Isolamento di popolazioni di cellule mieloidi ed epiteliali vive dal polmone di topo

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio l'isolamento di popolazioni vive immunitarie e non immuni dal polmone di topo allo stato stazionario e in seguito all'infezione influenzale. Fornisce inoltre strategie di gating per l'identificazione di sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi.

Abstract

Il polmone è continuamente esposto ad agenti patogeni e altri stimoli ambientali nocivi, che lo rendono vulnerabile a danni, disfunzioni e sviluppo di malattie. Gli studi che utilizzano modelli murini di infezioni respiratorie, allergie, fibrosi e cancro sono stati fondamentali per rivelare i meccanismi di progressione della malattia e identificare i bersagli terapeutici. Tuttavia, la maggior parte degli studi incentrati sul polmone di topo dà la priorità all'isolamento delle cellule immunitarie o delle cellule epiteliali, piuttosto che di entrambe le popolazioni contemporaneamente. Qui, descriviamo un metodo per preparare una sospensione completa di singole cellule di popolazioni immunitarie e non immunitarie adatta per la citometria a flusso e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Queste popolazioni includono cellule epiteliali, cellule endoteliali, fibroblasti e una varietà di sottogruppi di cellule mieloidi. Questo protocollo prevede il lavaggio broncoalveolare e il successivo gonfiaggio dei polmoni con la dispasi. I polmoni vengono quindi digeriti in una miscela libera. Questo metodo di elaborazione libera una varietà di tipi di cellule diverse e si traduce in una sospensione di una singola cellula che non richiede la dissociazione manuale contro un filtro, promuovendo la sopravvivenza cellulare e producendo un numero elevato di cellule vive per le analisi a valle. In questo protocollo, definiamo anche schemi di gating per sottogruppi di cellule epiteliali e mieloidi sia nei polmoni naïve che in quelli infetti da influenza. L'isolamento simultaneo di cellule immunitarie e non immunitarie vive è fondamentale per interrogare il crosstalk intercellulare e ottenere una comprensione più profonda della biologia polmonare in salute e malattia.

Introduzione

Il polmone è composto dalle vie aeree, dagli alveoli e dagli interstizi. Le cellule immunitarie e non immunitarie risiedono all'interno di questi compartimenti per contribuire sia alla funzione polmonare omeostatica (scambio gassoso) che alla difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali, come l'infezione virale. Le vie aeree grandi e piccole, o bronchi e bronchioli, sono rivestite da cellule epiteliali. Le cellule epiteliali predominanti in queste regioni sono le cellule club e ciliate che sono responsabili della secrezione di molecole protettive e della facilitazione della clearance mucociliare¹. Gli alveoli sono le strutture più distali del polmone, rivestite da due tipi di cellule epiteliali, le cellule alveolari di tipo I (ATI) e le cellule alveolari di tipo II (ATII). Gli ATI sono responsabili dello scambio di gas e gli ATII secernono e riciclano i tensioattivi per garantire un'adeguata tensione superficiale ^2,3. Gli ATII si autorinnovano e possono anche differenziarsi in ATI, un ruolo particolarmente rilevante dopo il danno polmonare⁴. Inoltre, gli ATII forniscono una nicchia di supporto per il principale tipo di cellule immunitarie che popolano la nicchia alveolare, i macrofagi alveolari (AM)^5,6. Oltre all'epitelio, i fibroblasti, le cellule endoteliali e i macrofagi interstiziali (IM) (che possono essere associati sia ai nervi che ai vasi) comprendono l'interstizio 7,8,9,10. In risposta a infezioni e lesioni, numerose cellule polmonari muoiono e le cellule immunitarie, inclusi monociti e neutrofili, si infiltrano nel tessuto^11,12. I monociti infiltranti i polmoni si differenziano in macrofagi e possono contribuire al compartimento dei macrofagi a lungo termine¹³.

Gli attuali metodi per preparare sospensioni di singole cellule dal polmone di topo sono generalmente a base di collagenasi e richiedono la dissociazione fisica del tessuto¹⁴. Ciò può comportare un basso numero di popolazioni di cellule non immunitarie vitali. Alcuni protocolli per isolare le cellule epiteliali sono basati sulla dispasi e producono proporzioni più elevate di cellule epiteliali vive; Tuttavia, questi protocolli generalmente non indagano la resa e la vitalità delle cellule immunitarie 15,16,17. La citometria a flusso è un metodo comune utilizzato per distinguere le popolazioni cellulari all'interno di un tessuto digerito. Al basale, il gating della citometria a flusso per AM, IM, monociti e neutrofili è chiaramente delineato. Tuttavia, durante l'infiammazione, il processo di gating diventa variabile e difficile da interpretare a causa del continuum nell'espressione del marcatore di superficie dei monociti infiltranti che si differenziano in macrofagi. Pertanto, il protocollo qui presentato delinea anche le strategie di gating per identificare le popolazioni di cellule mieloidi di interesse dopo l'infezione.

Una robusta dissociazione delle cellule epiteliali e mieloidi polmonari è essenziale per discernere le loro funzioni omeostatiche e infiammatorie. Un metodo per isolare questi compartimenti cellulari in parallelo consentirà l'analisi a valle dei tipi di cellule chiave che mantengono la salute e guidano la malattia. Una panoramica schematica del flusso di lavoro di questo protocollo è disponibile nella Figura 1.

Protocollo

Questo protocollo è conforme alle linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee della Harvard Medical School (numeri di sovvenzione: R35GM150816 e P30DK043351). Per gli esperimenti sono stati utilizzati topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 8 e 12 settimane. Questo protocollo è adatto anche per i topi maschi. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Preparazione dei materiali

1. Scongelare gli enzimi necessari sul ghiaccio, tra cui la dispasi, la liberasi e la DNAsi.
2. Preparare gli altri reagenti necessari. Riempire una siringa da 10 mL con 5 mL di EDTA da 2 mM in DPBS e inserirla con un ago da 27 G. Riempire la siringa da 1 ml con DPBS e collegare il catetere.

2. Prelievo dei polmoni

1. Eutanasia del topo mediante iniezione intraperitoneale di 400-500 mg/kg e 25-100 mg/kg di miscela ketamina/xilazina (seguendo protocolli istituzionalmente approvati). Procedere con la dissezione quando il mouse non risponde al pizzicamento del poggiapiedi (~5 min).
   NOTA: Per l'eutanasia viene utilizzata una miscela di ketamina / xilazina al posto dell'anidride carbonica per prevenire l'emorragia indotta dal soffocamento e l'infiltrazione delle cellule immunitarie che possono confondere i risultati.
2. Spruzzare il mouse con etanolo al 70%. Seziona il topo usando le forbici chirurgiche fini e le pinze #7. Fai un'incisione nell'addome usando le forbici e taglia lateralmente attraverso il peritoneo.
   1. Fai un piccolo taglio nel diaframma per rilasciare il vuoto. Tagliare il diaframma e la gabbia toracica inferiore dalla cavità corporea per esporre i polmoni e il cuore.
3. Perfondere i polmoni con 5 mL di EDTA 2 mM in DPBS in una siringa da 10 mL dotata di un ago da 27 G. La perfusione viene eseguita entrando nella base del cuore con l'ago, diretto da destra nel ventricolo sinistro, ed erogando lentamente il liquido dalla siringa¹⁸.
   NOTA: La perfusione deve essere eseguita lentamente per evitare la rottura del sistema vascolare.
4. Aprire la gabbia toracica allo sterno tagliando via i lati della gabbia toracica, quindi tagliare verticalmente attraverso lo sterno per esporre la trachea¹⁹. Taglia via quanto più muscolo e tessuto connettivo possibile usando forbici sottili e pinze #7 senza perforare la trachea o i polmoni.
5. Avvolgere la trachea in una sutura (misura 2-0) come per legarla ma senza stringerla. Tagliare lateralmente la trachea e inserire il catetere. Fissare saldamente la sutura attorno al catetere tirando saldamente la sutura. Non inserire il catetere per più di 1 cm nel polmone.
6. Gonfiare i polmoni con 1 mL di DPBS. Estrarre il DPBS tirando lentamente indietro la siringa. Gonfiare nuovamente i polmoni con lo stesso DPBS e tirare nuovamente indietro la siringa per raccogliere il liquido di lavaggio broncoalveolare (BALF).
7. Scollegare la siringa dal catetere, lasciando il catetere inserito. Erogare BALF in una provetta da microcentrifuga.
8. Riempire la stessa siringa da 1 mL con 1 mL di dispasi e ricollegarla al catetere. Erogare la siringa per gonfiare i polmoni con la dispasi. Durante la rimozione del catetere, stringere la sutura attorno alla trachea per evitare perdite di dispasi.
9. Tagliare lateralmente la trachea. Rimuovere i polmoni dalla cavità corporea tagliando il tessuto connettivo lungo la parte posteriore della gabbia toracica mentre si utilizza una pinza per tirare i polmoni e la trachea verso l'alto.
10. Rimuovi il cuore dai polmoni. Mettere i polmoni in 5 ml di DPBS su ghiaccio.
11. A questo punto, prendere il BALF separato e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C. Il surnatante può essere aliquotato e conservato secondo necessità. Dovrebbe esserci un pellet cellulare visibile che può essere risospeso in 100 μL di RPMI.
    NOTA: Si può attendere fino a 2 ore per procedere con la digestione, il che consente di raccogliere più topi alla volta.

3. Digerire i polmoni

1. Preparare la miscela di digest. Aggiungere 83 μg/mL di liberasi (50 μL di soluzione madre) e 100 μg/mL di DNAsi (15 μL di soluzione madre) in 3 mL di RPMI per polmone.
2. Sezionare i cinque lobi dei polmoni e scartare il tessuto connettivo^19,20. Tagliare il polmone con le forbici per 1 minuto su un vetrino.
3. Trasferire il polmone tagliato in una provetta da centrifuga da 50 ml utilizzando le forbici da dissezione. Aggiungere il pellet di cella recuperato dal BALF e risospeso in RPMI nella provetta da centrifuga. Aggiungere 3 mL di miscela digestiva alla provetta contenente il campione utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
4. Miscela di digestato polmonare pipettato su e giù 2-3 volte. Porre a 37 °C in un agitatore orbitale a 140 giri/min con tubi di digestione posizionati con un angolo di 45 gradi per 40 minuti.

4. Preparazione della sospensione a cella singola

1. Rimuovere le provette da centrifuga da 50 mL dall'agitatore orbitale e metterle sul ghiaccio. Pipettare la miscela di digestato polmonare su e giù 5-6 volte. Filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una nuova provetta da 50 mL. Lavare le cellule rimanenti attraverso il filtro e neutralizzare gli enzimi con 10 mL di FBS al 5% in RPMI.
2. Centrifugare per 5 min 4 °C a 600 x g. Aspirare il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto o una pipetta. Risospendere in 1 mL di tampone di lisi ACK e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi (RBC). Aggiungere 9 mL di PBS e pipettare su e giù.
3. Centrifugare per 5 minuti a 4 °C a 600 x g. Aspirare il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto o una pipetta. Risospendere in 1 mL di tampone FACS (1% FBS in PBS) e filtrare attraverso una rete da 64 μm in una provetta per microcentrifuga utilizzando una pipetta p1000.

5. Citometria a flusso e analisi a valle

1. Se si esegue la citometria a flusso o la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza in una piastra a 96 pozzetti, colorare circa 1-2 milioni di cellule per pozzetto o una frazione dell'8% della sospensione polmonare.
2. Gira le celle verso il basso. Tutte le centrifughe in una piastra a 96 pozzetti devono essere eseguite per 2,5 minuti (4 °C) a 600 x g. Staccare il surnatante e lavare le celle una volta risospendendo in 200 μl di DPBS. Gira verso il basso e scorri.
3. Se le cellule devono essere colorate per l'analisi di citometria a flusso, procedere con la seguente procedura di colorazione.
   1. Risospendere le cellule nella colorazione Zombie vivo/morto (1:150) e nel blocco Fc (1:250) in 25 μL di DPBS per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
   2. Preparare la miscela colorante con anticorpi a una concentrazione 2x nel tampone FACS.
      NOTA: Una miscela colorante deve includere tutti i marcatori nel pannello mieloide (Tabella 1) o nel pannello epiteliale (Tabella 2) alle concentrazioni indicate.
   3. Aggiungere 25 μl di miscela colorante a 25 μl di sospensione polmonare in una piastra e incubare su ghiaccio per 30 minuti al buio. Il volume totale di colorazione dovrebbe ora essere di 50 μl e gli anticorpi primari dovrebbero essere alla loro concentrazione finale di colorazione 1x.
   4. Aggiungere 150 μl di tampone FACS, centrifugare per 2,5 minuti a 4 °C a 600 x g e rimuovere il surnatante. Lavare due volte in 200 μl di tampone FACS.
   5. Se è necessaria la colorazione intracellulare, fissare le cellule con un kit di fissazione intracellulare. Se non è richiesta la colorazione intracellulare, le cellule possono essere fissate per 20 minuti in PFA al 4% in DPBS.
   6. Lavare il fissativo con 200 μL di tampone FACS tre volte. I campioni possono essere conservati risospesi in 200 μL di tampone FACS a 4 °C al buio per 2-3 giorni. Prima di eseguire i campioni, è possibile aggiungere microsfere di conteggio per quantificare il numero di cellule.
4. Se le cellule devono essere ordinate, procedere con la seguente procedura di colorazione.
   1. Risospendere le cellule in una miscela di anticorpi colorante 1x con blocco Fc (1:250). Incubare per 30 minuti su ghiaccio al buio.
   2. Aggiungere 150 μl di tampone FACS, centrifugare per 2,5 minuti a 4 °C a 600 x g e rimuovere il surnatante. Lavare tre volte con 200 μl di tampone FACS e risospendere in 200 μl di tampone FACS prima di ordinare.
      NOTA: Si consiglia di aggiungere un colorante vitale, come il DAPI, alle cellule prima della cernita.

Risultati

Un digest di successo si tradurrà in circa 20-25 milioni di cellule con una vitalità del 90%-95%. Se circa 25.000 microsfere di conteggio vengono aggiunte a una frazione dell'8% del polmone, le microsfere dovrebbero compromettere l'1%-3% degli eventi raccolti. Dopo il gating su singoletti, circa il 90%-95% delle cellule dovrebbe essere Zombie Aqua negativo (indicando vitalità) (Figura 2A, Figura 3A).

Discussione

Questo protocollo delinea un digestato polmonare di topo che isola circa 20-25 milioni di cellule per topo con una vitalità del 90%-95%. Consente inoltre la raccolta di BALF per ulteriori analisi. La sospensione cellulare risultante è compatibile con diverse tecniche di laboratorio, tra cui la citometria a flusso e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza per isolare le cellule per il sequenziamento o la coltura cellulare. In breve, dopo la perfusione, viene raccolto il BALF ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe with Slip Tip	VWR	BD309659
1.7 mL microcentrifuge tube	DOT Scientific	RN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)	Fisher Scientific	12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok Tip	VWR	75846-756
123 count eBeads Counting Beads	Thermo Scientific	01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)	USA Scientific	7112-3300
16% paraformaldehyde	VWR	100503-917
23 G needle with regular bevel	VWR	305194
27 G needle with regular bevel	VWR	BD305109
5 mL pipettes (disposable)	Thermo Fisher Scientific	170373
50 mL centrifuge tubes	Olympus	28-108
96-well round bottom plate	Corning	3797
ACK lysing buffer	Gibco	A100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11c	BioLegend	117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)	BioLegend	123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)	BioLegend	139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45	BioLegend	103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV Catheters	VWR	381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)	BioLegend	107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11b	BioLegend	101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6C	BioLegend	128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45	BioLegend	103147
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscience	Life Technologies	25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PE	Life Technologies	12170280
Cell strainers	Corning	352350
Centrifuge	Eppenodorf	Centrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)	Millipore Sigma	DN25-100MG	Reconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Dispase	VWR	76176-668	Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)	Fine Science Tools	11297-00
Dissection scissors	Fine Science Tools	14060-09
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250
eBioscience fixation kit	Life Technologies	00-5523-00
EDTA	Life Technologies	AM9260G
Ethanol	VWR	TX89125170HU
FBS	GeminiBio	100-106	Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 Antibody	BioLegend	102406
Gibco RPMI 1640 Medium	Fisher Scientific	11-875-093
Glass slides	Fisher Scientific	12-552-3
graduated reservoir	USA Scientific	1930-2235
Ice bucket	Corning	432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)	Dechra		Ketamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
Liberase	Millipore Sigma	5401119001	Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well plates	Fisher Scientific	07-201-731
Orbital Incubator Shaker	Barnstead Lab-Line	SHKE4000
p1000 pipette	Eppenodorf	3123000063
p1000 tips	USA Scientific	1122-1830
p200 pipette	Eppenodorf	3123000055
p200 tips	USA Scientific	1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)	BioLegend	118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 Antibody	BioLegend	123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6G	BioLegend	127616
Pipet-Aid	Drummond	4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32	BioLegend	101302	Referred to as "Fc block" in text
Spray bottle	VWR	23609-182
Suture (Size 2-0)	VWR	100190-026
Underpads	VWR	56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)	Pivetal		See ketamine hydrocholoride notes above.
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend	423102