Una técnica eficiente para una sola persona para el muestreo de leche de ratones de laboratorio

Resumen

Este artículo describe cómo ensamblar un dispositivo que se puede usar para recolectar leche de ratones de laboratorio. Este dispositivo es asequible, portátil y permite la recolección de 0,1 a 0,5 ml de leche por parte de una persona capacitada. También se incluye un protocolo de ordeño detallado.

Resumen

Los modelos de roedores han sido ampliamente utilizados en biología desde principios del siglo XX para estudiar la fisiología básica y los mecanismos bioquímicos. En la investigación sobre la lactancia y el desarrollo neonatal, es necesario tomar muestras de leche para determinar la composición y cómo la leche puede verse afectada por manipulaciones experimentales, lo que repercute en el desarrollo del recién nacido. La recolección de biofluidos en cantidades suficientes de pequeños roedores puede ser difícil. Varios estudios han demostrado diferentes técnicas para obtener leche de ratones. Sin embargo, estas técnicas a menudo requieren al menos dos personas capacitadas, lo que puede ser un desafío en algunos casos.

Aquí, demostramos una técnica de muestreo de leche modificada basada en un método publicado en 2009. Con este método asequible y fácil de montar, una persona capacitada puede obtener rutinariamente de 0,1 a 0,5 ml de leche de una madre bajo anestesia en menos de 10 minutos. Con este método, recolectamos suficiente leche el día 2 posterior al parto (PD2) y el día 10 posterior al parto (PD10). Medimos los componentes de los macronutrientes de la leche y los comparamos con la literatura existente para validar nuestro método de recolección.

Registramos que en PD2, la proteína láctea promedió 70,1 ± 5,2 g/L, la grasa láctea fue de 174,4 ± 7,1 g/L y la lactosa láctea fue de 12,3 ± 0,6 g/L. En PD10, mientras que la lactosa y la proteína de la leche se mantuvieron en concentraciones similares a las de PD2, la grasa láctea fue significativamente mayor (224,4 ± 17,1 g/L). También observamos que la abundancia relativa de las proteínas individuales de la leche variaba entre PD2 y PD10. Más específicamente, la αS1-caseína y la proteína ácida de suero fueron más altas, mientras que la β-caseína fue menor en PD10 en comparación con PD2. En general, demostramos una técnica eficiente de una sola persona para el muestreo de leche de ratones utilizando un dispositivo que se puede ensamblar fácilmente con equipos de laboratorio de uso común.

Introducción

La medicina comparativa se refiere a la idea de que los humanos y otros animales comparten similitudes en anatomía y fisiología; Por lo tanto, la información aprendida de una especie se puede utilizar para estudiar vías similares en la otra ^1,2. Desde principios del siglo^XX, los roedores, específicamente ratones y ratas, han sido ampliamente utilizados en la investigación biomédica debido a la relativamente fácil manipulación genética para el desarrollo de modelos de enfermedades ^1,2. Además, son relativamente pequeños; Por lo tanto, se requieren menos recursos para mantener las colonias en comparación con otros modelos de mamíferos no roedores². Sin embargo, sus pequeños tamaños corporales también conllevan desafíos. Ciertos procedimientos no se pueden realizar fácilmente en ratones. Por ejemplo, la técnica de diferencia arteriovenosa se puede realizar en ratas ^3,4,5, pero puede ser un desafío en ratones, ya que sus pequeños vasos sanguíneos pueden romperse fácilmente ^6,7. La cantidad de tejido que se puede muestrear de un ratón también es limitada. Por ejemplo, en ratones lactantes, el tejido adiposo visceral disminuye significativamente en tamaño ^8,9 y, en algunos casos, a cantidades casi indetectables. Además, el muestreo de biofluido de ratones también es limitado en cantidad; Dependiendo de la técnica, el volumen de sangre muestreado puede variar, pero siempre es algo limitado⁷, lo que restringe el número de análisis que se pueden realizar.

En la investigación sobre la lactancia y el desarrollo neonatal, es necesario tomar muestras de leche para evaluar la composición y la producción de leche. En los estudios realizados en ratones, debido al volumen limitado de leche, a menudo se agrupan muestras de varias madres para producir una cantidad adecuada¹⁰. Varios estudios demuestran técnicas para la recolección de volúmenes analíticos suficientes de leche de un solo ratón 11,12,13. Estos métodos, sin embargo, suelen requerir de dos personas entrenadas^11,12: una para sujetar al animal mientras se extrae la leche manualmente y otra para recoger la leche con una pipeta; o requieren equipos y herramientas que no están fácilmente disponibles en un laboratorio. Aquí, demostramos una modificación de una técnica ideada por DePeters y Hovey¹⁴. El dispositivo utilizado en este procedimiento se puede ensamblar fácilmente con el equipo disponible en el laboratorio o comprarse fácilmente a proveedores comunes. Con este dispositivo, una persona puede obtener de forma rutinaria entre 0,1 y 0,5 ml de leche de ratón en menos de 10 minutos para utilizarla en la mayoría de los análisis. Se recolectó leche en el día 2 posterior al parto (PD2, lactancia temprana) y el día 10 posterior al parto (PD10, lactancia máxima) y se midieron los macronutrientes de la leche para validar el método.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales y de cuidado animal siguieron las pautas federales y recibieron la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rutgers. Los ratones hembra (C57BL/6 fondo) se aparearon a las 8 semanas de edad. Fueron alimentados con un chow ad libitum estándar de reproductora y se mantuvieron bajo un ciclo regular de luz-oscuridad de 12:12 h. El día de la entrega se contó como el día 1 posterior al parto (PD1). En PD2 (lactancia temprana) y PD10 (lactancia máxima), se tomaron muestras de leche como se describe a continuación.

1. Montaje de un dispositivo de ordeño

1. Conecte un extremo del tubo de cloruro de polivinilo (PVC) de 5/32" de diámetro interior (ID) a la bomba de vacío y use cinta adhesiva para asegurar el accesorio (etiquetado como a en la Figura 1A).
   NOTA: La bomba de vacío puede sustituirse por cualquier bomba adecuada o por una aspiradora central (a veces llamada "aspiradora doméstica") disponible en el laboratorio.
2. Conecte el otro extremo del tubo de PVC de 5/32'' de diámetro interno al tubo de PVC de 1/8'' de diámetro interno a través de un conector recto de púas.
3. Conecte el otro extremo del tubo de PVC de 1/8" de diámetro interno a una aguja hipodérmica de 18G a través de un conector (etiquetado como b en la Figura 1A).
4. Corte el extremo de la punta de una pipeta P200 ~0,2 cm para crear una abertura más grande. Inserte la punta de la pipeta P200 a través de la abertura del tapón del tabique para que la punta apunte hacia arriba (Figura 1B).
   NOTA: Cambie las puntas de pipeta entre animales.
5. Conecte el tapón del tabique a un tubo colector estéril. Realice una punción a través del tapón del tabique con la aguja hipodérmica de 18 G.
6. Compruebe la presión de succión encendiendo la bomba de vacío y colocando un dedo (cubierto con un guante de laboratorio) contra la abertura de la punta de la pipeta.
   NOTA: Debería sentir una succión suave si está ensamblado correctamente. El tubo colector, la aguja hipodérmica de 18 G y las puntas de pipeta P200 deben ser estériles.

Figura 1: El dispositivo de ordeño. (A) Dispositivo de ordeño con una bomba de vacío conectada a una aguja hipodérmica de 18 G a través de un tubo de PVC. La aguja pasa a través de un tapón de tabique que está conectado a un tubo colector de microcentrífuga. Una punta de pipeta P-200 invertida, que se utiliza para extraer leche de un pezón, se inserta a través de una abertura del tapón del tabique. (B) Diagrama de sección transversal del dispositivo de ordeño. (C) Una madre que se ordeña utilizando el método descrito. (D) Una alícuota representativa (0,3 mL) de leche recolectada de una madre en el pico de lactancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Separación de la presa de las crías

1. El día del ordeño, separe a la madre de sus crías para permitir la acumulación de leche en las glándulas.
2. Mantén a los cachorros calientes en un nido.
3. Permita 2 h de separación si la leche se recolecta durante la lactancia temprana (p. ej., PD2 en este estudio).
4. Espere de 30 a 45 minutos de separación si la leche se recolecta durante el pico de lactancia (p. ej., PD10 en este estudio).

3. Anestesia de la presa

1. Cuando la madre esté lista para ser ordeñada, administre una inyección de solución de ketamina/xilacina (intraperitoneal, i.p.) en un lado de la cavidad peritoneal entre el^4º y^5º par de pezones.
   NOTA: La cantidad de solución anestésica a administrar se calcula por el peso de la presa (80-100 mg/kg de ketamina, 5-12 mg/kg de xilacina, según el protocolo IACUC de la Universidad de Rutgers). Esta dosis sedará a un ratón durante 45-60 minutos, proporcionando tiempo suficiente para la recolección de leche.
2. Confirme la anestesia apretando un pie firmemente, pero sin lesionarlo, para probar la percepción de la sensación y el dolor del animal. La anestesia adecuada no está indicada por ningún tipo de movimiento.
3. Aplique ungüento oftálmico veterinario en los ojos de la madre para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.

4. Recogida de leche

1. Coloque el protector anestesiado en su espalda sobre una superficie sólida de trabajo. Limpie suavemente su área mamaria con una toallita estéril con alcohol para limpiar el área antes del ordeño.
2. Administrar 1-2 unidades de oxitocina (i.p.) entre el^4º y^5º par de pezones en el lado de la cavidad peritoneal que no haya recibido ninguna inyección.
   NOTA: La oxitocina es una molécula pequeña que se puede absorber rápidamente y tiene una vida media corta ^14,15. El ordeño debe comenzar dentro de un minuto después de la inyección.
3. Sostenga la presa frotando suavemente el área del cuello con la mano no dominante.
4. Extraiga manualmente la leche de un pezón apretando el tejido mamario desde la base hasta la punta del pezón hasta que se vea una gota de leche.
5. Encienda el dispositivo de vacío encendiendo el botón de encendido.
6. Comience el ordeño aplicando suavemente la punta de pipeta P200 invertida en un pezón. Use un movimiento suave para ayudar a extraer la leche (Figura 1C).
7. Repita los pasos 4.4 a 4.6 en todos los pezones hasta que se recoja un volumen suficiente de leche.
   NOTA: Durante el ordeño, la leche puede introducirse accidentalmente en la aguja hipodérmica de 18 G o en el tubo de PVC de la línea de vacío. Esto se puede remediar fácilmente cambiando la aguja o el tubo de PVC antes de ordeñar al siguiente animal.

5. Recuperación de la madre después de la recolección de leche

1. Regrese a la madre anestesiada a la jaula con sus cachorros y manténgala caliente. Vigila al animal hasta que recupere la conciencia.
   NOTA: La madre puede negarse a amamantar nuevamente si se le permite despertarse sola en una jaula separada antes de regresar con sus cachorros. Esto es más común cuando la recolección de leche se lleva a cabo durante la lactancia temprana (PD2).
2. Deje que las madres se alejen de sus cachorros para que se recuperen por completo cuando comience a despertar; Este es un comportamiento normal.
   NOTA: Observamos que las madres regresan a sus crías periódicamente y vuelven a amamantar completamente después de unas horas.

6. Análisis de la leche

1. Use un kit comercial de análisis de lactosa (consulte la Tabla de materiales) para medir la lactosa de la leche. Diluir la leche 75x con agua estéril y realizar el ensayo según el protocolo del kit.
2. Medir la grasa láctea utilizando el método de creamatocrita demostrado en otras publicaciones^16,17.
3. Estime la proteína de la leche realizando el ensayo de proteína de Bradford¹⁸ con albúmina sérica bovina como estándar¹⁹. Antes de realizar el ensayo, centrifugar la leche a 4.000 × g durante 15 min a 4 °C. Extraiga el infranadante mediante pipeteo y dilúyalo a 1:10 con agua estéril antes del ensayo.
4. Realizar electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE); Separe 10 μg de proteína en un gel de Bis-Tris prefabricado con 4%-12% según las instrucciones del fabricante. Transfiera las proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y tíñalas con Coomassie Blue R-250.

Resultados

Utilizando esta técnica, hemos muestreado con éxito suficiente leche en diferentes momentos durante una lactancia de 21 días. Consideramos que el día del parto es el día 1 post-parto (PD1), y en este trabajo se muestrearon leche en PD2 (lactancia temprana) y PD10 (lactancia pico), n = 4 cada uno. Obtuvimos cómodamente de 0,1 a 0,5 mL de leche de cada madre (Figura 1D). Para validar este método, medimos la composición bruta de macronutrientes de estas muestras de leche y comparamos las diferencias entre la leche recolectada al principio y la lactancia máxima mediante la prueba t de Student.

Encontramos que la concentración de lactosa en la leche promedió 12,3 ± 0,6 g/L en PD2 y 12,0 ± 0,9 g/L en PD10 (Tabla 1). El porcentaje de grasa láctea fue de 26,0 ± 1,0% y de 33,4 ± 2,5% en PD2 y PD10, respectivamente. La concentración de grasa fue de 174,4 ± 7,1 g/L en PD2 y significativamente mayor, 224,4 ± 17,1 g/L en PD10 (Tabla 1). El contenido promedio de proteína fue de 70,1 ± 5,2 g/L en PD2 y de 75,1 ± 2,6 g/L en PD10 (Tabla 1). Aunque el contenido total de proteína de la leche no fue diferente entre PD2 y PD10, la abundancia relativa de la proteína de la leche individual sí difirió. En concreto, la αS1-caseína y la proteína ácida de suero fueron mayores en la leche PD10 que en la leche PD2 (p < 0,05), mientras que la β-caseína (p < 0,05) mostró mayor abundancia en PD2 que en PD10 (Figura 2).

Figura 2: Análisis de la proteína de la leche. (A) Análisis de PAGE teñido de azul de Coomassie de la leche recolectada en PD2 y PD10. La identificación de proteínas se realizó como se describió anteriormente¹⁴. (B) Las señales de proteínas individuales se analizaron en ImageJ y se normalizaron a la proteína total teñida. Los resultados se expresaron como el promedio con barras de error estándar y puntos de datos individuales como puntos. La abundancia promedio de cada proteína en PD2 y PD10 se comparó mediante una prueba t de Student de dos colas. *p < 0,05, n = 4. Abreviaturas: PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida; PDn = día posterior a la entrega n. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

		Promedio	SEM	Valor p
Lactosa (g/L)	PD2	12.3	0.6	0.75
	PD10	12.0	0.9
Gordo (g/L)	PD2	174.4	7.1	0.04
	PD10	224.4	17.1
Proteína (g/L)	PD2	70.1	5.2	0.42
	PD10	75.1	2.6

Tabla 1: Composición de macronutrientes de la leche recolectada en PD2 y PD10. Los resultados, expresados como el promedio y el error estándar de la media (SEM), se analizaron para examinar los efectos del día de lactancia en la composición de la leche mediante una prueba t de Student de dos colas, n = 4.

Discusión

Demostramos una técnica de ordeño modificada que puede ser realizada por una sola persona utilizando un dispositivo que se puede ensamblar fácilmente y transportar. Tradicionalmente, la leche de roedores se recoge utilizando tubos capilares^10,17, pipetas Pasteur^{de vidrio 12} o micropipetas¹¹. Estos métodos requieren que una persona sujete la madre y extraiga la leche manualmente y otra que la recoja. Esto a veces puede ser un desafío, especialmente cuando el muestreo de leche se realiza durante los fines de semana o días festivos. La leche recolectada por estos métodos debe transferirse a tubos de almacenamiento estériles. Dado que la leche de roedores es relativamente alta en grasa (como se ha demostrado aquí y en otros estudios^20,21) y, por lo tanto, viscosa, el proceso de transferencia de leche probablemente resulte en una pérdida de volumen de leche, lo que limita las cantidades para los análisis. El dispositivo descrito aquí se puede montar en menos de 5 minutos con las herramientas disponibles en el laboratorio. Puede ser utilizado fácilmente por una persona para muestrear un volumen suficiente de leche en 10 minutos. El enfoque de succión suave y continua asociado con este método alivia el problema de la pérdida de muestras debido a la transferencia, ya que la leche se arrastra constantemente directamente a un tubo de recolección. Minimizar la pérdida de muestras es particularmente importante cuando se recolecta leche ya en PD2, ya que se sabe que la producción de leche es relativamente baja en esta etapa¹⁰. Además, se utilizaron el mismo dispositivo y protocolo para recolectar con éxito leche de otra cepa de ratón (FVB/N de fondo), lo que sugiere que este método probablemente funcione igual de bien en todas las cepas de ratones.

En este estudio, también observamos que el tiempo de separación puede diferir dependiendo de la etapa de lactancia. Estudios previos reportan que las madres deben ser separadas de sus crías durante al menos 2 h y hasta 16 h antes de la recolección de leche para obtener un volumen de leche suficiente^11,13. Al emplear este método, encontramos que separar a las madres de sus crías durante 2 h al principio de la lactancia (PD2) y solo durante 30-45 minutos al pico de lactancia (PD10) fue suficiente para obtener un volumen adecuado de leche. Dado que se necesita tiempo adicional para que la madre se recupere de la anestesia, minimizar la duración de la separación no solo reduce el tiempo de muestreo, sino que también disminuye el impacto potencial que puede representar para la madre y sus crías.

Además, descubrimos que la recolección de leche ya en PD2 puede afectar negativamente el crecimiento posterior de las crías debido al largo tiempo de separación y recuperación de la madre, lo que lleva a un período de alimentación insuficiente. Esto no se observó cuando se tomaron muestras de leche en el pico de lactancia (PD10). Por lo tanto, si un investigador está interesado en tomar muestras de leche en diferentes momentos durante el período de lactancia de 21 días, es aconsejable tomar muestras de leche al principio de la lactancia de un conjunto separado de madres. Sin embargo, la recolección de leche se puede realizar en la misma madre varias veces durante la lactancia máxima y tardía para estudios longitudinales.

Alternativamente, los investigadores pueden optar por otros agentes anestésicos para minimizar el tiempo de recuperación de la presa. Por ejemplo, la inhalación de isoflurano puede ayudar a reducir el tiempo de recuperación, ya que los animales suelen recuperarse rápidamente tras la interrupción del isoflurano²². A pesar de que esta elección de anestesia es realizada por muchos^13,23, se ha relatado que la inhalación de isoflurano puede afectar negativamente el volumen de leche recolectada¹³. Además, la inhalación de isoflurano requiere un aparato adecuado para garantizar un control preciso de la dosis. Las investigaciones sobre los efectos de agentes anestésicos como la ketamina/xilacina y el isoflurano sobre la lactancia y la composición de la leche y su posible transferencia a la leche materna son limitadas 24,25,26. Por lo tanto, se recomienda que la interpretación de los datos se realice cuidadosamente cuando se comparen estudios que utilicen diferentes opciones de anestesia. Otra alternativa es la toma de muestras de leche sin anestesia, tal como lo describen otros investigadores 14,27,28,29. Este procedimiento, sin embargo, puede causar un estrés excesivo a la madre y requerir una persona adicional para sujetar al animal.

Este estudio también demostró que los ensayos de macronutrientes podían realizarse utilizando las muestras de leche, y que quedaba un excedente para más procedimientos, como los análisis ómicos. Se midieron los niveles de lactosa, proteínas y grasas de la leche y se compararon con los datos publicados para validar el método descrito. La concentración de lactosa en la leche representó ~1,2% del componente lácteo, que es similar a la de los ratones con una dieta control reportada en otros estudios 30,31,32. Se confirmó que la leche de ratón tenía un alto porcentaje de grasa, que oscilaba entre el 26% y el 33%, como se informó anteriormente^20,30. La concentración total de proteína reportada aquí fue similar a la reportada por Chen et ^al.30, pero menor que la reportada en otros estudios^31,32. En cuanto a los cambios desde el inicio hasta el pico de lactancia, encontramos que los niveles de lactosa y proteínas se mantuvieron relativamente constantes, pero el porcentaje de grasa láctea aumentó desde el principio hasta el pico de lactancia. Esto está en desacuerdo con Ragueneau³², pero la discrepancia puede deberse a diferencias en el tamaño de la muestra. Aunque la concentración total de proteína fue similar entre la lactancia temprana y la lactancia máxima, encontramos que la abundancia de proteína individual (αS1-caseína, β-caseína y proteína ácida de suero) varió, presumiblemente reflejando cambios en las necesidades de los neonatos en diferentes etapas de desarrollo.

Aunque esta técnica no permite cuantificar la producción de leche, ésta puede ser calculada utilizando el índice de rendimiento (PIO) propuesto por Falconer en 1947³³. La producción de leche depende en gran medida del tamaño de la camada y del día de la toma de muestras. Este índice se puede utilizar como una medida de la producción de leche, teniendo en cuenta las diferencias en el tamaño de la camada. Por ejemplo, toda la camada se puede pesar en PD10 (cuando la madre está separada para la toma de muestras de leche). A continuación, se calcula la PIO de una madre dividiendo el peso de su camada por el peso medio de las camadas del mismo tamaño en PD10. En conclusión, demostramos una técnica eficiente de una sola persona para la toma de muestras de leche de ratones de laboratorio utilizando un dispositivo que se puede ensamblar fácilmente con un equipo relativamente barato y fácilmente disponible. Esta técnica permite la recolección consistente de cantidades suficientes de leche para la mayoría de los análisis.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL cryogenic vials	Corning	430658	Preferred for early milk collection
1 mL syringe	Exel	26048
2 mL microcentrifuge collecting tube	Fisher Scientific	02-681-344	Preferred for peak and late milk collection
18 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305195
27 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305109
Alcohol prep wipe	Honeywell	154818
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Immobilon -P PVDF Membrane	Immobilon	IPVH00010
Ketamine	Dechra	1000001250	Purchased via Veternarian Office
Laboratory labeling tape	VWR International	89097
Lactose Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK487
Mini Barbed polypropylene fittings	Cole-Parmer Instrument Company	6365-90
Mouse diet	Lab Diet	5015
NuPAGE Bis-Tris Mini Protein Gels, 4–12%	Invitrogen	NP0335BOX
Optixcare Eye Lube	Aventix	N/A	Purchased via Veternarian Office
Oxytocin	Bimeda	1OXY015	Purchased via Veternarian Office
P200 pipette tips	Gilson	F1733001
PVC tubing: 1/8'' ID	VWR International	MFLX07407-75
PVC tubing: 5/32'' ID	VWR International	MFLX07407-77
Septum stopper	Chemglass Life Sciences	CG-3022-91
Vacuum pump	Drummond Scientific Co.	P-103635
Xylazine	Akorn Animal Health	NDC 59399-110-20	Purchased via Veternarian Office