Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מפרט את הבידוד של אוכלוסיות חיסוניות ולא מחוסנות מריאות העכבר במצב יציב ובעקבות זיהום בשפעת. הוא גם מספק אסטרטגיות שער לזיהוי תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים.

Abstract

הריאה חשופה באופן רציף לפתוגנים ולגירויים סביבתיים מזיקים אחרים, מה שהופך אותה לפגיעה לנזק, תפקוד לקוי והתפתחות מחלות. מחקרים המשתמשים במודלים של עכברים של זיהום בדרכי הנשימה, אלרגיה, פיברוזיס וסרטן היו קריטיים לחשיפת מנגנוני התקדמות המחלה וזיהוי מטרות טיפוליות. עם זאת, רוב המחקרים המתמקדים בריאות העכבר נותנים עדיפות לבידוד של תאי חיסון או תאי אפיתל, ולא שתי האוכלוסיות בו זמנית. כאן, אנו מתארים שיטה להכנת תרחיף מקיף של תא בודד של אוכלוסיות חיסוניות ולא חיסוניות כאחד המתאים לזרימה ציטומטרית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטי. אוכלוסיות אלו כוללות תאי אפיתל, תאי אנדותל, פיברובלסטים ומגוון תת-קבוצות של תאים מיאלואידים. פרוטוקול זה כרוך בשטיפת סימפונות וניפוח הריאות לאחר מכן עם דיספאז. לאחר מכן הריאות מתעכלות בתערובת ליבראז. שיטת עיבוד זו משחררת מגוון סוגי תאים מגוונים ומביאה לתרחיף תא בודד שאינו דורש דיסוציאציה ידנית כנגד מסנן, מקדם את הישרדות התאים ומניב מספר גבוה של תאים חיים לניתוחים במורד הזרם. בפרוטוקול זה, אנו מגדירים גם תוכניות שער עבור תת-קבוצות של תאים אפיתל ומיאלואידים הן בריאות נאיביות והן בריאות נגועות בשפעת. בידוד סימולטני של תאים חיסוניים ולא חיסוניים חיים הוא המפתח לחקירת דיבור בין-תאי והשגת הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה של הריאות בבריאות ובמחלות.

Introduction

הריאה מורכבת מדרכי הנשימה, הנאדיות והאינטרסטיציום. תאים חיסוניים ולא חיסוניים שוכנים בתוך תאים אלה כדי לתרום הן לתפקוד הריאות ההומאוסטטי (חילופי גזים) והן להגנה על המארח מפני עלבונות סביבתיים, כגון זיהום ויראלי. דרכי הנשימה הגדולות והקטנות, או הסמפונות והסימפונות, מרופדות בתאי אפיתל. תאי האפיתל השולטים באזורים אלה הם תאים מועדונים וריסים האחראים על הפרשת מולקולות הגנה והקלה על פינוי רירית1. הנאדיות הן המבנים הדיסטליים ביותר בריאה, מרופדות על ידי שני סוגי תאי אפיתל, תאים מכתשית מסוג I (ATIs) ותאי מכתשית מסוג II (ATIIs). ATIs אחראים על חילופי גזים, ו-ATIIs מפרישים וממחזרים חומרים פעילי שטח כדי להבטיח מתח פנים מתאים 2,3. ATIIs מתחדשים מעצמם ויכולים גם להתבדל ל-ATIs, תפקיד רלוונטי במיוחד לאחר נזק לריאות4. בנוסף, ATIIs מספקים נישה תומכת לסוג התאים החיסוניים העיקריים המאכלס את הנישה המכתשית, מקרופאגים מכתשית (AMs)5,6. מעבר לאפיתל, פיברובלסטים, תאי אנדותל ומקרופאגים אינטרסטיציאליים (IMs) (שיכולים להיות קשורים הן לעצבים והן לכלי דם) מהווים את האינטרסטיציום 7,8,9,10. בתגובה לזיהום ופציעה, תאי ריאה רבים מתים, ותאי חיסון, כולל מונוציטים ונויטרופילים, חודרים לרקמה11,12. מונוציטים חודרים לריאות מתמיינים למקרופאגים ויכולים לתרום לתא המקרופאגים לטווח ארוך13.

השיטות הנוכחיות להכנת תרחיפים חד-תאיים מריאת העכבר מבוססות בדרך כלל על קולגנאז ודורשות דיסוציאציה פיזית של רקמה14. זה יכול לגרום למספר נמוך של אוכלוסיות תאים לא חיסוניות. חלק מהפרוטוקולים לבידוד תאי אפיתל מבוססים על דיספאז ומניבים פרופורציות גבוהות יותר של תאי אפיתל חיים; עם זאת, פרוטוקולים אלה בדרך כלל אינם חוקרים את תפוקת תאי החיסון ואת כדאיות 15,16,17. ציטומטריית זרימה היא שיטה נפוצה המשמשת להבחנה בין אוכלוסיות תאים בתוך רקמה מעוכלת. בנקודת ההתחלה, שער זרימה ציטומטרית עבור AMs, IMs, מונוציטים ונויטרופילים מוגדר בבירור. עם זאת, במהלך דלקת, תהליך השער הופך למשתנה ומאתגר לפירוש בשל הרצף בביטוי סמני פני השטח של מונוציטים חודרים המתמיינים למקרופאגים. לכן, הפרוטוקול המוצג כאן מתאר גם אסטרטגיות שער לזיהוי אוכלוסיות תאים מיאלואידים מעניינות לאחר הדבקה.

דיסוציאציה חזקה של תאי אפיתל ומיאלואידים של הריאות חיונית כדי להבחין בתפקודיהם ההומאוסטטיים והדלקתיים. שיטה לבודד את תאי התאים הללו במקביל תאפשר ניתוחים במורד הזרם של סוגי תאים מרכזיים שגם שומרים על הבריאות וגם מניעים מחלות. סקירה סכמטית של זרימת העבודה של פרוטוקול זה ניתן למצוא באיור 1.

Protocol

פרוטוקול זה תואם את ההנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית הספר לרפואה של הרווארד (מספרי מענקים: R35GM150816 ו-P30DK043351). נקבות עכברי C57BL/6J בגילאי 8-12 שבועות שימשו לניסויים. פרוטוקול זה מתאים גם לעכברים זכרים. פרטי הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. הכנת חומרים

  1. להפשיר אנזימים נחוצים על קרח, כולל דיספאז, ליבראז ו-DNAse.
  2. הכן ריאגנטים נחוצים אחרים. מלאו מזרק של 10 מ"ל ב-5 מ"ל של 2 מ"מ EDTA ב-DPBS והתאימו אותו עם מחט של 27 גרם. מלאו את המזרק של 1 מ"ל ב-DPBS והצמידו את הקטטר.

2. קצירת הריאות

  1. המתת חסד של העכבר על ידי הזרקה תוך-צפקית של 400-500 מ"ג/ק"ג ו-25-100 מ"ג/ק"ג תערובת קטמין/קסילזין (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד). המשך בדיסקציה לאחר שהעכבר אינו מגיב לצביטה של כרית כף הרגל (~5 דקות).
    הערה: תערובת קטמין/קסילזין משמשת להמתת חסד במקום פחמן דו חמצני כדי למנוע דימום הנגרם מחנק וחדירת תאי חיסון שעלולים לבלבל את התוצאות.
  2. רססו את העכבר ב-70% אתנול. נתח את העכבר באמצעות מספריים כירורגיים עדינים ומלקחיים #7. בצע חתך בבטן בעזרת מספריים וחתך לרוחב דרך הצפק.
    1. בצע חתך קטן בסרעפת כדי לשחרר את הוואקום. חתכו את הסרעפת ואת כלוב הצלעות התחתון מחלל הגוף כדי לחשוף את הריאות והלב.
  3. לחלחל את הריאות עם 5 מ"ל של 2 מ"מ EDTA ב-DPBS במזרק 10 מ"ל המצויד במחט 27 גרם. הזלוף מתבצע על ידי כניסה לבסיס הלב עם המחט, מכוונת מימין לחדר השמאלי, והוצאת נוזלים לאט מהמזרק18.
    הערה: יש לבצע זלוף לאט כדי למנוע קרע בכלי הדם.
  4. פתח את כלוב הצלעות בעצם החזה על ידי חיתוך דפנות כלוב הצלעות, ולאחר מכן חתוך אנכית דרך עצם החזה כדי לחשוף את קנה הנשימה19. חתוך כמה שיותר שרירים ורקמות חיבור באמצעות מספריים עדינים ומלקחיים #7 מבלי לנקב את קנה הנשימה או הריאות.
  5. עטפו את קנה הנשימה בתפר (מידה 2-0) כאילו כדי לקשור אותו אך מבלי להדק. ניק קנה נשימה לרוחב והכנס את הקטטר. אבטח את התפר בחוזקה סביב הקטטר על ידי משיכת התפר בחוזקה. אין להכניס את הקטטר יותר מ-1 ס"מ לתוך הריאה.
  6. נפח ריאות עם 1 מ"ל DPBS. משוך החוצה את ה-DPBS על ידי משיכה איטית של המזרק. נפח מחדש את הריאות עם אותו DPBS ומשוך שוב את המזרק לאחור כדי לקצור נוזל שטיפת סימפונות (BALF).
  7. נתק את המזרק מהקטטר והשאיר את הקטטר מוכנס. יש להוציא את BALF לתוך שפופרת מיקרו-צנטריפוגה.
  8. מלאו את אותו מזרק של 1 מ"ל ב-1 מ"ל של דיספאז וחברו מחדש לקטטר. יש להוציא מזרק כדי לנפח את הריאות עם דיספאז. בזמן הסרת הקטטר, הדק את התפר סביב קנה הנשימה כדי למנוע דליפה של דיספאז.
  9. חותכים את קנה הנשימה לרוחב. הסר את הריאות מחלל הגוף על ידי חיתוך רקמת החיבור לאורך החלק האחורי של כלוב הצלעות תוך שימוש במלקחיים כדי למשוך את הריאות וקנה הנשימה כלפי מעלה.
  10. הסר את הלב מהריאות. הניחו את הריאות ב-5 מ"ל DPBS על קרח.
  11. בשלב זה, קח את ה-BALF המופרד וסובב כלפי מטה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. ניתן לצרף את הסופרנטנט ולאחסן אותו לפי הצורך. צריכה להיות גלולת תא גלויה שניתן להשעות מחדש ב-100 מיקרוליטר של RPMI.
    הערה: ניתן להמתין עד שעתיים כדי להמשיך בעיכול, מה שמאפשר לקצור מספר עכברים בכל פעם.

3. עיכול הריאות

  1. מכינים את תערובת העיכול. הוסף 83 μg/mL liberase (תמיסת מלאי של 50 μL), ו-100 μg/mL DNAse (תמיסת מלאי של 15 μL) ב-3 מ"ל של RPMI לכל ריאה.
  2. לנתח את חמש האונות של הריאות ולהשליך כל רקמת חיבור19,20. קוצצים את הריאה במספריים למשך דקה על מגלשת זכוכית.
  3. מעבירים את הריאה הקצוצה לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בעזרת מספריים לדיסקציה. הוסף כדור תא שהוחזר מ-BALF והושעה מחדש ב-RPMI לתוך צינור הצנטריפוגה. הוסף 3 מ"ל של תערובת עיכול לצינור המכיל את הדגימה באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל.
  4. תערובת עיכול ריאות פיפט למעלה ולמטה 2-3 פעמים. מניחים ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר אורביטלי ב-140 סל"ד עם צינורות עיכול הממוקמים בזווית של 45 מעלות למשך 40 דקות.

4. הכנת המתלה החד-תאי

  1. הסר את צינורות הצנטריפוגה בנפח 50 מ"ל משייקר המסלול והנח אותם על קרח. תערובת עיכול ריאות פיפטה למעלה ולמטה 5-6 פעמים. מסננים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל. שטפו את כל התאים שנותרו דרך המסנן ונטרלו אנזימים עם 10 מ"ל 5% FBS ב-RPMI.
  2. סובב במשך 5 דקות 4 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 600 x גרם. שאפו את הסופרנטנט באמצעות שואב ואקום או פיפטה. השעו מחדש ב-1 מ"ל של מאגר ליזה ACK ודגרו למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליז כדוריות דם אדומות (RBCs). הוסף 9 מ"ל PBS ופיפטה למעלה ולמטה.
  3. יש לסובב במשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של 600 x גרם. שאפו סופרנטנט באמצעות שואב ואקום או פיפטה. השעו מחדש ב-1 מ"ל של חוצץ FACS (1% FBS ב-PBS) וסננו דרך רשת של 64 מיקרומטר לתוך שפופרת מיקרו-צנטריפוגה באמצעות פיפטה p1000.

5. ציטומטריית זרימה וניתוחים במורד הזרם

  1. אם מבצעים ציטומטריית זרימה או מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי בצלחת של 96 בארות, יש לצבוע כ-1-2 מיליון תאים לבאר, או חלק של 8% מתרחיף הריאות.
  2. סובב את התאים כלפי מטה. יש לבצע את כל הסיבובים בצלחת של 96 בארות למשך 2.5 דקות (4 מעלות צלזיוס) בטמפרטורה של 600 x גרם. הסר את הסופרנטנט ושטוף את התאים פעם אחת על ידי השעיה מחדש של 200 מיקרוליטר של DPBS. סובב למטה והחליק.
  3. אם יש לצבוע תאים לניתוח ציטומטריית זרימה, המשך בהליך הצביעה הבא.
    1. השעו מחדש תאים בכתם זומבי חי/מת (1:150) ובלוק Fc (1:250) ב-25 מיקרוליטר של DPBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
    2. הכן את תערובת צביעת הנוגדנים בריכוז פי 2 במאגר ה-FACS.
      הערה: תערובת מכתים צריכה לכלול את כל הסמנים בלוח המיאלואיד (טבלה 1) או בלוח האפיתל (טבלה 2) בריכוזים המצוינים שלהם.
    3. הוסף 25 מיקרוליטר של תערובת מכתים ל-25 מיקרוליטר של תרחיף ריאות בצלחת ודגירה על קרח למשך 30 דקות בחושך. נפח הצביעה הכולל צריך להיות כעת 50 מיקרוליטר, והנוגדנים הראשוניים צריכים להיות בריכוז הצביעה הסופי שלהם פי 1.
    4. הוסף 150 מיקרוליטר של חוצץ FACS, סובב כלפי מטה למשך 2.5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-600 x גרם, והחלק את ה-supernatant. שטפו פעמיים ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS.
    5. אם נדרש צביעה תוך תאית, תקן את התאים בעזרת ערכת קיבוע תוך תאית. אם אין צורך בצביעה תוך-תאית, ניתן לתקן תאים למשך 20 דקות ב-4% PFA ב-DPBS.
    6. שטפו את הקיבוע עם 200 מיקרוליטר של מאגר FACS שלוש פעמים. ניתן לאחסן דגימות בתלייה ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS ב-4 מעלות צלזיוס בחושך למשך 2-3 ימים. לפני הפעלת דגימות, ניתן להוסיף חרוזי ספירת כדי לכמת את מספרי התאים.
  4. אם יש למיין תאים, המשך בהליך הצביעה הבא.
    1. השעו מחדש תאים בתערובת נוגדנים מכתים 1x עם בלוק Fc (1:250). דגירה למשך 30 דקות על קרח בחושך.
    2. הוסף 150 מיקרוליטר של חוצץ FACS, סובב כלפי מטה למשך 2.5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ב-600 x גרם, והחלק את ה-supernatant. שטפו שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של מאגר FACS והשהו מחדש ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS לפני המיון.
      הערה: מומלץ להוסיף צבע כדאיות, כגון DAPI, לתאים לפני המיון.

תוצאות

עיכול מוצלח יביא לכ-20-25 מיליון תאים עם כדאיות של 90%-95%. אם מתווספים כ-25,000 חרוזי ספירה לחלק של 8% מהריאה, החרוזים אמורים לפגוע ב-1%-3% מהאירועים שנאספו. לאחר השער על סינגלים, כ-90%-95% מהתאים צריכים להיות שליליים ל-Zombie Aqua (מה שמעיד על כדאיות) (איור 2A, איור 3A<...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר עיכול ריאות של עכבר המבודד כ-20-25 מיליון תאים לעכבר עם כדאיות של 90%-95%. זה גם מאפשר איסוף של BALF לניתוח נוסף. תרחיף התאים המתקבל תואם למספר טכניקות מעבדה, כולל ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטי לבידוד תאים לריצוף או תרבית תאים. בקצרה, לאחר ...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (R35GM150816 ו-P30DK043351), קרן צ'ארלס ה. הוד ומכון תאי הגזע של הרווארד. אנו מודים לאלכסנדר מאן ולכל שאר חברי מעבדת פרנקלין על עזרתם ועצתם בתכנון ושכלול תוכניות השער והניתוחים של זרימה ציטומטרית. אנו מודים גם לליבת אימונולוגיה ציטומטריית זרימה בבית הספר לרפואה של הרווארד. ניתוח ציטומטריית זרימה בוצע באמצעות FlowJo. סכמות איורים נוצרו באמצעות BioRender.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe with Slip TipVWRBD309659
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)Fisher Scientific12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok TipVWR75846-756
123 count eBeads Counting BeadsThermo Scientific01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)USA Scientific 7112-3300
16% paraformaldehydeVWR100503-917
23 G needle with regular bevelVWR305194
27 G needle with regular bevelVWRBD305109
5 mL pipettes (disposable)Thermo Fisher Scientific170373
50 mL centrifuge tubesOlympus 28-108
96-well round bottom plateCorning3797
ACK lysing bufferGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11cBioLegend117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)BioLegend123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV CathetersVWR381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11bBioLegend101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45BioLegend103147
C57BL/6J mice Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PELife Technologies12170280
Cell strainersCorning352350
CentrifugeEppenodorfCentrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)Millipore SigmaDN25-100MGReconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
DispaseVWR76176-668Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)Fine Science Tools11297-00
Dissection scissorsFine Science Tools14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
eBioscience fixation kitLife Technologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
EthanolVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 AntibodyBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
Glass slidesFisher Scientific12-552-3
graduated reservoirUSA Scientific 1930-2235
Ice bucketCorning432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)DechraKetamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
LiberaseMillipore Sigma5401119001Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well platesFisher Scientific07-201-731
Orbital Incubator ShakerBarnstead Lab-LineSHKE4000
p1000 pipetteEppenodorf3123000063
p1000 tipsUSA Scientific 1122-1830
p200 pipetteEppenodorf3123000055
p200 tipsUSA Scientific 1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 AntibodyBioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32 BioLegend101302Referred to as "Fc block" in text
Spray bottleVWR23609-182
Suture (Size 2-0)VWR100190-026
UnderpadsVWR56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)PivetalSee ketamine hydrocholoride notes above. 
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102

References

  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -. D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745 (2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964 (2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773 (2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920 (1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761 (2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101 (2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544 (2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988 (2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676 (2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741 (2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632 (2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652 (2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved