внутриклеточной фиксации. Если внутриклеточное окрашивание не требуется, клетки могут быть зафиксированы в течение 20 мин в 4% PFA в DPBS.
    6. Смойте фиксатор 200 мкл буфера FACS три раза. Образцы могут храниться в ресуспендированном виде в 200 мкл буфера FACS при температуре 4 °C в темноте в течение 2-3 дней. Перед запуском образцов можно добавить счетные бусины для количественной оценки номеров ячеек.
  4. Если клетки необходимо отсортировать, проведите следующую процедуру окрашивания.
    1. Ресуспендируйте клетки в 1x окрашивающей смеси антител с Fc-блоком (1:250). Выдерживать 30 минут на льду в темноте.
    2. Добавьте 150 μL буфера FACS, уменьшите в течение 2,5 минут при 4 °C при 600 x g и стряхните надосадочную жидкость. Перед сортировкой трижды промойте 200 мкл буфера FACS и повторно суспендируйте в 200 мкл буфера FACS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сортировкой рекомендуется добавлять в клетки краситель жизнеспособности, такой как DAPI.

Результаты

В результате успешного переваривания получается примерно 20-25 миллионов клеток с жизнеспособностью 90-95%. Если примерно 25 000 счетных бусин добавляются к 8% легкого, бусины должны поставить под угрозу 1-3% собранных событий. После гейтирования на синглетах примерно 90%-95% кле...

Обсуждение

Этот протокол описывает процесс переваривания легких мыши, который выделяет примерно 20-25 миллионов клеток на мышь с жизнеспособностью 90-95%. Кроме того, он позволяет собирать BALF для дальнейшего анализа. Полученная клеточная суспензия совместима с различными лаборатор...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (R35GM150816 и P30DK043351), Фонда Чарльза Х. Худа и Гарвардского института стволовых клеток. Мы благодарим Александра Манна и всех других сотрудников лаборатории Франклина за их помощь и советы в разработке и совершенствовании схем и анализов проточной цитометрии. Мы также благодарим Ядро проточной цитометрии иммунологии в Гарвардской медицинской школе. Анализ проточной цитометрии проводили с помощью FlowJo. Схемы фигур были созданы с помощью BioRender.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe with Slip TipVWRBD309659
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)Fisher Scientific12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok TipVWR75846-756
123 count eBeads Counting BeadsThermo Scientific01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)USA Scientific 7112-3300
16% paraformaldehydeVWR100503-917
23 G needle with regular bevelVWR305194
27 G needle with regular bevelVWRBD305109
5 mL pipettes (disposable)Thermo Fisher Scientific170373
50 mL centrifuge tubesOlympus 28-108
96-well round bottom plateCorning3797
ACK lysing bufferGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11cBioLegend117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)BioLegend123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV CathetersVWR381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11bBioLegend101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45BioLegend103147
C57BL/6J mice Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PELife Technologies12170280
Cell strainersCorning352350
CentrifugeEppenodorfCentrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)Millipore SigmaDN25-100MGReconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
DispaseVWR76176-668Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)Fine Science Tools11297-00
Dissection scissorsFine Science Tools14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
eBioscience fixation kitLife Technologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
EthanolVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 AntibodyBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
Glass slidesFisher Scientific12-552-3
graduated reservoirUSA Scientific 1930-2235
Ice bucketCorning432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)DechraKetamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
LiberaseMillipore Sigma5401119001Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well platesFisher Scientific07-201-731
Orbital Incubator ShakerBarnstead Lab-LineSHKE4000
p1000 pipetteEppenodorf3123000063
p1000 tipsUSA Scientific 1122-1830
p200 pipetteEppenodorf3123000055
p200 tipsUSA Scientific 1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 AntibodyBioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32 BioLegend101302Referred to as "Fc block" in text
Spray bottleVWR23609-182
Suture (Size 2-0)VWR100190-026
UnderpadsVWR56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)PivetalSee ketamine hydrocholoride notes above. 
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102

Ссылки

  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -. D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745 (2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964 (2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773 (2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920 (1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761 (2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101 (2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544 (2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988 (2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676 (2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632 (2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652 (2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены