Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Resumo

Este protocolo detalha o isolamento de populações imunes e não imunes vivas do pulmão de camundongo em estado estacionário e após a infecção por influenza. Ele também fornece estratégias de gating para identificar subconjuntos de células epiteliais e mieloides.

Resumo

O pulmão é continuamente exposto a patógenos e outros estímulos ambientais nocivos, tornando-o vulnerável a danos, disfunções e desenvolvimento de doenças. Estudos utilizando modelos de camundongos de infecção respiratória, alergia, fibrose e câncer têm sido críticos para revelar mecanismos de progressão da doença e identificar alvos terapêuticos. No entanto, a maioria dos estudos focados no pulmão de camundongo prioriza o isolamento de células imunes ou células epiteliais, em vez de ambas as populações simultaneamente. Aqui, descrevemos um método para preparar uma suspensão abrangente de célula única de populações imunes e não imunes adequadas para citometria de fluxo e classificação de células ativadas por fluorescência. Essas populações incluem células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos e uma variedade de subconjuntos de células mieloides. Este protocolo envolve lavagem broncoalveolar e subsequente insuflação dos pulmões com dispase. Os pulmões são então digeridos em uma mistura de liberase. Este método de processamento libera uma variedade de diversos tipos de células e resulta em uma suspensão de célula única que não requer dissociação manual contra um filtro, promovendo a sobrevivência celular e produzindo um grande número de células vivas para análises posteriores. Neste protocolo, também definimos esquemas de gating para subconjuntos de células epiteliais e mieloides em pulmões ingênuos e infectados por influenza. O isolamento simultâneo de células imunes e não imunes vivas é fundamental para interrogar a diafonia intercelular e obter uma compreensão mais profunda da biologia pulmonar na saúde e na doença.

Introdução

O pulmão é composto pelas vias aéreas, alvéolos e interstício. As células imunes e não imunes residem dentro desses compartimentos para contribuir tanto para a função pulmonar homeostática (troca gasosa) quanto para a defesa do hospedeiro contra insultos ambientais, como infecção viral. As vias aéreas grandes e pequenas, ou os brônquios e bronquíolos, são revestidas por células epiteliais. As células epiteliais predominantes nessas regiões são as células em clube e ciliadas, responsáveis pela secreção de moléculas protetoras e facilitação da depuração mucociliar¹. Os alvéolos são as estruturas mais distais do pulmão, revestidas por dois tipos de células epiteliais, células alveolares tipo I (ATIs) e células alveolares tipo II (ATIIs). As ATIs são responsáveis pelas trocas gasosas e as ATIIs secretam e reciclam surfactantes para garantir a tensão superficial apropriada ^2,3. Os ATIIs são auto-renovados e também podem se diferenciar em ATIs, um papel especialmente relevante após danos pulmonares⁴. Além disso, os ATIIs fornecem um nicho de suporte para o principal tipo de célula imune que preenche o nicho alveolar, os macrófagos alveolares (AMs) ^{5 , 6} . Além do epitélio, fibroblastos, células endoteliais e macrófagos intersticiais (IMs) (que podem estar associados a nervos e vasos) compreendem o interstício 7,8,9,10. Em resposta à infecção e lesão, numerosas células pulmonares morrem e as células imunes, incluindo monócitos e neutrófilos, infiltram-se no tecido^11,12. Os monócitos infiltrantes pulmonares se diferenciam em macrófagos e podem contribuir para o compartimento dos macrófagos a longo prazo¹³.

Os métodos atuais para preparar suspensões de células únicas a partir do pulmão de camundongo são geralmente baseados em colagenase e requerem dissociação física do tecido¹⁴. Isso pode resultar em um baixo número de populações viáveis de células não imunes. Alguns protocolos para isolar células epiteliais são baseados em dispase e produzem maiores proporções de células epiteliais vivas; no entanto, esses protocolos geralmente não investigam a produção e a viabilidade das células imunes 15,16,17. A citometria de fluxo é um método comum usado para distinguir populações de células dentro de um tecido digerido. No início do estudo, a citometria de fluxo para AMs, IMs, monócitos e neutrófilos é claramente delineada. No entanto, durante a inflamação, o processo de gating torna-se variável e difícil de interpretar devido ao continuum na expressão do marcador de superfície de monócitos infiltrantes que se diferenciam em macrófagos. Portanto, o protocolo aqui apresentado também descreve estratégias de gating para identificar populações de células mieloides de interesse após a infecção.

A dissociação robusta das células epiteliais pulmonares e mieloides é essencial para discernir suas funções homeostáticas e inflamatórias. Um método para isolar esses compartimentos celulares em paralelo permitirá as análises a jusante dos principais tipos de células que mantêm a saúde e impulsionam a doença. Uma visão geral esquemática do fluxo de trabalho deste protocolo pode ser encontrada na Figura 1.

Protocolo

Este protocolo está em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Harvard Medical School (números de concessão: R35GM150816 e P30DK043351). Camundongos C57BL/6J fêmeas com idade entre 8 e 12 semanas foram utilizados para os experimentos. Este protocolo também é adequado para camundongos machos. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação de materiais

1. Descongele as enzimas necessárias no gelo, incluindo dispase, liberase e DNAse.
2. Prepare outros reagentes necessários. Encha uma seringa de 10 ml com 5 ml de EDTA 2 mM em DPBS e encaixe-a com uma agulha de 27 G. Encha a seringa de 1 mL com DPBS e conecte o cateter.

2. Colhendo os pulmões

1. Eutanasiar o camundongo por injeção intraperitoneal de 400-500 mg/kg e 25-100 mg/kg de mistura de cetamina/xilazina (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Prossiga com a dissecção quando o mouse não responder ao aperto da almofada do pé (~ 5 min).
   NOTA: Uma mistura de cetamina / xilazina é usada para eutanásia em vez de dióxido de carbono para evitar hemorragia induzida por asfixia e infiltração de células imunológicas que podem confundir os resultados.
2. Pulverize o mouse com etanol 70%. Disseque o mouse usando uma tesoura cirúrgica fina e uma pinça # 7. Faça uma incisão no abdômen usando uma tesoura e corte lateralmente através do peritônio.
   1. Faça um pequeno corte no diafragma para liberar o vácuo. Corte o diafragma e a caixa torácica inferior da cavidade corporal para expor os pulmões e o coração.
3. Perfunda os pulmões com 5 mL de EDTA 2 mM em DPBS em uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha de 27 G. A perfusão é realizada entrando na base do coração com a agulha, direcionada do ventrículo direito para o esquerdo, e dispensando lentamente o líquido da seringa¹⁸.
   NOTA: A perfusão deve ser realizada lentamente para evitar a ruptura da vasculatura.
4. Abra a caixa torácica no esterno cortando os lados da caixa torácica e, em seguida, corte verticalmente através do esterno para expor a traqueia¹⁹. Corte o máximo possível de músculo e tecido conjuntivo usando uma tesoura fina e uma pinça # 7 sem perfurar a traqueia ou os pulmões.
5. Enrole a traqueia em sutura (tamanho 2-0) como se fosse amarrá-la, mas sem apertar. Nick traqueia lateralmente e insira o cateter. Prenda a sutura firmemente ao redor do cateter puxando a sutura com força. Não insira o cateter a mais de 1 cm no pulmão.
6. Infle os pulmões com 1 mL de DPBS. Retire o DPBS puxando lentamente a seringa. Encha novamente os pulmões com o mesmo DPBS e mais uma vez puxe a seringa para trás para coletar o fluido de lavagem broncoalveolar (BALF).
7. Desconecte a seringa do cateter, deixando o cateter inserido. Dispense o BALF em um tubo de microcentrífuga.
8. Encha a mesma seringa de 1 mL com 1 mL de dispase e reconecte ao cateter. Dispense a seringa para inflar os pulmões com dispase. Ao remover o cateter, aperte a sutura ao redor da traqueia para evitar vazamento de dispersão.
9. Corte a traqueia lateralmente. Remova os pulmões da cavidade corporal cortando o tecido conjuntivo ao longo da parte de trás da caixa torácica enquanto usa uma pinça para puxar os pulmões e a traqueia para cima.
10. Remova o coração dos pulmões. Coloque os pulmões em 5 mL de DPBS no gelo.
11. Nesta etapa, pegue o BALF separado e gire para baixo a 400 x g por 5 min a 4 °C. O sobrenadante pode ser aliquotado e armazenado conforme necessário. Deve haver um grânulo celular visível que possa ser ressuspenso em 100 μL de RPMI.
    NOTA: Pode-se esperar até 2 horas para prosseguir com a digestão, o que permite que vários ratos sejam colhidos ao mesmo tempo.

3. Digerir os pulmões

1. Prepare a mistura de digestão. Adicione 83 μg/mL liberase (50 μL de solução-mãe) e 100 μg/mL de DNAse (15 μL de solução-mãe) em 3 mL de RPMI por pulmão.
2. Dissecar os cinco lobos dos pulmões e descartar qualquer tecido conjuntivo^19,20. Pique o pulmão com uma tesoura por 1 min em uma lâmina de vidro.
3. Transfira o pulmão picado para um tubo de centrífuga de 50 mL usando uma tesoura de dissecação. Adicione o pellet de célula recuperado do BALF e ressuspenso em RPMI no tubo da centrífuga. Adicionar 3 ml de mistura digestiva ao tubo que contém a amostra utilizando uma pipeta serológica de 5 ml.
4. Mistura de digestão de pulmão pipetado para cima e para baixo 2-3 vezes. Colocar a 37 °C num agitador orbital a 140 rpm com tubos de digestão colocados num ângulo de 45 graus durante 40 min.

4. Preparando a suspensão unicelular

1. Remova os tubos de centrífuga de 50 mL do agitador orbital e coloque-os no gelo. Pipete a mistura de digestão pulmonar para cima e para baixo 5-6 vezes. Filtre através de um filtro de células de 70 μm para um novo tubo de 50 mL. Lave todas as células restantes através do filtro e neutralize as enzimas com 10 mL de FBS a 5% em RPMI.
2. Gire por 5 min 4 °C a 600 x g. Aspire o sobrenadante usando um aspirador a vácuo ou pipeta. Ressuspenda em 1 mL de tampão de lise ACK e incube por 3 min em temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos (RBCs). Adicione 9 mL de PBS e pipete para cima e para baixo.
3. Gire por 5 min a 4 °C a 600 x g. Aspirar sobrenadante usando um aspirador a vácuo ou pipeta. Ressuspenda em 1 mL de tampão FACS (1% FBS em PBS) e filtre através de malha de 64 μm em um tubo de microcentrífuga usando uma pipeta p1000.

5. Citometria de fluxo e análises a jusante

1. Se estiver realizando citometria de fluxo ou classificação de células ativadas por fluorescência em uma placa de 96 poços, core aproximadamente 1-2 milhões de células por poço ou uma fração de 8% da suspensão pulmonar.
2. Gire as células para baixo. Todas as rotações em uma placa de 96 poços devem ser realizadas por 2,5 min (4 °C) a 600 x g. Retire o sobrenadante e lave as células uma vez, ressuspendendo em 200 μL de DPBS. Gire para baixo e sacuda.
3. Se as células forem coradas para análise por citometria de fluxo, prossiga com o seguinte procedimento de coloração.
   1. Ressuspenda as células em coloração de zumbi viva/morta (1:150) e bloqueio Fc (1:250) em 25 μL de DPBS por 10 min em temperatura ambiente no escuro.
   2. Prepare a mistura de coloração de anticorpos em uma concentração de 2x no tampão FACS.
      NOTA: Uma mistura de coloração deve incluir todos os marcadores no painel mielóide (Tabela 1) ou painel epitelial (Tabela 2) em suas concentrações indicadas.
   3. Adicione 25 μL de mistura de coloração a 25 μL de suspensão pulmonar em uma placa e incube no gelo por 30 minutos no escuro. O volume total de coloração deve agora ser de 50 μL e os anticorpos primários devem estar em sua concentração final de coloração 1x.
   4. Adicione 150 μL de tampão FACS, gire para baixo por 2,5 min a 4 ° C a 600 x g e desligue o sobrenadante. Lave duas vezes em 200 μL de tampão FACS.
   5. Se for necessária coloração intracelular, fixe as células com um kit de fixação intracelular. Se a coloração intracelular não for necessária, as células podem ser fixadas por 20 min em PFA a 4% na PPBS.
   6. Lave o fixador com 200 μL de tampão FACS três vezes. As amostras podem ser armazenadas ressuspensas em 200 μL de tampão FACS a 4 °C no escuro por 2-3 dias. Antes de executar as amostras, contas de contagem podem ser adicionadas para quantificar o número de células.
4. Se as células tiverem de ser classificadas, proceda ao seguinte procedimento de coloração.
   1. Ressuspenda as células em uma mistura de anticorpos de coloração 1x com bloco Fc (1:250). Incube por 30 min no gelo no escuro.
   2. Adicione 150 μL de tampão FACS, gire para baixo por 2,5 min a 4 ° C a 600 x g e desligue o sobrenadante. Lave três vezes com 200 μL de tampão FACS e ressuspenda em 200 μL de tampão FACS antes de classificar.
      NOTA: Recomenda-se adicionar um corante de viabilidade, como DAPI, às células antes da classificação.

Resultados

Um resumo bem-sucedido resultará em aproximadamente 20-25 milhões de células com viabilidade de 90% a 95%. Se aproximadamente 25.000 contas de contagem forem adicionadas a uma fração de 8% do pulmão, as contas devem comprometer 1% a 3% dos eventos coletados. Após o gating em singletes, aproximadamente 90% -95% das células devem ser Zombie Aqua negativas (indicando viabilidade) (Figura 2A, Figura 3A).

Discussão

Este protocolo descreve um resumo de pulmão de camundongo que isola aproximadamente 20-25 milhões de células por camundongo com viabilidade de 90% a 95%. Além disso, permite a coleta de LBA para análise posterior. A suspensão celular resultante é compatível com várias técnicas laboratoriais, incluindo citometria de fluxo e classificação de células ativadas por fluorescência para isolar células para sequenciamento ou cultura de células. Resumidamente, após a perfusão, o ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with Slip Tip	VWR	BD309659
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)	Fisher Scientific	12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok Tip	VWR	75846-756
123 count eBeads Counting Beads	Thermo Scientific	01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)	USA Scientific	7112-3300
16% paraformaldehyde	VWR	100503-917
23 G needle with regular bevel	VWR	305194
27 G needle with regular bevel	VWR	BD305109
5 mL pipettes (disposable)	Thermo Fisher Scientific	170373
50 mL centrifuge tubes	Olympus	28-108
96-well round bottom plate	Corning	3797
ACK lysing buffer	Gibco	A100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11c	BioLegend	117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)	BioLegend	123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)	BioLegend	139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45	BioLegend	103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters	VWR	381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	BioLegend	107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11b	BioLegend	101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C	BioLegend	128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45	BioLegend	103147
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscience	Life Technologies	25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PE	Life Technologies	12170280
Cell strainers	Corning	352350
Centrifuge	Eppenodorf	Centrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Millipore Sigma	DN25-100MG	Reconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Dispase	VWR	76176-668	Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)	Fine Science Tools	11297-00
Dissection scissors	Fine Science Tools	14060-09
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250
eBioscience fixation kit	Life Technologies	00-5523-00
EDTA	Life Technologies	AM9260G
Ethanol	VWR	TX89125170HU
FBS	GeminiBio	100-106	Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102406
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
Glass slides	Fisher Scientific	12-552-3
graduated reservoir	USA Scientific	1930-2235
Ice bucket	Corning	432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)	Dechra		Ketamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
Liberase	Millipore Sigma	5401119001	Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well plates	Fisher Scientific	07-201-731
Orbital Incubator Shaker	Barnstead Lab-Line	SHKE4000
p1000 pipette	Eppenodorf	3123000063
p1000 tips	USA Scientific	1122-1830
p200 pipette	Eppenodorf	3123000055
p200 tips	USA Scientific	1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)	BioLegend	118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 Antibody	BioLegend	123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6G	BioLegend	127616
Pipet-Aid	Drummond	4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302	Referred to as "Fc block" in text
Spray bottle	VWR	23609-182
Suture (Size 2-0)	VWR	100190-026
Underpads	VWR	56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)	Pivetal		See ketamine hydrocholoride notes above.
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend	423102