JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توضح هذه المقالة كيفية تجميع جهاز يمكن استخدامه لجمع الحليب من فئران المختبر. هذا الجهاز ميسور التكلفة ومحمول ويسمح بجمع 0.1-0.5 مل من الحليب بواسطة شخص مدرب واحد. يتم أيضا تضمين بروتوكول حلب مفصل.

Abstract

تم استخدام نماذج القوارض على نطاق واسع في علم الأحياء منذ أوائل القرن العشرين لدراسة علم وظائف الأعضاء الأساسي والآليات الكيميائية الحيوية. في أبحاث الرضاعة ونمو حديثي الولادة ، هناك حاجة إلى أخذ عينات من الحليب لتحديد التركيبة وكيف يمكن أن يتأثر الحليب بالتلاعب التجريبي ، مما يؤثر على نمو الولدان. قد يكون من الصعب جمع السوائل الحيوية بكميات كافية من القوارض الصغيرة. أظهرت العديد من الدراسات تقنيات مختلفة للحصول على الحليب من الفئران. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه التقنيات موظفين مدربين على الأقل ، مما قد يمثل تحديا في بعض الحالات.

هنا ، نوضح تقنية معدلة لأخذ عينات الحليب بناء على طريقة نشرت في عام 2009. باستخدام هذه الطريقة الميسورة التكلفة وسهلة التجميع ، يمكن لشخص مدرب واحد الحصول بشكل روتيني على 0.1-0.5 مل من الحليب من سد تحت التخدير في أقل من 10 دقائق. باستخدام هذه الطريقة ، جمعنا ما يكفي من الحليب في يوم ما بعد الولادة 2 (PD2) ويوم ما بعد الولادة 10 (PD10). قمنا بقياس مكونات المغذيات الكبيرة في الحليب ومقارنتها بالأدبيات الموجودة للتحقق من صحة طريقة الجمع لدينا.

سجلنا أنه في PD2 ، بلغ متوسط بروتين الحليب 70.1 ± 5.2 جم / لتر ، ودهون الحليب 174.4 ± 7.1 جم / لتر ، وكان اللاكتوز في الحليب 12.3 ± 0.6 جم / لتر. في PD10 ، بينما ظل اللاكتوز والبروتين في الحليب بتركيزات مماثلة كما في PD2 ، كانت دهون الحليب أعلى بشكل ملحوظ (224.4 ± 17.1 جم / لتر). لاحظنا أيضا أن الوفرة النسبية لبروتينات الحليب الفردية تختلف بين PD2 و PD10. وبشكل أكثر تحديدا ، كان αS1-الكازين وبروتين مصل اللبن الحمضي أعلى ، بينما كان β-الكازين أقل في PD10 مقارنة ب PD2. بشكل عام ، نظهر تقنية فعالة لشخص واحد لأخذ عينات الحليب من الفئران باستخدام جهاز يمكن تجميعه بسهولة باستخدام معدات مختبرية شائعة الاستخدام.

Introduction

يشير الطب المقارن إلى فكرة أن البشر الأخرى تشترك في أوجه التشابه في علم التشريح وعلم وظائف الأعضاء. وبالتالي ، يمكن استخدام المعلومات المستفادة من أحد الأنواع لدراسة مسارات مماثلة في الآخر1،2. منذأوائل القرن العشرين ، تم استخدام القوارض ، وتحديدا الفئران والجرذان ، على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية بسبب التلاعب الجيني السهل نسبيا لتطوير نماذج المرض1،2. بالإضافة إلى ذلك ، فهي صغيرة نسبيا. وبالتالي ، هناك حاجة إلى موارد أقل للحفاظ على المستعمرات مقارنة بنماذج الثدييات الأخرى غير القوارض2. ومع ذلك ، فإن أحجام أجسامهم الصغيرة تأتي أيضا مع تحديات. لا يمكن إجراء إجراءات معينة بسهولة على الفئران. على سبيل المثال ، يمكن إجراء تقنية الفرق الشرياني الوريدي على الفئران3،4،5 ، ولكنها قد تكون صعبة في الفئران لأن الأوعية الدموية الصغيرة يمكن أن تتمزقبسهولة 6،7. كمية الأنسجة التي يمكن أخذ عينات منها من الفأر محدودة أيضا. على سبيل المثال ، في الفئران المرضعة ، تنخفض الأنسجة الدهنية الحشوية بشكل كبير في الحجم8,9 وفي بعض الحالات ، إلى كميات لا يمكن اكتشافها تقريبا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أخذ عينات من السوائل الحيوية من الفئران محدود أيضا في الكمية. اعتمادا على التقنية ، قد يختلف حجم الدم الذي تم أخذ عينات منه ولكنه دائما ما يكون محدودا إلى حدما 7 ، مما يحد من عدد التحليلات التي يمكن إجراؤها.

في أبحاث الرضاعة ونمو حديثي الولادة ، هناك حاجة لأخذ عينات من الحليب لتقييم التركيب وإنتاج الحليب. في الدراسات التي أجريت على الفئران ، نظرا لحجم الحليب المحدود ، غالبا ما يتم تجميع العينات من عدة سدود لإنتاج كمية كافية10. يوضح عدد من الدراسات تقنيات لجمع كميات تحليلية كافية من الحليب من فأرواحد 11،12،13. ومع ذلك ، تتطلب هذه الأساليب عادة موظفين مدربين11،12: أحدهما لحمل أثناء شفط الحليب يدويا والآخر لجمع الحليب باستخدام ماصة. أو تتطلب معدات وأدوات غير متوفرة بسهولة في المختبر. هنا ، نوضح تعديلا لتقنية ابتكرها DePeters و Hovey14. يمكن تجميع الجهاز المستخدم في هذا الإجراء بسهولة باستخدام المعدات المتوفرة في المختبر أو شراؤه بسهولة من البائعين العاديين. باستخدام هذا الجهاز ، يمكن لشخص واحد الحصول بشكل روتيني على 0.1-0.5 مل من حليب الفأر في أقل من 10 دقائق لاستخدامه في معظم التحليلات. قمنا بجمع الحليب في اليوم 2 بعد الولادة (PD2 ، الرضاعة المبكرة) واليوم 10 بعد الولادة (PD10 ، ذروة الرضاعة) وقمنا بقياس المغذيات الكبيرة للحليب للتحقق من صحة الطريقة.

Protocol

اتبعت جميع إجراءات رعاية والتجارب الإرشادات الفيدرالية وحصلت على موافقة من لجنة رعاية المؤسسية بجامعة روتجرز واستخدامها. تزاوجت إناث الفئران (خلفية C57BL / 6) في عمر 8 أسابيع. تم إطعامهم مربي قياسي طعام إعلان حريص واحتفظوا به تحت دورة إضاءة: مظلمة منتظمة 12:12 ساعة. تم احتساب يوم التسليم على أنه يوم ما بعد الولادة 1 (PD1). في PD2 (الرضاعة المبكرة) و PD10 (ذروة الرضاعة) ، تم أخذ عينات من الحليب كما هو موضح أدناه.

1. تجميع جهاز الحلب

  1. قم بتوصيل أحد طرفي أنبوب البولي فينيل كلوريد (PVC) ذو القطر الداخلي 5/32 بوصة بمضخة التفريغ واستخدم شريطا لتأمين المرفق (المسمى أ في الشكل 1 أ).
    ملاحظة: يمكن استبدال مضخة التفريغ بأي مضخة مناسبة أو فراغ مركزي (يسمى أحيانا "فراغ المنزل") متوفر في المختبر.
  2. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب PVC ID مقاس 5/32 بوصة بأنبوب PVC ID 1/8 بوصة عبر موصل مستقيم شائك.
  3. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب PVC ID 1/8 بوصة بإبرة تحت الجلد 18G عبر موصل (المسمى ب في الشكل 1 أ).
  4. قم بقص طرف طرف الماصة P200 ~ 0.2 سم لإنشاء فتحة أكبر. أدخل طرف الماصة P200 من خلال فتحة سدادة الحاجز بحيث يشير الطرف إلى الأعلى (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: قم بتغيير أطراف الماصة بين.
  5. قم بتوصيل سدادة الحاجز بأنبوب تجميع معقم. قم بعمل ثقب من خلال سدادة الحاجز بإبرة تحت الجلد 18 جم.
  6. تحقق من ضغط الشفط عن طريق تشغيل مضخة التفريغ ووضع إصبع (مغطى بقفاز مختبر) على فتحة طرف الماصة.
    ملاحظة: يجب أن تشعر بشفط لطيف إذا تم تجميعه بشكل صحيح. يجب أن يكون أنبوب التجميع والإبرة تحت الجلد 18 جم وأطراف الماصة P200 معقمة.

figure-protocol-1768
الشكل 1: جهاز الحلب. (أ) جهاز حلب بمضخة تفريغ متصلة بإبرة تحت الجلد 18 جم عبر أنابيب PVC. تمر الإبرة عبر سدادة الحاجز المتصلة بأنبوب تجميع أجهزة الطرد المركزي الدقيقة. يتم إدخال طرف ماصة P-200 المقلوب ، والذي يستخدم لسحب الحليب من الحلمة ، من خلال فتحة سدادة الحاجز. (ب) مخطط المقطع العرضي لجهاز الحلب. (ج) سد يتم حلب بالطريقة الموصوفة. (د) حصة تمثيلية (0.3 مل) من الحليب الذي تم جمعه من السد في ذروة الرضاعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. فصل السد عن الجراء

  1. في يوم الحلب ، افصل السد عن صغارها للسماح بتراكم الحليب في الغدد.
  2. حافظ على دفء الجراء في العش.
  3. اترك ساعتين من الفصل إذا تم جمع الحليب أثناء الرضاعة المبكرة (على سبيل المثال ، PD2 في هذه الدراسة).
  4. اترك 30-45 دقيقة من الانفصال إذا تم جمع الحليب خلال ذروة الرضاعة (على سبيل المثال ، PD10 في هذه الدراسة).

3. تخدير السد

  1. عندما يكون السد جاهزا للحلب, إعطاء حقنة من الكيتامين / زيلازين محلول (داخل الصفاق ، i.p.) في جانب واحد من التجويف البريتوني بين 4و 5 زوج من الحلمات.
    ملاحظة: يتم حساب كمية محلول التخدير المراد إعطاؤه بوزن السد (80-100 مجم / كجم كيتامين ، 5-12 مجم / كجم زيلازين ، وفقا لبروتوكول IACUC بجامعة روتجرز). ستعمل هذه الجرعة على تخدير الفأر لمدة 45-60 دقيقة ، مما يوفر وقتا كافيا لجمع الحليب.
  2. تأكد من التخدير عن طريق الضغط على القدم بقوة ، ولكن دون إصابتها ، لاختبار إدراك للإحساس والألم. يشار إلى التخدير الكافي من خلال عدم وجود حركة من أي نوع.
  3. ضع مرهم العيون البيطري على عيون السد لمنع الجفاف أثناء التخدير.

4. جمع الحليب

  1. ضع السد المخدر على ظهرها على سطح عمل صلب. امسح منطقة الثدي برفق بمنديل معقم للكحول لتنظيف المنطقة قبل الحلب.
  2. قم بإعطاء 1-2 وحدة من الأوكسيتوسين (i.p.) بينالزوج 4 و 5 من الحلمات على جانب التجويف البريتوني الذي لم يتلق أي حقنة.
    ملاحظة: الأوكسيتوسين هو جزيء صغير يمكن امتصاصه بسرعة وله عمر نصف قصير 14،15. يجب أن يبدأ الحلب في غضون دقيقة بعد الحقن.
  3. أمسك السد عن طريق تجريف منطقة رقبتها برفق باليد غير المهيمنة.
  4. شفط الحليب يدويا من الحلمة عن طريق عصر الأنسجة الثديية من القاعدة إلى طرف الحلمة حتى تظهر حبة حليب.
  5. قم بتشغيل جهاز التفريغ عن طريق تشغيل زر الطاقة.
  6. ابدأ الحلب عن طريق وضع طرف الماصة P200 المقلوب برفق على الحلمة. استخدم حركة سحب لطيفة للمساعدة في سحب الحليب (الشكل 1 ج).
  7. كرر الخطوات 4.4-4.6 على جميع الحلمات حتى يتم جمع كمية كافية من الحليب.
    ملاحظة: أثناء الحلب ، يمكن سحب الحليب عن طريق الخطأ إلى إبرة تحت الجلد 18 جم أو أنبوب PVC لخط التفريغ. يمكن معالجة ذلك بسهولة عن طريق تغيير الإبرة أو أنبوب PVC قبل حلب التالي.

5. استعادة السد بعد جمع الحليب

  1. أعد السد المخدر إلى القفص مع صغارها واحتفظ بالدفء. راقب حتى يستعيد وعيه.
    ملاحظة: قد يرفض السد الرضاعة مرة أخرى إذا سمح لها بالاستيقاظ بمفردها في قفص منفصل قبل العودة إلى صغارها. يكون هذا أكثر شيوعا عندما يتم جمع الحليب أثناء الرضاعة المبكرة (PD2).
  2. دع السدود تبتعد عن صغارها لتتعافى تماما عندما تبدأ في الاستيقاظ. هذا سلوك طبيعي.
    ملاحظة: نلاحظ عودة السدود إلى صغارها بشكل دوري وتعود إلى الرضاعة بالكامل بعد بضع ساعات.

6. تحليل الحليب

  1. استخدم مجموعة فحص اللاكتوز التجارية (انظر جدول المواد) لقياس اللاكتوز الحليب. خفف الحليب 75 مرة بالماء المعقم وقم بإجراء الفحص وفقا لبروتوكول المجموعة.
  2. قم بقياس دهون الحليب باستخدام طريقة الكريماتوكريت الموضحة في منشورات أخرى16،17.
  3. قم بتقدير بروتين الحليب عن طريق إجراء اختبار بروتين برادفورد18 مع ألبومين مصل الأبقار باعتباره المعيار19. قبل إجراء الفحص ، قم بالطرد المركزي للحليب عند 4,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. استخرج الأشعة تحت الحمراء عن طريق سحب العينة وتخفيفها إلى 1:10 بالماء المعقم قبل الفحص.
  4. إجراء الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) ؛ افصل 10 ميكروغرام من البروتين على جل مبيد مسبق الصب بنسبة 4٪ -12٪ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. انقل البروتينات إلى أغشية فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) ولطخها باستخدام Coomassie Blue R-250.

النتائج

باستخدام هذه التقنية ، نجحنا في أخذ عينات كافية من الحليب في أوقات مختلفة خلال الرضاعة لمدة 21 يوما. نعتبر أن يوم الولادة هو يوم ما بعد الولادة 1 (PD1) ، وفي هذا العمل ، أخذنا عينات من الحليب على PD2 (الرضاعة المبكرة) و PD10 (ذروة الرضاعة) ، ن = 4 لكل منهما. حصلنا بشكل مريح على 0.1-0.5 مل من الحليب من كل سد (الشكل 1 د). للتحقق من صحة هذه الطريقة ، قمنا بقياس التركيب الإجمالي للمغذيات الكبيرة لعينات الحليب هذه وقارنا الاختلافات بين الحليب الذي تم جمعه في وقت مبكر وذروة الرضاعة باستخدام اختبار Student's t.

وجدنا أن متوسط تركيز اللاكتوز في الحليب بلغ 12.3 ± 0.6 جم / لتر في PD2 و 12.0 ± 0.9 جم / لتر في PD10 (الجدول 1). كانت نسبة دهون الحليب 26.0 ± 1.0٪ و 33.4 ± 2.5٪ على PD2 و PD10 على التوالي. كان تركيز الدهون 174.4 ± 7.1 جم / لتر على PD2 وأعلى بكثير ، 224.4 ± 17.1 جم / لتر في PD10 (الجدول 1). كان متوسط محتويات البروتين 70.1 ± 5.2 جم / لتر على PD2 و 75.1 ± 2.6 جم / لتر في PD10 (الجدول 1). على الرغم من أن محتوى بروتين الحليب الكلي لم يكن مختلفا بين PD2 و PD10 ، إلا أن الوفرة النسبية لبروتين الحليب الفردي اختلفت. على وجه التحديد ، كان αS1-الكازين وبروتين مصل اللبن الحمضي أعلى في حليب PD10 منه في حليب PD2 (ص < 0.05) ، بينما أظهر β-كازين (ص < 0.05) وفرة أعلى في PD2 من PD10 (الشكل 2).

figure-results-1532
الشكل 2: تحليل بروتين الحليب. (أ) تحليل Coomassie Blue-stained PAGE للحليب الذي تم جمعه في PD2 و PD10. تم تحديد البروتين كما هو موضحسابقا 14. (ب) تم تحليل إشارات البروتين الفردية في ImageJ وتطبيعها إلى البروتين الكلي الملطخ. تم التعبير عن النتائج كمتوسط مع أشرطة الخطأ القياسية ونقاط البيانات الفردية كنقاط. تمت مقارنة متوسط وفرة كل بروتين في PD2 و PD10 باستخدام اختبار Student's T ثنائي الذيل. * ص < 0.05 ، ن = 4. الاختصارات: PAGE = الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد ؛ PDn = يوم ما بعد التسليم n. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

متوسطالتسويق عبر محرك البحثقيمة p
لاكتوز
(غ/لتر)		الرقم 212.30.60.75
الرقم 1012.00.9
دهن
(غ/لتر)		الرقم 2174.47.10.04
الرقم 10224.417.1
بروتين
(غ/لتر)		الرقم 270.15.20.42
الرقم 1075.12.6

الجدول 1: تكوين المغذيات الكبيرة للحليب الذي تم جمعه في PD2 و PD10. تم تحليل النتائج ، المعبرا عنها كمتوسط وخطأ معياري للمتوسط (SEM) ، لفحص آثار يوم الرضاعة على تكوين الحليب باستخدام اختبار t للطالب ثنائي الذيل ، n = 4.

Discussion

لقد أظهرنا تقنية حلب معدلة يمكن إجراؤها بواسطة شخص واحد باستخدام جهاز يمكن تجميعه بسهولة وحمله. تقليديا ، يتم جمع حليب القوارض باستخدام أنابيب شعرية10،17 ، أو ماصات باستور زجاجية12 ، أو ماصات دقيقة11. تتطلب هذه الطرق شخصا واحدا كبح جماح السد وشفط الحليب يدويا وآخر لجمع الحليب. قد يكون هذا صعبا في بعض الأحيان ، خاصة عندما يحدث أخذ عينات الحليب خلال عطلات نهاية الأسبوع أو العطلات. يجب نقل الحليب الذي يتم جمعه بهذه الطرق إلى أنابيب تخزين معقمة. نظرا لأن حليب القوارض يحتوي على نسبة عالية نسبيا من الدهون (كما هو موضح هنا وفي دراسات أخرى20،21) ، وبالتالي فهو لزج ، فمن المحتمل أن تؤدي عملية نقل الحليب إلى فقدان حجم الحليب ، مما يحد من كميات التحليلات. يمكن تجميع الجهاز الموصوف هنا في أقل من 5 دقائق باستخدام الأدوات المتوفرة في المختبر. يمكن استخدامه بسهولة من قبل شخص واحد لتذوق كمية كافية من الحليب في غضون 10 دقائق. يخفف نهج الشفط اللطيف المستمر المرتبط بهذه الطريقة من مشكلة فقدان العينة بسبب النقل حيث يتم سحب الحليب باستمرار مباشرة إلى أنبوب التجميع. يعد تقليل فقدان العينة مهما بشكل خاص عند جمع الحليب في وقت مبكر من PD2 حيث من المعروف أن إنتاج الحليب منخفض نسبيا في هذه المرحلة10. علاوة على ذلك ، تم استخدام نفس الجهاز والبروتوكول لجمع الحليب بنجاح من سلالة فأر أخرى (خلفية FVB / N) ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة تعمل على الأرجح بشكل جيد عبر سلالات الماوس.

في هذه الدراسة ، لاحظنا أيضا أن وقت الانفصال قد يختلف اعتمادا على مرحلة الرضاعة. تشير الدراسات السابقة إلى أنه يجب فصل السدود عن صغارها لمدة 2 ساعة على الأقل وحتى 16 ساعة قبل جمع الحليب للحصول على حجم حليب كاف11،13. عند استخدام هذه الطريقة ، وجدنا أن فصل السدود عن صغارها لمدة ساعتين في الرضاعة المبكرة (PD2) ولمدة 30-45 دقيقة فقط في ذروة الرضاعة (PD10) كان كافيا للحصول على كمية كافية من الحليب. نظرا لأن السد يستغرق وقتا إضافيا للتعافي من التخدير ، فإن تقليل مدة الانفصال لا يقلل فقط من وقت أخذ العينات ولكن يقلل أيضا من التأثير المحتمل الذي قد يشكله على السد وصغارها.

بالإضافة إلى ذلك ، وجدنا أن جمع الحليب في وقت مبكر من PD2 قد يؤثر سلبا على النمو اللاحق للصغار بسبب وقت الانفصال والتعافي الطويل للسد ، مما يؤدي إلى فترة من عدم كفاية التغذية. لم يلاحظ ذلك عند أخذ عينات من الحليب في ذروة الرضاعة (PD10). لذلك ، إذا كان المحقق مهتما بأخذ عينات من الحليب في نقاط زمنية مختلفة خلال فترة الرضاعة البالغة 21 يوما ، فمن المستحسن أخذ عينات من حليب الرضاعة المبكرة من مجموعة منفصلة من السدود. ومع ذلك ، يمكن إجراء جمع الحليب على نفس السد عدة مرات أثناء ذروة الرضاعة ومتأخرها للدراسات الطولية.

بدلا من ذلك ، قد يختار الباحثون عوامل تخدير أخرى لتقليل وقت التعافي من السد. على سبيل المثال ، قد يساعد استنشاق الأيزوفلوران في تقليل وقت الشفاء لأن عادة ما تتعافى بسرعة عند التوقف عن تناول الأيزوفلوران22. على الرغم من أن هذا الاختيار من التخدير يتم إجراؤه من قبل العديدمن 13،23 ، فقد أفيد أن استنشاق الأيزوفلوران قد يؤثر سلبا على حجم الحليب الذي تم جمعه13. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب استنشاق الأيزوفلوران جهازا مناسبا لضمان التحكم الدقيق في الجرعة. البحث حول آثار عوامل التخدير مثل الكيتامين / الزيلازين والأيزوفلوران على الرضاعة وتكوين الحليب ونقلها المحتمل إلى لبن الثدي محدود24 ، 25 ، 26. لذلك ، ينصح بإجراء تفسير البيانات بعناية عند مقارنة الدراسات التي تستخدم خيارات مختلفة من التخدير. بديل آخر هو أخذ عينات من الحليب بدون تخدير ، كما وصفه باحثون آخرون14،27،28،29. ومع ذلك ، يمكن أن يتسبب هذا الإجراء في إجهاد زائد على السد ويتطلب شخصا إضافيا لكبح جماح.

أظهرت هذه الدراسة أيضا أنه يمكن إجراء فحوصات المغذيات الكبيرة باستخدام عينات الحليب ، مع وجود فائض متبقي لمزيد من الإجراءات مثل تحليلات omics. تم قياس مستويات اللاكتوز والبروتين والدهون في الحليب ومقارنتها بالبيانات المنشورة للتحقق من صحة الطريقة الموصوفة. يمثل تركيز اللاكتوز في الحليب ~ 1.2٪ من مكون الحليب ، وهو مشابه لتركيز الفئران التي تتبع نظاما غذائيا خاضعا للتحكم في دراسات أخرى30،31،32. تم تأكيد أن حليب الفأر يحتوي على نسبة عالية من الدهون ، تتراوح من 26٪ إلى 33٪ ، كما وردسابقا 20،30. كان تركيز البروتين الكلي المذكور هنا مشابها لتركيز البروتين الإجمالي الذي أبلغ عنه Chen et al.30 ولكنه أقل من ذلك الذي تم الإبلاغ عنه في دراسات أخرى31،32. فيما يتعلق بالتغيرات من الرضاعة المبكرة إلى ذروتها ، وجدنا أن مستويات اللاكتوز والبروتين ظلت ثابتة نسبيا ، لكن نسبة دهون الحليب زادت من الرضاعة المبكرة إلى ذروتها. هذا خلاف مع Ragueneau32 ، ولكن قد يكون التناقض بسبب الاختلافات في حجم العينة. على الرغم من أن تركيز البروتين الكلي كان متشابها بين الرضاعة المبكرة وذروتها ، فقد وجدنا أن وفرة البروتين الفردية (αS1-الكازين ، β-كازين ، وبروتين مصل اللبن الحمضي) متباينة ، مما يفترض أن يعكس التغيرات في احتياجات الولدان في مراحل النمو المختلفة.

على الرغم من أن هذه التقنية لا تسمح بتحديد كمية إنتاج الحليب ، إلا أنه يمكن حساب ذلك باستخدام مؤشر الأداء (IOP) الذي اقترحه Falconer في عام 194733. يعتمد إنتاج الحليب بشكل كبير على حجم القمامة ويوم أخذ العينات. يمكن استخدام هذا المؤشر كمقياس لإنتاج الحليب مع مراعاة الاختلافات في حجم القمامة. على سبيل المثال ، يمكن وزن القمامة بأكملها على PD10 (عندما يتم فصل السد لأخذ عينات الحليب). ثم يتم حساب IOP للسد بقسمة وزن القمامة على متوسط وزن القمامة من نفس الحجم في PD10. في الختام ، نظهر تقنية فعالة لشخص واحد لأخذ عينات الحليب من فئران المختبر باستخدام جهاز يمكن تجميعه بسهولة باستخدام معدات غير مكلفة نسبيا ومتاحة بسهولة. تسمح هذه التقنية بجمع كميات كافية من الحليب بشكل متسق لمعظم التحليلات.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مشروع NJAES Hatch 14190 و NIH R21HD 108496.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL cryogenic vialsCorning430658Preferred for early milk collection
1 mL syringeExel26048
2 mL microcentrifuge collecting tubeFisher Scientific02-681-344Preferred for peak and late milk collection
18 G hypodermic needleBD PrecisionGlide305195
27 G hypodermic needleBD PrecisionGlide305109
Alcohol prep wipeHoneywell154818
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent ConcentrateBio-Rad5000006
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA2153
Immobilon -P PVDF MembraneImmobilonIPVH00010
KetamineDechra1000001250Purchased via Veternarian Office 
Laboratory labeling tapeVWR International89097
Lactose Assay KitSigma-AldrichMAK487
Mini Barbed polypropylene fittingsCole-Parmer Instrument Company6365-90
Mouse dietLab Diet5015
NuPAGE Bis-Tris Mini Protein Gels, 4–12%InvitrogenNP0335BOX
Optixcare Eye LubeAventixN/APurchased via Veternarian Office 
OxytocinBimeda1OXY015Purchased via Veternarian Office 
P200 pipette tipsGilsonF1733001
PVC tubing: 1/8'' IDVWR InternationalMFLX07407-75 
PVC tubing: 5/32'' IDVWR InternationalMFLX07407-77
Septum stopperChemglass Life SciencesCG-3022-91
Vacuum pumpDrummond Scientific Co.P-103635
XylazineAkorn Animal HealthNDC 59399-110-20Purchased via Veternarian Office 

References

  1. Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. A brief history of animal modeling. Mo Med. 110 (3), 201-205 (2013).
  2. Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Watford, M., Erbelding, E. J., Smith, E. M. Glutamine metabolism in rat small intestine: Response to lactation. Biochem Soc Trans. 14 (6), 1058-1059 (1986).
  4. Robinson, A. M., Williamson, D. H. Comparison of glucose metabolism in the lactating mammary gland of the rat in vivo and in vitro. Effects of starvation, prolactin or insulin deficiency. Biochem J. 164 (1), 153-159 (1977).
  5. Kowalski, T. J., Wu, G., Watford, M. Rat adipose tissue amino acid metabolism in vivo as assessed by microdialysis and arteriovenous techniques. Am J Physiol. 273 (3 Pt 1), E613-E622 (1997).
  6. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
  7. Hallemeesch, M. M., Ten Have, G. A., Deutz, N. E. Metabolic flux measurements across portal drained viscera, liver, kidney and hindquarter in mice. Lab Animal. 35 (1), 101-110 (2001).
  8. Le, H., Nguyen, M., Manso, H. E. C., Wang, M. D., Watford, M. Adipocytes are the only site of glutamine synthetase expression within the lactating mouse mammary gland. Curr Dev Nutr. 8 (6), 102168(2024).
  9. Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: The extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
  10. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 84 (1), 127-133 (1986).
  11. Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and reeves' muntjac deer. J Vis Exp. (89), e51007(2014).
  12. Muranishi, Y., et al. Method for collecting mouse milk without exogenous oxytocin stimulation. Biotechniques. 60 (1), 47-49 (2016).
  13. Gómez-Gallego, C., et al. A method to collect high volumes of milk from mice (mus musculus). Anales de Veterinaria de Murcia. 29, 55-61 (2014).
  14. DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
  15. Oxytocin- oxytocin injection. , https://dailymed.nlm.nih.gov/dailymed/fda/fdaDrugXsl.cfm?setid=a9b62187-4141-487c-a9da-f42ad7f9b408&type=display (2019).
  16. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: Simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  17. Paul, H. A., Hallam, M. C., Reimer, R. A. Milk collection in the rat using capillary tubes and estimation of milk fat content by creamatocrit. J Vis Exp. (106), e53476(2015).
  18. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford protein assay. J Vis Exp. (38), e1918(1918).
  19. Hueso, D., Fontecha, J., Gomez-Cortes, P. Comparative study of the most commonly used methods for total protein determination in milk of different species and their ultrafiltration products. Front Nutr. 9, 925565(2022).
  20. Anderson, S. M., Rudolph, M. C., Mcmanaman, J. L., Neville, M. C. Key stages in mammary gland development. Secretory activation in the mammary gland: It's not just about milk protein synthesis. Breast Cancer Res. 9 (1), 204(2007).
  21. Meier, H., Hoag, W. G., Mcburney, J. J. Chemical characterization of inbred-strain mouse milk. I. Gross composition and amino acid analysis. J Nutr. 85 (3), 305-308 (1965).
  22. Hohlbaum, K., et al. Severity classification of repeated isoflurane anesthesia in c57bl/6jrj mice-assessing the degree of distress. PLoS One. 12 (6), e0179588(2017).
  23. Weaver, S. R., et al. Serotonin deficiency rescues lactation on day 1 in mice fed a high fat diet. PLoS One. 11 (9), e0162432(2016).
  24. Statement on resuming breastfeeding after anesthesia. , Committee on Obstetric Anesthesia. https://www.asahq.org/standards-and-practice-parameters/statement-on-resuming-breastfeeding-after-anesthesia (2009).
  25. Lee, J. J., Rubin, A. P. Breast feeding and anaesthesia. Anaesthesia. 48 (7), 616-625 (1993).
  26. Reece-Stremtan, S., Campos, M., Kokajko, L. Academy of Breastfeeding, M. Abm clinical protocol #15: Analgesia and anesthesia for the breastfeeding mother, revised 2017. Breastfeed Med. 12 (9), 500-506 (2017).
  27. Oosting, A., Verkade, H. J., Kegler, D., Van De Heijning, B. J., Van Der Beek, E. M. Rapid and selective manipulation of milk fatty acid composition in mice through the maternal diet during lactation. J Nutr Sci. 4, e19(2015).
  28. Silverman, J., Stone, D. W., Powers, J. D. The lipid composition of milk from mice fed high or low fat diets. Lab Animal. 26 (2), 127-131 (1992).
  29. Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Animal. 29 (4), 450-455 (1995).
  30. Chen, Y., et al. Effect of high-fat diet on secreted milk transcriptome in midlactation mice. Physiol Genomics. 49 (12), 747-762 (2017).
  31. Kucia, M., et al. High-protein diet during gestation and lactation affects mammary gland mrna abundance, milk composition and pre-weaning litter growth in mice. Animal. 5 (2), 268-277 (2011).
  32. Ragueneau, S. Early development in mice. Iv: Quantity and gross composition of milk in five inbred strains. Physiol Behav. 40 (4), 431-435 (1987).
  33. Falconer, D. S. Milk production in mice. J Agric Sci. 37 (3), 224-235 (1947).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved