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요약

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

초록

폐는 병원균 및 기타 유해한 환경 자극에 지속적으로 노출되어 손상, 기능 장애 및 질병 발병에 취약합니다. 호흡기 감염, 알레르기, 섬유증 및 암에 대한 마우스 모델을 활용한 연구는 질병 진행 메커니즘을 밝히고 치료 대상을 식별하는 데 매우 중요했습니다. 그러나 쥐의 폐에 초점을 맞춘 대부분의 연구는 면역 세포와 상피 세포 중 하나를 동시에 분리하는 것보다 두 집단을 분리하는 것을 우선시합니다. 여기에서는 유세포 분석 및 형광 활성화 세포 분류에 적합한 면역 및 비면역 집단 모두에 대한 포괄적인 단일 세포 현탁액을 준비하는 방법을 설명합니다. 이러한 집단에는 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포 및 다양한 골수성 세포 부분 집합이 포함됩니다. 이 프로토콜은 기관지폐포 세척과 그에 따른 폐의 팽창을 수반합니다. 그런 다음 폐는 리바아제 혼합물로 분해됩니다. 이 처리 방법은 다양하고 다양한 세포 유형을 유리하게 만들고 필터에 대한 수동 해리가 필요하지 않은 단일 세포 현탁액을 생성하여 세포 생존을 촉진하고 다운스트림 분석을 위해 많은 수의 살아있는 세포를 생성합니다. 이 프로토콜에서는 또한 naive 및 influenza 감염 폐 모두에서 상피 및 골수성 세포 하위 집합에 대한 게이팅 체계를 정의합니다. 살아 있는 면역 세포와 비면역 세포를 동시에 분리하는 것은 세포 간 누화를 조사하고 건강 및 질병에서 폐 생물학에 대한 더 깊은 이해를 얻는 데 중요합니다.

서문

폐는 기도(airway), 폐포(alveoli) 및 간질(interstitium)로 구성되어 있습니다. 면역 세포와 비면역 세포는 이러한 구획 내에 상주하여 항상성 폐 기능(가스 교환)과 바이러스 감염과 같은 환경적 위협에 대한 숙주 방어에 기여합니다. 크고 작은 기도 또는 기관지와 세기관지에는 상피 세포가 늘어서 있습니다. 이 영역에서 우세한 상피 세포는 곤봉 세포와 섬모 세포(ciliated cell)로, 보호 분자를 분비하고 점액 섬모 청소를 촉진하는 역할을 합니다1. 폐포는 폐에서 가장 말단에 있는 구조로, 폐포 I형 세포(ATI)와 폐포 II형 세포(ATIIs)의 두 가지 상피 세포 유형이 늘어서 있습니다. ATI는 가스 교환을 담당하고 ATII는 적절한 표면 장력을 보장하기 위해 계면 활성제를 분비하고 재활용합니다 2,3. ATII는 자가 재생되며 ATI로 분화될 수도 있는데, 이는 특히폐 손상 4 이후에 중요한 역할을 한다. 또한 ATII는 폐포 틈새에 서식하는 주요 면역 세포 유형인 폐포 대식세포(AM)에 대한 지지 틈새를 제공합니다5,6. 상피 너머에는 섬유아세포, 내피 세포 및 간질 대식세포(IM)(신경 및 혈관과 관련될 수 있음)가 간질(interstitium) 7,8,9,10을 구성합니다. 감염과 부상에 대한 반응으로 수많은 폐세포가 죽고 단핵구와 호중구를 포함한 면역 세포가 조직 안으로 침투합니다11,12. 폐 침윤 단핵구(lung-infiltrating monocyte)는 대식세포로 분화하여 장기적으로 대식세포 구획에 기여할 수 있습니다13.

마우스 폐에서 단세포 현탁액을 제조하는 현재 방법은 일반적으로 콜라겐분해효소 기반이며 조직의 물리적 해리를 필요로 합니다14. 이로 인해 생존 가능한 비면역 세포 집단의 수가 줄어들 수 있습니다. 상피 세포를 분리하기 위한 일부 프로토콜은 디스파제 기반이며 살아있는 상피 세포의 비율이 더 높습니다. 그러나 이러한 프로토콜은 일반적으로 면역 세포 수율 및 생존력을 조사하지 않습니다 15,16,17. 유세포 분석은 분해된 조직 내에서 세포 집단을 구별하는 데 사용되는 일반적인 방법입니다. 베이스라인에서는 AM, IM, 단핵구 및 호중구에 대한 유세포 분석 게이팅이 명확하게 설명되어 있습니다. 그러나 염증이 발생하는 동안에는 게이팅 과정이 가변적이고 대식세포로 분화하는 침투 단핵구의 표면 마커 발현의 연속성으로 인해 해석하기 어려워집니다. 그러므로, 본 명세서에 제시된 프로토콜은 감염 후 관심 있는 골수성 세포 집단을 식별하기 위한 게이팅 전략도 개략적으로 설명합니다.

폐 상피 세포와 골수성 세포의 강력한 해리는 항상성 및 염증 기능을 식별하는 데 필수적입니다. 이러한 세포 구획을 병렬로 분리하는 방법을 통해 건강을 유지하고 질병을 유발하는 주요 세포 유형의 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 워크플로우에 대한 개략적인 개요는 그림 1에서 찾을 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 하버드 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 지침을 준수합니다(보조금 번호: R35GM150816 및 P30DK043351). 8-12주 된 암컷 C57BL/6J 마우스가 실험에 사용되었습니다. 이 프로토콜은 수컷 마우스에도 적합합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 재료 준비

  1. 얼음 위에서 dispase, liberase, DNAse를 포함한 필수 효소를 해동합니다.
  2. 다른 필요한 시약을 준비하십시오. 10mL 주사기에 2mM EDTA 5mL를 DPBS로 채우고 27G 바늘로 끼웁니다. 1mL 주사기에 DPBS를 채우고 카테터를 부착합니다.

2. 폐 적출

  1. 400-500 mg/kg 및 25-100 mg/kg 케타민/자일라진 혼합물의 복강 내 주사로 마우스를 안락사시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 마우스가 풋 패드 핀치에 반응하지 않으면 해부를 진행합니다(~5분).
    참고: 안락사에는 이산화탄소 대신 케타민/자일라진 혼합물을 사용하여 질식으로 인한 출혈 및 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 면역 세포 침투를 방지합니다.
  2. 마우스에 70% 에탄올을 뿌립니다. 미세한 수술 용 가위와 # 7 집게를 사용하여 마우스를 해부합니다. 가위를 사용하여 복부를 절개하고 복막을 옆으로 자릅니다.
    1. 진공을 해제하기 위해 다이어프램을 작게 자릅니다. 체강에서 횡격막과 하부 흉곽을 잘라내어 폐와 심장을 노출시킵니다.
  3. 27G 바늘이 장착된 10mL 주사기에 DPBS의 2mM EDTA 5mL를 폐에 관류합니다. 관류는 바늘로 심장 기저부에 들어가 오른쪽에서 좌심실로 향하게 하고 주사기(18)에서 액체를 천천히 분배함으로써 수행됩니다.
    참고: 관류는 혈관 조직 파열을 방지하기 위해 천천히 수행해야 합니다.
  4. 흉곽의 측면을 잘라내어 흉골의 흉곽을 연 다음 흉골을 수직으로 잘라 기관을 노출시킵니다19. 기관이나 폐에 구멍을 뚫지 않고 가는 가위와 #7 집게를 사용하여 가능한 한 많은 근육과 결합 조직을 잘라냅니다.
  5. 기관을 봉합사(크기 2-0)로 묶는 것처럼 감싸되 조이지 않습니다. 기관을 옆으로 흠집내고 카테터를 삽입합니다. 봉합사를 단단히 당겨 카테터 주위에 봉합사를 단단히 고정합니다. 카테터를 폐에 1cm 이상 삽입하지 마십시오.
  6. DPBS 1mL로 폐를 팽창시킵니다. 주사기를 천천히 뒤로 당겨 DPBS를 당겨 빼냅니다. 동일한 DPBS로 폐를 다시 팽창시키고 다시 한 번 주사기를 당겨 기관지폐포 세척액(BALF)을 채취합니다.
  7. 카테터에서 주사기를 분리하고 카테터를 삽입한 상태로 둡니다. BALF를 마이크로 원심분리기 튜브에 분주합니다.
  8. 동일한 1mL 주사기에 1mL의 디스페이스를 채우고 카테터에 다시 부착합니다. 주사기를 투여하여 폐를 디스파제로 팽창시킵니다. 카테터를 제거하는 동안 기관 주변의 봉합사를 조여 디스파제의 누출을 방지합니다.
  9. 기관을 옆으로 자릅니다. 흉곽 뒤쪽을 따라 결합 조직을 절단하고 집게를 사용하여 폐와 기관을 위로 당겨 체강에서 폐를 제거합니다.
  10. 폐에서 심장을 제거합니다. 얼음 위에 5mL의 DPBS에 폐를 놓습니다.
  11. 이 단계에서 분리된 BALF를 취하고 4°C에서 5분 동안 400 x g 로 스핀다운합니다. 상등액은 필요에 따라 분주되어 저장될 수 있습니다. 100μL의 RPMI에 재현탁할 수 있는 눈에 보이는 세포 펠릿이 있어야 합니다.
    참고: 소화를 진행하기 위해 최대 2시간을 기다릴 수 있으며, 이를 통해 한 번에 여러 마우스를 수확할 수 있습니다.

3. 폐 소화

  1. 다이제스트 믹스를 준비합니다. 폐당 3mL의 RPMI에 83μg/mL 리라아제(50μL 원액)와 100μg/mL DNAse(15μL 원액)를 추가합니다.
  2. 폐의 5엽을 절개하고 결합 조직을 모두 버린다19,20. 유리 슬라이드에서 가위로 1분 동안 폐를 자릅니다.
  3. 해부 가위를 사용하여 다진 폐를 50mL 원심분리 튜브에 옮깁니다. BALF에서 회수하여 RPMI에 재현탁된 세포 펠릿을 원심분리기 튜브에 추가합니다. 5mL 혈청학 피펫을 사용하여 샘플이 들어 있는 튜브에 3mL의 소화 혼합물을 추가합니다.
  4. 피펫 폐 소화 혼합물을 위아래로 2-3회 반복합니다. 37°C의 오비탈 셰이커에 140rpm의 오비탈 셰이커에 넣고 소화관을 45도 각도로 40분 동안 놓습니다.

4. 단일 세포 현탁액 준비

  1. 오비탈 셰이커에서 50mL 원심분리 튜브를 제거하고 얼음 위에 놓습니다. 피펫 폐 소화 혼합물을 위아래로 5-6 번. 70μm 세포 여과기를 통해 새 50mL 튜브로 여과합니다. 필터를 통해 남아 있는 세포를 세척하고 RPMI에서 10mL 5% FBS로 효소를 중화합니다.
  2. 600 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 회전합니다. 진공 흡입기 또는 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다. ACK 용해 완충액 1mL에 재현탁하고 실온에서 3분 동안 배양하여 적혈구(RBC)를 용해합니다. PBS 9mL와 피펫을 위아래로 추가합니다.
  3. 600 x g에서 4 ° C에서 5 분 동안 회전합니다. 진공 흡입기 또는 피펫을 사용하여 상층액을 흡입합니다. 1mL의 FACS 완충액(PBS의 경우 1% FBS)에 재현탁하고 p1000 피펫을 사용하여 64μm 메시를 통해 마이크로 원심분리 튜브로 여과합니다.

5. 유세포 분석 및 다운스트림 분석

  1. 96-well 플레이트에서 유세포 분석 또는 형광 활성화 세포 분류를 수행하는 경우 well당 약 1-200만 개의 세포 또는 lung suspension의 8% 분획을 염색합니다.
  2. 셀을 스핀 다운합니다. 96웰 플레이트의 모든 스핀은 600 x g에서 2.5분(4°C) 동안 수행해야 합니다. 상층액을 튕겨내고 200μL의 DPBS에 재현탁하여 세포를 한 번 세척합니다. 스핀을 다운하고 튕깁니다.
  3. 유세포 분석을 위해 세포를 염색해야 하는 경우 다음 염색 절차를 진행하십시오.
    1. 25μL의 DPBS에 살아있는/죽은 좀비 염색(1:150) 및 Fc 블록(1:250)의 세포를 어두운 실온에서 10분 동안 재현탁합니다.
    2. 항체 염색 혼합물을 FACS 완충액에서 2배 농도로 준비합니다.
      참고: 염색 혼합물에는 골수성 패널(표 1) 또는 상피 패널(표 2)의 모든 마커가 표시된 농도로 포함되어야 합니다.
    3. 플레이트에 25μL의 폐 현탁액에 25μL의 염색 혼합물을 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다. 이제 총 염색 부피는 50μL가 되어야 하며 1차 항체는 최종 1x 염색 농도에 도달해야 합니다.
    4. 150μL의 FACS 완충액을 추가하고 600 x g에서 4°C에서 2.5분 동안 스핀다운한 다음 상층액을 튕겨냅니다. 200μL의 FACS 완충액에서 두 번 세척합니다.
    5. 세포 내 염색이 필요한 경우 세포 내 고정 키트로 세포를 고정합니다. 세포 내 염색이 필요하지 않은 경우 DPBS의 4% PFA로 세포를 20분 동안 고정할 수 있습니다.
    6. 200μL의 FACS 완충액으로 정착액을 3회 세척합니다. 샘플은 200μL의 FACS 완충액에 4°C의 암흑 속에서 2-3일 동안 재현탁하여 보관할 수 있습니다. 샘플을 실행하기 전에 세포 수를 정량화하기 위해 카운팅 비드를 추가할 수 있습니다.
  4. 세포를 분류해야 하는 경우 다음 염색 절차를 진행하십시오.
    1. Fc 블록과 1x 염색 항체 혼합물에서 세포를 재현탁합니다(1:250). 어둠 속에서 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
    2. 150μL의 FACS 완충액을 추가하고 600 x g에서 4°C에서 2.5분 동안 스핀다운한 다음 상층액을 튕겨냅니다. 200μL의 FACS 버퍼로 3회 세척하고 분류하기 전에 200μL의 FACS 버퍼에 재현탁합니다.
      참고: 분류하기 전에 DAPI와 같은 생존 염료를 세포에 추가하는 것이 좋습니다.

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결과

성공적인 분해는 90%-95%의 생존율을 가진 약 20-2,500만 개의 세포를 얻을 수 있습니다. 약 25,000개의 계수 구슬이 폐의 8% 분획에 추가되면 구슬은 수집된 이벤트의 1%-3%를 손상시켜야 합니다. singlet에 대한 게이팅 후 세포의 약 90%-95%가 Zombie Aqua 음성(생존력 표시)이어야 합니다(그림 2A, 그림 3A).

CD45+ 세...

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토론

이 프로토콜은 90%-95%의 생존율로 마우스당 약 2,0-2,500만 개의 세포를 분리하는 마우스 폐 소화를 간략하게 설명합니다. 또한 추가 분석을 위해 BALF를 수집할 수 있습니다. 그 결과로 생성된 세포 현탁액은 염기서열분석 또는 세포 배양을 위해 세포를 분리하기 위한 유세포 분석 및 형광 활성화 세포 분류를 포함한 여러 실험실 기술과 호환됩니다. 간단히 말해서, 관류 후 BA...

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공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 미국 국립보건원(R35GM150816 및 P30DK043351), 찰스 H. 후드 재단 및 하버드 줄기세포 연구소의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. Alexander Mann과 Franklin 실험실의 다른 모든 구성원이 유세포 분석 게이팅 계획 및 분석을 설계하고 개선하는 데 도움과 조언을 제공해 주신 것에 감사드립니다. 또한 하버드 의과대학의 Immunology Flow Cytometry Core에도 감사드립니다. 유세포 분석은 FlowJo를 사용하여 수행되었습니다. 그림 회로도는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL syringe with Slip TipVWRBD309659
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)Fisher Scientific12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok TipVWR75846-756
123 count eBeads Counting BeadsThermo Scientific01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)USA Scientific 7112-3300
16% paraformaldehydeVWR100503-917
23 G needle with regular bevelVWR305194
27 G needle with regular bevelVWRBD305109
5 mL pipettes (disposable)Thermo Fisher Scientific170373
50 mL centrifuge tubesOlympus 28-108
96-well round bottom plateCorning3797
ACK lysing bufferGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11cBioLegend117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)BioLegend123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV CathetersVWR381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11bBioLegend101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45BioLegend103147
C57BL/6J mice Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PELife Technologies12170280
Cell strainersCorning352350
CentrifugeEppenodorfCentrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)Millipore SigmaDN25-100MGReconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
DispaseVWR76176-668Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)Fine Science Tools11297-00
Dissection scissorsFine Science Tools14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
eBioscience fixation kitLife Technologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
EthanolVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 AntibodyBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
Glass slidesFisher Scientific12-552-3
graduated reservoirUSA Scientific 1930-2235
Ice bucketCorning432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)DechraKetamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
LiberaseMillipore Sigma5401119001Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well platesFisher Scientific07-201-731
Orbital Incubator ShakerBarnstead Lab-LineSHKE4000
p1000 pipetteEppenodorf3123000063
p1000 tipsUSA Scientific 1122-1830
p200 pipetteEppenodorf3123000055
p200 tipsUSA Scientific 1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 AntibodyBioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32 BioLegend101302Referred to as "Fc block" in text
Spray bottleVWR23609-182
Suture (Size 2-0)VWR100190-026
UnderpadsVWR56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)PivetalSee ketamine hydrocholoride notes above. 
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102

참고문헌

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