Aislamiento de poblaciones vivas de células mieloides y epiteliales del pulmón de ratón

Resumen

Este protocolo detalla el aislamiento de poblaciones vivas inmunes y no inmunes del pulmón de ratón en un estado estacionario y después de la infección por influenza. También proporciona estrategias de activación para identificar subconjuntos de células epiteliales y mieloides.

Resumen

El pulmón está continuamente expuesto a patógenos y otros estímulos ambientales nocivos, lo que lo hace vulnerable al daño, la disfunción y el desarrollo de enfermedades. Los estudios que utilizan modelos murinos de infección respiratoria, alergia, fibrosis y cáncer han sido fundamentales para revelar los mecanismos de progresión de la enfermedad e identificar objetivos terapéuticos. Sin embargo, la mayoría de los estudios centrados en el pulmón de ratón priorizan el aislamiento de las células inmunitarias o las células epiteliales, en lugar de ambas poblaciones al mismo tiempo. Aquí, describimos un método para preparar una suspensión completa de una sola célula de poblaciones inmunes y no inmunes adecuada para la citometría de flujo y la clasificación de células activadas por fluorescencia. Estas poblaciones incluyen células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos y una variedad de subconjuntos de células mieloides. Este protocolo consiste en el lavado broncoalveolar y el posterior inflado de los pulmones con dispasa. A continuación, los pulmones se digieren en una mezcla de liberasa. Este método de procesamiento libera una variedad de diversos tipos de células y da como resultado una suspensión de una sola célula que no requiere disociación manual contra un filtro, lo que promueve la supervivencia celular y produce un gran número de células vivas para los análisis posteriores. En este protocolo, también definimos esquemas de activación para subconjuntos de células epiteliales y mieloides tanto en pulmones naïve como en pulmones infectados por influenza. El aislamiento simultáneo de células inmunitarias y no inmunitarias vivas es clave para interrogar la diafonía intercelular y obtener una comprensión más profunda de la biología pulmonar en la salud y la enfermedad.

Introducción

El pulmón está compuesto por las vías respiratorias, los alvéolos y el intersticio. Las células inmunitarias y no inmunitarias residen dentro de estos compartimentos para contribuir tanto a la función pulmonar homeostática (intercambio de gases) como a la defensa del huésped contra las agresiones ambientales, como la infección viral. Las vías respiratorias grandes y pequeñas, o los bronquios y bronquiolos, están revestidas por células epiteliales. Las células epiteliales predominantes en estas regiones son las células club y ciliadas, que se encargan de secretar moléculas protectoras y facilitar el aclaramiento mucociliar¹. Los alvéolos son las estructuras más distales del pulmón, revestidas por dos tipos de células epiteliales, las células alveolares de tipo I (ATI) y las células alveolares de tipo II (ATII). Los ATI son responsables del intercambio de gases, y los ATII secretan y reciclan surfactantes para garantizar una tensión superficial adecuada ^2,3. Las ATIIs son auto-renovables y también pueden diferenciarse en ATIs, un papel especialmente relevante después de un daño pulmonar⁴. Además, las ATII proporcionan un nicho de apoyo para el principal tipo de células inmunitarias que pueblan el nicho alveolar, los macrófagos alveolares (AM)^5,6. Más allá del epitelio, los fibroblastos, las células endoteliales y los macrófagos intersticiales (MI) (que pueden estar asociados tanto a los nervios como a los vasos) comprenden el intersticio 7,8,9,10. En respuesta a infecciones y lesiones, numerosas células pulmonares mueren y las células inmunitarias, incluidos los monocitos y los neutrófilos, se infiltran en el tejido^11,12. Los monocitos infiltrantes pulmonares se diferencian en macrófagos y pueden contribuir al compartimento de macrófagos a largo plazo¹³.

Los métodos actuales para preparar suspensiones unicelulares del pulmón de ratón son generalmente basados en colagenasa y requieren la disociación física del tejido¹⁴. Esto puede dar lugar a un bajo número de poblaciones viables de células no inmunitarias. Algunos protocolos para aislar células epiteliales se basan en dispasas y producen mayores proporciones de células epiteliales vivas; Sin embargo, estos protocolos generalmente no investigan el rendimiento y la viabilidad de las células inmunitarias 15,16,17. La citometría de flujo es un método común utilizado para distinguir poblaciones celulares dentro de un tejido digerido. Al inicio del estudio, la activación de la citometría de flujo para AM, IM, monocitos y neutrófilos está claramente delineada. Sin embargo, durante la inflamación, el proceso de activación se vuelve variable y difícil de interpretar debido a la continuidad en la expresión de marcadores de superficie de monocitos infiltrantes que se diferencian en macrófagos. Por lo tanto, el protocolo presentado en este documento también describe estrategias de activación para identificar las poblaciones de células mieloides de interés después de la infección.

La disociación robusta de las células epiteliales y mieloides pulmonares es esencial para discernir sus funciones homeostáticas e inflamatorias. Un método para aislar estos compartimentos celulares en paralelo permitirá los análisis posteriores de los tipos de células clave que mantienen la salud y provocan enfermedades. En la Figura 1 se puede encontrar una descripción general esquemática del flujo de trabajo de este protocolo.

Protocolo

Este protocolo cumple con los lineamientos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de Harvard (números de subvención: R35GM150816 y P30DK043351). Para los experimentos se utilizaron ratones hembra C57BL/6J de entre 8 y 12 semanas de edad. Este protocolo también es adecuado para ratones macho. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de materiales

1. Descongele las enzimas necesarias en el hielo, incluidas la dispasa, la liberasa y la ADNasa.
2. Prepare otros reactivos necesarios. Llene una jeringa de 10 mL con 5 mL de EDTA de 2 mM en DPBS y colóquela con una aguja de 27 G. Llene la jeringa de 1 ml con DPBS y conecte el catéter.

2. Extracción de los pulmones

1. Eutanasia del ratón mediante inyección intraperitoneal de 400-500 mg/kg y 25-100 mg/kg de mezcla de ketamina/xilacina (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Proceda con la disección una vez que el ratón no responda al pellizco de la almohadilla del pie (~5 min).
   NOTA: Se usa una mezcla de ketamina / xilacina para la eutanasia en lugar de dióxido de carbono para prevenir la hemorragia inducida por asfixia y la infiltración de células inmunitarias que pueden confundir los resultados.
2. Rocíe el ratón con etanol al 70%. Disecciona el ratón con unas tijeras quirúrgicas finas y unas pinzas #7. Haga una incisión en el abdomen con unas tijeras y corte lateralmente a través del peritoneo.
   1. Haz un pequeño corte en el diafragma para liberar el vacío. Corte el diafragma y la caja torácica inferior de la cavidad corporal para exponer los pulmones y el corazón.
3. Perfundir los pulmones con 5 mL de EDTA de 2 mM en DPBS en una jeringa de 10 mL provista de una aguja de 27 G. La perfusión se realiza introduciendo en la base del corazón con la aguja, dirigida desde el ventrículo derecho hacia el ventrículo izquierdo, y dispensando lentamente el líquido de la jeringa¹⁸.
   NOTA: La perfusión debe realizarse lentamente para prevenir la ruptura de la vasculatura.
4. Abra la caja torácica en el esternón cortando los lados de la caja torácica, luego corte verticalmente a través del esternón para exponer la tráquea¹⁹. Corte la mayor cantidad posible de músculo y tejido conectivo con tijeras finas y pinzas # 7 sin perforar la tráquea o los pulmones.
5. Envuelva la tráquea en sutura (tamaño 2-0) como para atarla pero sin apretar. Muesca la tráquea lateralmente e inserte el catéter. Asegure la sutura firmemente alrededor del catéter tirando de la sutura con fuerza. No inserte el catéter más de 1 cm en el pulmón.
6. Infle los pulmones con 1 mL de DPBS. Extraiga el DPBS tirando lentamente de la jeringa. Vuelva a inflar los pulmones con el mismo DPBS y una vez más retire la jeringa para recolectar líquido de lavado broncoalveolar (BALF).
7. Desconecte la jeringa del catéter, dejando el catéter insertado. Dispense BALF en un tubo de microcentrífuga.
8. Llene la misma jeringa de 1 mL con 1 mL de dispasa y vuelva a colocarla en el catéter. Dispense una jeringa para inflar los pulmones con dispasa. Mientras retira el catéter, apriete la sutura alrededor de la tráquea para evitar la fuga de dispasa.
9. Corta la tráquea lateralmente. Retire los pulmones de la cavidad corporal cortando a través del tejido conectivo a lo largo de la parte posterior de la caja torácica mientras usa fórceps para tirar de los pulmones y la tráquea hacia arriba.
10. Extraer el corazón de los pulmones. Coloque los pulmones en 5 mL de DPBS sobre hielo.
11. En este paso, tome el BALF separado y gírelo a 400 x g durante 5 min a 4 °C. El sobrenadante puede ser alícuota y almacenado según sea necesario. Debe haber un pellet de célula visible que pueda resuspenderse en 100 μL de RPMI.
    NOTA: Se puede esperar hasta 2 horas para proceder con la digestión, lo que permite cosechar varios ratones a la vez.

3. Digestión de los pulmones

1. Prepara la mezcla de digestión. Añadir 83 μg/mL de liberasa (50 μL de solución madre) y 100 μg/mL de DNAtasa (15 μL de solución madre) en 3 mL de RPMI por pulmón.
2. Diseccionar los cinco lóbulos de los pulmones y descartar cualquier tejido conectivo^19,20. Pica el pulmón con unas tijeras durante 1 minuto en un portaobjetos de cristal.
3. Transfiera el pulmón picado a un tubo de centrífuga de 50 ml con unas tijeras de disección. Agregue el pellet de celda recuperado de BALF y resuspendido en RPMI en el tubo de centrífuga. Añada 3 mL de mezcla digestiva al tubo que contiene la muestra con una pipeta serológica de 5 mL.
4. Pipetea la mezcla de digestión pulmonar hacia arriba y hacia abajo 2-3 veces. Colocar a 37 °C en un agitador orbital a 140 rpm con tubos de digestión colocados en un ángulo de 45 grados durante 40 min.

4. Preparación de la suspensión unicelular

1. Retire los tubos de centrífuga de 50 ml del agitador orbital y colóquelos en hielo. Pipetea la mezcla de digestión pulmonar hacia arriba y hacia abajo 5-6 veces. Filtre a través de un filtro de células de 70 μm en un nuevo tubo de 50 ml. Lave las células restantes a través del filtro y neutralice las enzimas con 10 mL 5% de FBS en RPMI.
2. Centrifugar durante 5 min 4 °C a 600 x g. Aspire el sobrenadante con un aspirador de vacío o una pipeta. Vuelva a suspender en 1 ml de tampón de lisis ACK e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente para lisar los glóbulos rojos (RBC). Agregue 9 mL de PBS y pipetee hacia arriba y hacia abajo.
3. Centrifugar durante 5 min a 4 °C a 600 x g. Aspire el sobrenadante con un aspirador de vacío o una pipeta. Vuelva a suspender en 1 mL de tampón FACS (1% de FBS en PBS) y filtre a través de una malla de 64 μm en un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta p1000.

5. Citometría de flujo y análisis posteriores

1. Si realiza citometría de flujo o clasificación de células activadas por fluorescencia en una placa de 96 pocillos, tiña aproximadamente 1-2 millones de células por pocillo, o una fracción del 8% de la suspensión pulmonar.
2. Gira las celdas hacia abajo. Todos los giros en una placa de 96 pocillos deben realizarse durante 2,5 min (4 °C) a 600 x g. Apague el sobrenadante y lave las células una vez volviendo a suspender 200 μL de DPBS. Gira hacia abajo y mueve.
3. Si se van a teñir células para el análisis de citometría de flujo, proceda con el siguiente procedimiento de tinción.
   1. Vuelva a suspender las células en la tinción Zombie viva/muerta (1:150) y el bloque Fc (1:250) en 25 μL de DPBS durante 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
   2. Prepare la mezcla de tinción de anticuerpos a una concentración 2x en el tampón FACS.
      NOTA: Una mezcla de tinción debe incluir todos los marcadores en el panel mieloide (Tabla 1) o el panel epitelial (Tabla 2) en sus concentraciones indicadas.
   3. Añadir 25 μL de mezcla tintante a 25 μL de suspensión pulmonar en una placa e incubar en hielo durante 30 min en la oscuridad. El volumen total de tinción debe ser ahora de 50 μL, y los anticuerpos primarios deben estar en su concentración final de tinción 1x.
   4. Añadir 150 μL de tampón FACS, centrifugar durante 2,5 min a 4 °C a 600 x g y retirar el sobrenadante. Lavar dos veces en 200 μL de tampón FACS.
   5. Si se requiere tinción intracelular, fije las células con un kit de fijación intracelular. Si no se requiere tinción intracelular, las células se pueden fijar durante 20 min en PFA al 4% en DPBS.
   6. Lave el fijador con 200 μL de tampón FACS tres veces. Las muestras pueden almacenarse resuspendidas en 200 μl de tampón FACS a 4 °C en la oscuridad durante 2-3 días. Antes de ejecutar las muestras, se pueden agregar cuentas de conteo para cuantificar el número de celdas.
4. Si se van a clasificar las células, proceda con el siguiente procedimiento de tinción.
   1. Vuelva a suspender las células en una mezcla de anticuerpos de tinción 1x con bloque Fc (1:250). Incubar durante 30 minutos en hielo en la oscuridad.
   2. Añadir 150 μL de tampón FACS, centrifugar durante 2,5 min a 4 °C a 600 x g y retirar el sobrenadante. Lavar tres veces con 200 μL de tampón FACS y volver a suspender en 200 μL de tampón FACS antes de clasificar.
      NOTA: Se recomienda agregar un tinte de viabilidad, como DAPI, a las celdas antes de clasificar.

Resultados

Un digestión exitoso dará como resultado aproximadamente 20-25 millones de células con un 90%-95% de viabilidad. Si se agregan aproximadamente 25,000 cuentas de conteo a una fracción del 8% del pulmón, las cuentas deberían comprometer el 1%-3% de los eventos recolectados. Después de la compuerta en los singletes, aproximadamente el 90%-95% de las células deben ser Zombie Aqua negativas (lo que indica viabilidad) (Figura 2A, Figur...

Discusión

Este protocolo describe una digestión pulmonar de ratón que aísla aproximadamente 20-25 millones de células por ratón con una viabilidad del 90%-95%. Además, permite la recolección de BALF para su posterior análisis. La suspensión celular resultante es compatible con múltiples técnicas de laboratorio, incluida la citometría de flujo y la clasificación celular activada por fluorescencia para aislar células para secuenciación o cultivo celular. Brevemente, después de la per...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with Slip Tip	VWR	BD309659
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)	Fisher Scientific	12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok Tip	VWR	75846-756
123 count eBeads Counting Beads	Thermo Scientific	01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)	USA Scientific	7112-3300
16% paraformaldehyde	VWR	100503-917
23 G needle with regular bevel	VWR	305194
27 G needle with regular bevel	VWR	BD305109
5 mL pipettes (disposable)	Thermo Fisher Scientific	170373
50 mL centrifuge tubes	Olympus	28-108
96-well round bottom plate	Corning	3797
ACK lysing buffer	Gibco	A100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11c	BioLegend	117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)	BioLegend	123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)	BioLegend	139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45	BioLegend	103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters	VWR	381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	BioLegend	107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11b	BioLegend	101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C	BioLegend	128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45	BioLegend	103147
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscience	Life Technologies	25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PE	Life Technologies	12170280
Cell strainers	Corning	352350
Centrifuge	Eppenodorf	Centrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Millipore Sigma	DN25-100MG	Reconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Dispase	VWR	76176-668	Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)	Fine Science Tools	11297-00
Dissection scissors	Fine Science Tools	14060-09
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250
eBioscience fixation kit	Life Technologies	00-5523-00
EDTA	Life Technologies	AM9260G
Ethanol	VWR	TX89125170HU
FBS	GeminiBio	100-106	Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102406
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
Glass slides	Fisher Scientific	12-552-3
graduated reservoir	USA Scientific	1930-2235
Ice bucket	Corning	432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)	Dechra		Ketamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
Liberase	Millipore Sigma	5401119001	Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well plates	Fisher Scientific	07-201-731
Orbital Incubator Shaker	Barnstead Lab-Line	SHKE4000
p1000 pipette	Eppenodorf	3123000063
p1000 tips	USA Scientific	1122-1830
p200 pipette	Eppenodorf	3123000055
p200 tips	USA Scientific	1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)	BioLegend	118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 Antibody	BioLegend	123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6G	BioLegend	127616
Pipet-Aid	Drummond	4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302	Referred to as "Fc block" in text
Spray bottle	VWR	23609-182
Suture (Size 2-0)	VWR	100190-026
Underpads	VWR	56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)	Pivetal		See ketamine hydrocholoride notes above.
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend	423102