Isolierung von lebenden myeloischen und epithelialen Zellpopulationen aus der Lunge der Maus

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung lebender immuner und nicht-immuner Populationen aus der Lunge von Mäusen in einem stabilen Zustand und nach einer Influenzainfektion. Es bietet auch Gating-Strategien zur Identifizierung von epithelialen und myeloischen Zelluntergruppen.

Zusammenfassung

Die Lunge ist ständig Krankheitserregern und anderen schädlichen Umweltreizen ausgesetzt, was sie anfällig für Schäden, Funktionsstörungen und die Entwicklung von Krankheiten macht. Studien mit Mausmodellen für Atemwegsinfektionen, Allergien, Fibrose und Krebs waren entscheidend, um die Mechanismen des Krankheitsverlaufs aufzudecken und therapeutische Ziele zu identifizieren. Die meisten Studien, die sich auf die Lunge von Mäusen konzentrieren, priorisieren jedoch die Isolierung von Immunzellen oder Epithelzellen und nicht beide Populationen gleichzeitig. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung einer umfassenden Einzelzellsuspension sowohl von Immun- als auch von Nicht-Immunpopulationen, die für die Durchflusszytometrie und die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung geeignet ist. Zu diesen Populationen gehören Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und eine Vielzahl von myeloischen Zelluntergruppen. Dieses Protokoll beinhaltet eine bronchoalveoläre Lavage und eine anschließende Inflation der Lunge mit Dispase. Die Lungen werden dann in einem Liberase-Gemisch verdaut. Diese Verarbeitungsmethode befreit eine Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen und führt zu einer Einzelzellsuspension, die keine manuelle Dissoziation gegen einen Filter erfordert, was das Überleben der Zellen fördert und eine hohe Anzahl lebender Zellen für nachgelagerte Analysen liefert. In diesem Protokoll definieren wir auch Gating-Schemata für epitheliale und myeloische Zelluntergruppen sowohl in naiven als auch in influenzainfizierten Lungen. Die gleichzeitige Isolierung von lebenden Immun- und Nicht-Immunzellen ist der Schlüssel zur Untersuchung des interzellulären Crosstalks und für ein tieferes Verständnis der Lungenbiologie bei Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

Die Lunge besteht aus den Atemwegen, den Lungenbläschen und dem Interstitium. Immun- und Nicht-Immunzellen befinden sich in diesen Kompartimenten, um sowohl zur homöostatischen Lungenfunktion (Gasaustausch) als auch zur Abwehr des Wirts gegen Umwelteinflüsse wie Virusinfektionen beizutragen. Die großen und kleinen Atemwege, also die Bronchien und Bronchiolen, sind von Epithelzellen ausgekleidet. Die vorherrschenden Epithelzellen in diesen Regionen sind Keulen- und Flimmerzellen, die für die Sekretion von Schutzmolekülen und die Erleichterung der mukoziliären Clearance verantwortlich sind¹. Die Alveolen sind die am weitesten entfernten Strukturen in der Lunge und werden von zwei Epithelzelltypen ausgekleidet, den alveolären Typ-I-Zellen (ATIs) und den alveolären Typ-II-Zellen (ATIIs). ATIs sind für den Gasaustausch verantwortlich, und ATIIs sezernieren und recyceln Tenside, um eine angemessene Oberflächenspannung^{zu gewährleisten 2,3}. ATIIs sind selbsterneuernd und können sich auch in ATIs differenzieren, eine Rolle, die besonders nach Lungenschäden relevant ist⁴. Darüber hinaus bieten ATIIs eine unterstützende Nische für den wichtigsten Immunzelltyp, der die alveoläre Nische besiedelt, die Alveolarmakrophagen (AMs)^5,6. Neben dem Epithel bilden Fibroblasten, Endothelzellen und interstitielle Makrophagen (IMs) (die sowohl mit Nerven als auch mit Gefäßen assoziiert sein können) das Interstitium 7,8,9,10. Als Reaktion auf Infektionen und Verletzungen sterben zahlreiche Lungenzellen ab, und Immunzellen, einschließlich Monozyten und Neutrophile, infiltrieren in das Gewebe^11,12. Lungeninfiltrierende Monozyten differenzieren sich zu Makrophagen und können langfristig zum Makrophagenkompartiment beitragen¹³.

Derzeitige Methoden zur Herstellung einzelliger Suspensionen aus der Lunge der Maus basieren im Allgemeinen auf Kollagenase und erfordern eine physikalische Dissoziation von Gewebe¹⁴. Dies kann zu einer geringen Anzahl lebensfähiger nicht-immuner Zellpopulationen führen. Einige Protokolle zur Isolierung von Epithelzellen sind dispase-basiert und ergeben höhere Anteile an lebenden Epithelzellen; Diese Protokolle untersuchen jedoch im Allgemeinen nicht die Ausbeute und Lebensfähigkeit von Immunzellen 15,16,17. Die Durchflusszytometrie ist eine gängige Methode zur Unterscheidung von Zellpopulationen innerhalb eines verdauten Gewebes. Zu Studienbeginn ist das Durchflusszytometrie-Gating für AMs, IMs, Monozyten und Neutrophile klar abgegrenzt. Während der Entzündung wird der Gating-Prozess jedoch variabel und schwierig zu interpretieren, da sich infiltrierende Monozyten in Makrophagen differenzieren. Daher skizziert das hierin vorgestellte Protokoll auch Gating-Strategien zur Identifizierung myeloischer Zellpopulationen, die nach einer Infektion von Interesse sind.

Eine robuste Dissoziation von Lungenepithelzellen und myeloischen Zellen ist unerlässlich, um ihre homöostatischen und entzündlichen Funktionen zu erkennen. Eine Methode zur parallelen Isolierung dieser Zellkompartimente wird die nachgelagerte Analyse von Schlüsselzelltypen ermöglichen, die sowohl die Gesundheit erhalten als auch Krankheiten vorantreiben. Eine schematische Übersicht über den Arbeitsablauf dieses Protokolls finden Sie in Abbildung 1.

Protokoll

Dieses Protokoll entspricht den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der Harvard Medical School (Fördernummern: R35GM150816 und P30DK043351). Für die Experimente wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen verwendet. Dieses Protokoll ist auch für männliche Mäuse geeignet. Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Materialien

1. Tauen Sie notwendige Enzyme auf Eis auf, einschließlich Dispase, Liberase und DNAse.
2. Bereiten Sie andere notwendige Reagenzien vor. Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit 5 mL 2 mM EDTA in DPBS und setzen Sie sie mit einer 27-G-Nadel ein. Füllen Sie die 1-ml-Spritze mit DPBS und legen Sie den Katheter an.

2. Entnahme der Lunge

1. Euthanasieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 400-500 mg/kg und 25-100 mg/kg Ketamin/Xylazin-Gemisch (gemäß institutionell anerkannten Protokollen). Fahren Sie mit dem Sezieren fort, sobald die Maus nicht mehr auf das Einklemmen des Fußpolsters reagiert (~5 Minuten).
   HINWEIS: Anstelle von Kohlendioxid wird ein Ketamin/Xylazin-Gemisch zur Euthanasie verwendet, um erstickungsinduzierte Blutungen und Immunzellinfiltration zu verhindern, die die Ergebnisse verfälschen können.
2. Besprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol. Präparieren Sie die Maus mit einer feinen chirurgischen Schere und einer Pinzette #7. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in den Bauch und schneiden Sie seitlich durch das Bauchfell.
   1. Machen Sie einen kleinen Schnitt in die Membran, um das Vakuum abzulassen. Schneiden Sie das Zwerchfell und den unteren Brustkorb aus der Körperhöhle heraus, um die Lunge und das Herz freizulegen.
3. Perfundieren Sie die Lunge mit 5 ml 2 mM EDTA in DPBS in einer 10-ml-Spritze, die mit einer 27-g-Nadel ausgestattet ist. Die Perfusion wird durchgeführt, indem mit der Nadel, die von rechts in den linken Ventrikel gerichtet ist, in die Basis des Herzens eingedrungen ist und langsam Flüssigkeit aus der Spritze¹⁸ abgegeben wird.
   HINWEIS: Die Perfusion sollte langsam durchgeführt werden, um einen Riss des Gefäßsystems zu vermeiden.
4. Öffnen Sie den Brustkorb am Brustbein, indem Sie Seiten des Brustkorbs wegschneiden, und schneiden Sie dann vertikal durch das Brustbein, um die Luftröhre^{freizulegen 19}. Schneiden Sie mit einer feinen Schere und einer Pinzette #7 so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich ab, ohne die Luftröhre oder die Lunge zu punktieren.
5. Wickeln Sie die Luftröhre in eine Naht (Größe 2-0), als ob Sie sie abbinden wollten, aber ohne sie festzuziehen. Schneiden Sie die Luftröhre seitlich ein und führen Sie den Katheter ein. Befestigen Sie die Naht fest um den Katheter, indem Sie die Naht festziehen. Führen Sie den Katheter nicht mehr als 1 cm in die Lunge ein.
6. Blasen Sie die Lunge mit 1 ml DPBS auf. Ziehen Sie das DPBS heraus, indem Sie die Spritze langsam zurückziehen. Blasen Sie die Lunge mit demselben DPBS wieder auf und ziehen Sie die Spritze erneut zurück, um bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit (BALF) zu entnehmen.
7. Trennen Sie die Spritze vom Katheter und lassen Sie den Katheter eingeführt. Geben Sie BALF in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
8. Füllen Sie dieselbe 1-ml-Spritze mit 1 ml Dispase und befestigen Sie sie wieder an dem Katheter. Geben Sie eine Spritze ab, um die Lunge mit Dispase aufzublasen. Während Sie den Katheter entfernen, ziehen Sie die Naht um die Luftröhre fest, um ein Austreten der Dispase zu verhindern.
9. Schneiden Sie die Luftröhre seitlich durch. Entfernen Sie die Lunge aus der Körperhöhle, indem Sie das Bindegewebe entlang der Rückseite des Brustkorbs durchtrennen, während Sie die Lunge und die Luftröhre mit einer Pinzette nach oben ziehen.
10. Entferne das Herz aus der Lunge. Legen Sie die Lunge in 5 ml DPBS auf Eis.
11. Nehmen Sie in diesem Schritt das abgetrennte BALF und schleudern Sie es bei 400 x g für 5 min bei 4 °C herunter. Der Überstand kann bei Bedarf aliquotiert und gelagert werden. Es sollte ein sichtbares Zellpellet vorhanden sein, das in 100 μl RPMI resuspendiert werden kann.
    HINWEIS: Man kann bis zu 2 Stunden warten, um mit der Verdauung fortzufahren, wodurch mehrere Mäuse gleichzeitig geerntet werden können.

3. Verdauung der Lunge

1. Bereiten Sie die Digest-Mischung vor. Fügen Sie 83 μg/ml Liberase (50 μl Stammlösung) und 100 μg/ml DNAse (15 μl Stammlösung) in 3 ml RPMI pro Lunge hinzu.
2. Präparieren Sie die fünf Lungenlappen und entsorgen Sie jegliches Bindegewebe^19,20. Die Lunge mit einer Schere 1 min auf einem Objektträger zerkleinern.
3. Übertragen Sie die gehackte Lunge mit einer Sezierschere in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie aus BALF gewonnenes und in RPMI resuspendiertes Zellpellet in das Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 3 ml Aufschlussmix mit einer serologischen 5-ml-Pipette in das Röhrchen mit der Probe.
4. Pipettieren Sie die Lungenverdaumischung 2-3 Mal auf und ab. Bei 37 °C bei 140 U/min in einen Orbitalschüttler geben, wobei die Aufschlussröhrchen 40 Minuten lang in einem 45-Grad-Winkel angeordnet sind.

4. Vorbereiten der einzelligen Suspension

1. Nehmen Sie die 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus dem Orbitalschüttler und legen Sie sie auf Eis. Pipettieren Sie die Lungenverdauungsmischung 5-6 Mal auf und ab. Filtern Sie durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues 50 mL Röhrchen. Waschen Sie alle verbleibenden Zellen durch den Filter und neutralisieren Sie die Enzyme mit 10 mL 5% FBS in RPMI.
2. 5 min bei 4 °C bei 600 x g schleudern. Saugen Sie den Überstand mit einem Vakuumsauger oder einer Pipette ab. In 1 ml ACK-Lysepuffer resuspendieren und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, um rote Blutkörperchen (RBCs) zu lysieren. Fügen Sie 9 mL PBS hinzu und pipettieren Sie auf und ab.
3. 5 min bei 4 °C bei 600 x g schleudern. Überstand mit einem Vakuumaspirator oder einer Pipette aspirieren. In 1 ml FACS-Puffer (1 % FBS in PBS) resuspendieren und mit einer p1000-Pipette durch ein 64-μm-Netz in ein Mikrozentrifugenröhrchen filtrieren.

5. Durchflusszytometrie und Downstream-Analysen

1. Wenn Sie eine Durchflusszytometrie oder eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung in einer 96-Well-Platte durchführen, färben Sie etwa 1-2 Millionen Zellen pro Well oder einen Anteil von 8 % der Lungensuspension.
2. Schleudern Sie die Zellen nach unten. Alle Spins in einer 96-Well-Platte sollten 2,5 min (4 °C) bei 600 x g durchgeführt werden. Schalten Sie den Überstand ab und waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie in 200 μl DPBS resuspendieren. Drehen Sie nach unten und schnippen.
3. Wenn Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse gefärbt werden sollen, fahren Sie mit dem folgenden Färbeverfahren fort.
   1. Resuspendieren Sie Zellen in lebenden/toten Zombie-Flecken (1:150) und Fc-Blöcken (1:250) in 25 μl DPBS für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
   2. Bereiten Sie die Antikörper-Färbemischung in einer 2-fachen Konzentration im FACS-Puffer vor.
      HINWEIS: Eine Färbemischung sollte alle Marker des myeloischen Panels (Tabelle 1) oder des Epithelpanels (Tabelle 2) in den angegebenen Konzentrationen enthalten.
   3. 25 μl Färbemischung zu 25 μl Lungensuspension in eine Platte geben und 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren. Das Gesamtfärbevolumen sollte nun 50 μl betragen, und die Primärantikörper sollten ihre endgültige 1x-Färbekonzentration erreicht haben.
   4. 150 μl FACS-Puffer zugeben, 2,5 min bei 4 °C bei 600 x g herunterschleudern und den Überstand abschnippen. Zweimal in 200 μl FACS-Puffer waschen.
   5. Wenn eine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, fixieren Sie die Zellen mit einem intrazellulären Fixierungskit. Wenn keine intrazelluläre Färbung erforderlich ist, können die Zellen für 20 Minuten in 4 % PFA in DPBS fixiert werden.
   6. Waschen Sie das Fixiermittel dreimal mit 200 μl FACS-Puffer ab. Die Proben können resuspendiert in 200 μl FACS-Puffer bei 4 °C im Dunkeln für 2-3 Tage gelagert werden. Vor der Probenentnahme können Zählbeads hinzugefügt werden, um die Zellzahl zu quantifizieren.
4. Wenn Zellen sortiert werden sollen, fahren Sie mit dem folgenden Färbeverfahren fort.
   1. Resuspendieren Sie die Zellen in einer 1x Färbe-Antikörpermischung mit Fc-Block (1:250). 30 min im Dunkeln auf Eis inkubieren.
   2. 150 μl FACS-Puffer zugeben, 2,5 min bei 4 °C bei 600 x g herunterschleudern und den Überstand abschnippen. Dreimal mit 200 μl FACS-Puffer waschen und vor dem Sortieren in 200 μl FACS-Puffer resuspendieren.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, den Zellen vor dem Sortieren einen Viabilitätsfarbstoff wie DAPI zuzusetzen.

Ergebnisse

Ein erfolgreicher Verdau führt zu etwa 20-25 Millionen Zellen mit einer Lebensfähigkeit von 90 % bis 95 %. Wenn etwa 25.000 Zählperlen zu einer 8%igen Fraktion der Lunge hinzugefügt werden, sollten die Kügelchen 1%-3% der gesammelten Ereignisse beeinträchtigen. Nach dem Gating auf Singuletts sollten etwa 90 % bis 95 % der Zellen Zombie Aqua-negativ sein (was auf die Lebensfähigkeit hinweist) (Abbildung 2A, Abbildung 3A).<...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Lungenverdau der Maus, der etwa 20-25 Millionen Zellen pro Maus mit einer Lebensfähigkeit von 90 % bis 95 % isoliert. Es ermöglicht zusätzlich die Sammlung von BALF für weitere Analysen. Die resultierende Zellsuspension ist mit mehreren Labortechniken kompatibel, einschließlich Durchflusszytometrie und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, um Zellen für die Sequenzierung oder Zellkultur zu isolieren. Kurz gesagt, nach der Perfusion wird BALF gesam...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with Slip Tip	VWR	BD309659
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)	Fisher Scientific	12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok Tip	VWR	75846-756
123 count eBeads Counting Beads	Thermo Scientific	01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)	USA Scientific	7112-3300
16% paraformaldehyde	VWR	100503-917
23 G needle with regular bevel	VWR	305194
27 G needle with regular bevel	VWR	BD305109
5 mL pipettes (disposable)	Thermo Fisher Scientific	170373
50 mL centrifuge tubes	Olympus	28-108
96-well round bottom plate	Corning	3797
ACK lysing buffer	Gibco	A100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11c	BioLegend	117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)	BioLegend	123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)	BioLegend	139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45	BioLegend	103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters	VWR	381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	BioLegend	107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11b	BioLegend	101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C	BioLegend	128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45	BioLegend	103147
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscience	Life Technologies	25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PE	Life Technologies	12170280
Cell strainers	Corning	352350
Centrifuge	Eppenodorf	Centrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Millipore Sigma	DN25-100MG	Reconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Dispase	VWR	76176-668	Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)	Fine Science Tools	11297-00
Dissection scissors	Fine Science Tools	14060-09
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250
eBioscience fixation kit	Life Technologies	00-5523-00
EDTA	Life Technologies	AM9260G
Ethanol	VWR	TX89125170HU
FBS	GeminiBio	100-106	Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102406
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
Glass slides	Fisher Scientific	12-552-3
graduated reservoir	USA Scientific	1930-2235
Ice bucket	Corning	432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)	Dechra		Ketamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
Liberase	Millipore Sigma	5401119001	Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well plates	Fisher Scientific	07-201-731
Orbital Incubator Shaker	Barnstead Lab-Line	SHKE4000
p1000 pipette	Eppenodorf	3123000063
p1000 tips	USA Scientific	1122-1830
p200 pipette	Eppenodorf	3123000055
p200 tips	USA Scientific	1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)	BioLegend	118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 Antibody	BioLegend	123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6G	BioLegend	127616
Pipet-Aid	Drummond	4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302	Referred to as "Fc block" in text
Spray bottle	VWR	23609-182
Suture (Size 2-0)	VWR	100190-026
Underpads	VWR	56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)	Pivetal		See ketamine hydrocholoride notes above.
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend	423102