一种高效的单人实验室小鼠牛奶采样技术

摘要

本文介绍了如何组装可用于收集实验室小鼠乳汁的设备。该设备价格实惠、便携，允许一名训练有素的人员收集 0.1-0.5 mL 的牛奶。还包括详细的挤奶方案。

摘要

自 20 世纪初以来，啮齿动物模型已广泛用于生物学，以研究基本的生理学和生化机制。在哺乳和新生儿发育研究中，需要对牛奶进行取样，以确定牛奶的成分以及实验作如何影响牛奶，从而影响新生儿发育。从小型啮齿动物身上收集足够数量的生物体液可能很困难。几项研究表明可以从小鼠身上获取乳汁的不同技术。但是，这些技术通常需要至少两名训练有素的人员，这在某些情况下可能具有挑战性。

在这里，我们展示了一种基于 2009 年发表的方法的改良牛奶采样技术。使用这种经济实惠且易于组装的方法，一名训练有素的人员可以在不到 10 分钟的时间内从麻醉下的母带中常规获得 0.1-0.5 mL 的牛奶。使用这种方法，我们在分娩后第 2 天 （PD2） 和分娩后第 10 天 （PD10） 收集了足够的牛奶。我们测量了牛奶常量营养素成分，并将它们与现有文献进行比较，以验证我们的采集方法。

我们记录到 PD2 上，牛奶蛋白平均为 70.1 ± 5.2 g/L，乳脂为 174.4 ± 7.1 g/L，乳糖为 12.3 ± 0.6 g/L。在 PD10 上，虽然乳糖和蛋白质的浓度与 PD2 相似，但乳脂显着更高 （224.4 ± 17.1 g/L）。我们还观察到单个牛奶蛋白的相对丰度在 PD2 和 PD10 之间有所不同。更具体地说，与 PD2 相比，PD10 的 αS1-酪蛋白和乳清酸性蛋白较高，而 β-酪蛋白较低。总体而言，我们展示了一种高效的单人技术，使用一种可以轻松与常用实验室设备组装的设备从小鼠中进行牛奶采样。

引言

比较医学是指人类和其他动物在解剖学和生理学上具有相似性的观点;因此，从一个物种学到的信息可用于研究其他物种的相似途径 ^1,2。自 20^世纪初以来，啮齿动物，特别是小鼠和大鼠，由于相对容易的遗传作来开发疾病模型，因此已广泛用于生物医学研究 ^1,2。此外，它们相对较小;因此，与其他非啮齿类哺乳动物模型相比，维持菌落所需的资源更少²。然而，它们的小体型也带来了挑战。某些程序不能在小鼠身上轻松完成。例如，动静脉差异技术可以在大鼠身上进行 ^3,4,5，但在小鼠身上可能具有挑战性，因为它们的小血管很容易破裂 ^6,7。可以从小鼠身上采样的组织量也是有限的。例如，在哺乳小鼠中，内脏脂肪组织的大小显着减少 ^8,9，在某些情况下，几乎无法检测到。此外，小鼠的生物流体采样量也受到限制;根据技术的不同，采样的血液量可能会有所不同，但总是有些限制⁷，从而限制了可以进行的分析次数。

在哺乳期和新生儿发育研究中，需要对牛奶进行取样以评估牛奶成分和产奶量。在小鼠中进行的研究中，由于奶量有限，通常从几个母细胞中汇集样品以产生足够的量¹⁰。许多研究表明，从一只小鼠中收集足够分析体积的乳汁的技术 11,12,13。然而，这些方法通常需要两名训练有素的人员^11,12：一名在手动吸奶时抱着动物，另一名用移液管收集牛奶;或者他们需要实验室中不容易获得的设备和工具。在这里，我们演示了对 DePeters 和 Hovey¹⁴ 设计的技术的修改。该程序中使用的设备可以使用实验室中的设备轻松组装，也可以从普通供应商处轻松购买。使用该设备，一个人通常可以在不到 10 分钟的时间内获得 0.1–0.5 mL 的小鼠乳汁，用于大多数分析。我们在分娩后第 2 天 （PD2，早期泌乳） 和分娩后第 10 天 （PD10，泌乳高峰） 收集牛奶，并测量牛奶常量营养素以验证该方法。

研究方案

所有动物护理和实验程序均遵循联邦指导方针，并获得了罗格斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。雌性小鼠 （C57BL/6 背景） 在 8 周龄时交配。他们随意喂食标准种 鸡食物， 并保持在常规的 12：12 小时光照：黑暗循环下。分娩当天计为分娩后第 1 天 （PD1）。在 PD2（早期泌乳）和 PD10（泌乳高峰）中，如下所述对牛奶进行采样。

1. 挤奶设备的组装

1. 将 5/32 英寸内径 （ID） 聚氯乙烯 （PVC） 管的一端连接到真空泵上，并使用胶带固定附件（在图 1A 中标记为 a）。
   注意：真空泵可以用实验室中任何合适的泵或中央真空（有时称为“室内真空”）代替。
2. 通过倒钩直连接器将 5/32 英寸内径 PVC 管的另一端连接到内径 1/8 英寸 PVC 管上。
3. 通过连接器（图 1A 中标记为 b）将 1/8 英寸 ID PVC 管的另一端连接到 18G 皮下注射针头。
4. 将 P200 移液器吸头的末端切成 ~0.2 cm，以形成更大的开口。将 P200 移液器吸头插入隔垫塞的开口，使吸头朝上（图 1B）。
   注意：在动物之间更换移液器吸头。
5. 将隔垫塞连接到无菌收集管上。用 18 G 皮下注射针刺穿隔膜塞。
6. 打开真空泵，将手指（戴上实验室手套）靠在移液器吸头开口上，检查吸力。
   注意： 如果组装正确，您应该会感觉到轻柔的吸力。收集管、18 G 皮下注射针头和 P200 移液器吸头应该是无菌的。

图 1：挤奶设备。 （A） 带有真空泵的挤奶设备，通过 PVC 管连接到 18 G 皮下注射针头。针头穿过连接到微量离心机收集管的隔膜塞。用于将倒置的 P-200 移液器吸头从奶嘴中吸取乳汁，通过隔膜塞的开口插入。（B） 挤奶设备的横截面图。（C） 使用所述方法挤奶的母猪。（D） 在泌乳高峰期从母猪收集的代表性等分试样 （0.3 mL）。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 母犬与幼崽的分离

1. 在挤奶当天，将母乳与幼崽分开，让乳汁在腺体中积聚。
2. 让幼崽在巢中取暖。
3. 如果在早期泌乳期间收集牛奶（例如，本研究中的 PD2），则允许分离 2 小时。
4. 如果在泌乳高峰期收集牛奶（例如，本研究中的 PD10），则允许 30-45 分钟的分离。

3. 坝的麻醉

1. 当母猪准备好挤奶时，将氯胺酮/甲苯噻嗪溶液（腹膜内，ip）注射到^第 4 对和^第 5 对之间的腹膜腔一侧。
   注：要施用的麻醉溶液的量由坝的重量计算（80-100 mg/kg 氯胺酮，5-12 mg/kg 甲苯噻嗪，根据罗格斯大学 IACUC 方案）。该剂量将使小鼠镇静 45-60 分钟，为收集牛奶提供充足的时间。
2. 通过用力挤压脚来确认麻醉，但不要受伤，以测试动物对感觉和疼痛的感知。没有任何形式的运动表明有足够的麻醉。
3. 将兽用眼药膏涂抹在母带的眼睛上，以防止麻醉时干燥。

4. 牛奶收集

1. 将麻醉的 dam 仰卧在坚固的工作表面上。挤奶前，用无菌酒精制备湿巾轻轻擦拭她的乳房区域，以清洁该区域。
2. 在未接受任何注射的腹膜腔一侧的^第 4 对和^第 5 对之间施用 1-2 单位的催产素 （ip）。
   注意：催产素是一种小分子，可快速吸收，半衰期短 ^14,15。挤奶应在注射后一分钟内开始。
3. 用非惯用手轻轻搓搓她的脖子区域，握住大坝。
4. 通过从底部到尖端挤压乳腺组织，直到看到乳珠，手动挤出乳汁。
5. 通过打开电源按钮打开真空设备。
6. 将倒置的 P200 移液器吸头轻轻涂抹在上，开始挤奶。使用轻柔的拉动动作来帮助吸出牛奶（图 1C）。
7. 对所有奶嘴重复步骤 4.4-4.6，直到收集到足够体积的乳汁。
   注意： 在挤奶过程中，牛奶可能会意外地被吸入真空管路的 18 G 皮下注射针头或 PVC 管中。这可以通过在给下一只动物挤奶之前更换针头或 PVC 管来轻松补救。

5. 收集牛奶后恢复母带

1. 将麻醉的母犬与她的幼崽一起放回笼子里并保持温暖。监测动物，直到她恢复意识。
   注意：如果允许母马在单独的笼子里自己醒来，然后再回到她的幼崽身边，她可能会拒绝再次哺乳。当在泌乳早期 （PD2） 期间收集乳汁时，这种情况更为常见。
2. 当她开始醒来时，让母马从她的幼崽身上移开以完全恢复;这是正常行为。
   注意：我们观察到水坝会定期返回幼崽身边，并在几个小时后完全恢复哺乳。

6. 牛奶分析

1. 使用市售乳糖检测试剂盒（参见 材料表）测量牛奶乳糖。用无菌水将牛奶稀释 75 倍，并根据试剂盒方案进行检测。
2. 使用其他出版物中演示的 creamatocrit 方法测量乳脂^16,17。
3. 通过以牛血清白蛋白为标准¹⁹ 进行 Bradford 蛋白测定¹⁸ 来估计牛奶蛋白。在进行测定之前，将牛奶在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 15 分钟。 通过移液提取基钠，并在测定前用无菌水将其稀释至 1：10。
4. 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）;按照制造商的说明，在预制的 4%–12% Bis-Tris 凝胶上分离 10 μg 蛋白质。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯 （PVDF） 膜上，并用考马斯蓝 R-250 染色。

结果

使用这种技术，我们成功地在 21 天的哺乳期的不同时间采样了足够的牛奶。我们认为分娩日是分娩后第 1 天 （PD1），在这项工作中，我们对 PD2（早期泌乳）和 PD10（泌乳高峰）进行了牛奶采样，n = 4。我们轻松地从每头母牛那里获得了 0.1-0.5 mL 的牛奶（图 1D）。为了验证这种方法，我们测量了这些牛奶样品的总常量营养素组成，并使用学生 t 检验比较了泌乳早期和高峰期收集的牛奶之间的差异。

我们发现 ，PD2 的牛奶乳糖 浓度平均为 12.3 ± 0.6 g/L，PD10 的平均浓度为 12.0 ± 0.9 g/L（表 1）。PD2 和 PD10 的 乳脂 百分比分别为 26.0 ± 1.0% 和 33.4 ± 2.5%。PD2 的脂肪浓度为 174.4 ± 7.1 g/L，PD10 的脂肪浓度为 224.4 ± 17.1 g/L（表 1）。PD2 的平均蛋白质含量为 70.1 ± 5.2 g/L，PD10 的平均 蛋白质 含量为 75.1 ± 2.6 g/L（表 1）。虽然 PD2 和 PD10 之间的总乳蛋白含量没有差异，但单个乳蛋白的相对丰度确实不同。具体来说，PD10 牛奶中的 αS1-酪蛋白和乳清酸性蛋白高于 PD2 牛奶 （p < 0.05），而 β-酪蛋白 （p < 0.05） 在 PD2 中的丰度高于 PD10（图 2）。

图 2：牛奶蛋白分析。 （A） 在 PD2 和 PD10 处收集的牛奶的考马斯蓝染色 PAGE 分析。如前所述进行蛋白质鉴定¹⁴.（B） 在 ImageJ 中分析单个蛋白质信号并归一化为染色的总蛋白。结果表示为带有标准误差线的平均值，单个数据点表示为点。使用双尾 Student's t 检验比较 PD2 和 PD10 上每种蛋白质的平均丰度。*p < 0.05，n = 4。缩写：PAGE = 聚丙烯酰胺凝胶电泳;PDn = 交货后第 n 天。 请点击此处查看此图的较大版本。

		平均	SEM 扫描	p 值
乳糖 （克/升）	PD2	12.3	0.6	0.75
	PD10	12.0	0.9
脂肪 （克/升）	PD2	174.4	7.1	0.04
	PD10	224.4	17.1
蛋白 （克/升）	PD2	70.1	5.2	0.42
	PD10	75.1	2.6

表 1：在 PD2 和 PD10 处采集的牛奶的常量营养素组成。 结果表示为平均值的平均和标准误差 （SEM），使用双尾学生 t 检验 n = 4 检查泌乳日对牛奶成分的影响。

讨论

我们展示了一种改良的挤奶技术，该技术可以由一个人使用易于组装和携带的设备进行。传统上，使用毛细管^10,17、玻璃巴斯德移液器 12 或微量移液器¹¹ 收集啮齿动物奶。这些方法需要一个人约束母带并手动挤出牛奶，另一个人收集牛奶。这有时可能具有挑战性，尤其是在周末或节假日进行牛奶采样时。通过这些方法收集的牛奶必须转移到无菌储存管中。由于啮齿动物的脂肪含量相对较高（如此处和其他研究所示^20,21），因此具有粘性，因此转移牛奶的过程可能会导致牛奶量损失，从而限制了分析量。此处描述的设备可以使用实验室提供的工具在 5 分钟内组装完成。一个人可以轻松使用它，在 10 分钟内对足够的牛奶量进行采样。与该方法相关的连续温和抽吸方法减轻了因转移而造成的样品损失问题，因为牛奶不断被直接吸入收集管。当早在 PD2 阶段采集牛奶时，最大限度地减少样品损失尤为重要，因为已知此阶段的牛奶产量相对较低¹⁰。此外，使用相同的设备和方案成功从另一种小鼠品系（FVB/N 背景）收集牛奶，这表明这种方法在小鼠品系中可能同样有效。

在这项研究中，我们还观察到分离时间可能因泌乳阶段而异。先前的研究报告说，在收集牛奶之前，母鼠应与幼崽分离至少 2 小时至 16 小时，以获得足够的牛奶量^11,13。当采用这种方法时，我们发现在泌乳早期 （PD2） 将母猪与幼崽分离 2 小时，在泌乳高峰期 （PD10） 仅 30-45 分钟就足以获得足够的乳汁量。由于母鼠从麻醉中恢复需要额外的时间，因此最大限度地减少分离时间不仅可以减少采样时间，还可以减少它可能对母鼠及其幼崽构成的潜在影响。

此外，我们发现，由于母体分离和恢复时间长，早在 PD2 就收集牛奶可能会对幼崽的后续生长产生负面影响，从而导致一段时间的喂养不足。在泌乳高峰期 （PD10） 对牛奶进行采样时未观察到这种情况。因此，如果研究者有兴趣在 21 天哺乳期的不同时间点对牛奶进行采样，建议从一组单独的母乳中对早期泌乳乳进行采样。然而，在泌乳高峰期和晚期，可以在同一母乳上多次进行牛奶收集，以进行纵向研究。

或者，研究人员可以选择其他麻醉剂来最大限度地减少坝的恢复时间。例如，吸入异氟醚可能有助于缩短恢复时间，因为动物通常在停用异氟醚²² 后恢复迅速。尽管许多人都进行了这种麻醉选择^13,23，^但据报道，异氟醚吸入可能会对收集的乳汁量产生负面影响¹³。此外，异氟醚吸入需要适当的设备来确保精确控制剂量。关于氯胺酮/甲苯噻嗪和异氟醚等麻醉剂对泌乳和乳汁成分及其转移到母乳中的可能性的影响的研究有限 24,25,26。因此，建议在比较使用不同麻醉选择的研究时应仔细进行数据解释。另一种选择是在没有麻醉的情况下对牛奶进行采样，正如其他研究人员所描述的那样 14,27,28,29。然而，此过程可能会对母鼠造成过大的压力，并且需要额外的人来约束动物。

这项研究还表明，可以使用牛奶样品进行宏量营养素测定，剩余用于组学分析等更多程序。测量牛奶乳糖、蛋白质和脂肪水平，并与已发表的数据进行比较，以验证所描述的方法。牛奶乳糖浓度占牛奶成分的 ~1.2%，这与其他研究中报道的对照饮食小鼠的浓度相似 30,31,32。小鼠乳被证实脂肪含量高，从 26% 到 33% 不等，如前所述^20,30%。此处报告的总蛋白质浓度与 Chen 等人报告的总蛋白质浓度相似³⁰，但低于其他研究中报告的总蛋白质浓度^31,32。就从泌乳早期到泌乳高峰的变化而言，我们发现乳糖和蛋白质水平保持相对恒定，但乳脂百分比从泌乳早期到泌乳高峰增加。这与 Ragueneau³² 不一致，但差异可能是由于样本量的差异。尽管早期和高峰期的总蛋白浓度相似，但我们发现单个蛋白质丰度 （αS1-酪蛋白、β-酪蛋白和乳清酸性蛋白） 各不相同，可能反映了新生儿在不同发育阶段的需求变化。

虽然这种技术不允许量化产奶量，但这可以使用 Falconer 在 1947 年提出的性能指数 （IOP） 进行计算³³。产奶量在很大程度上取决于窝产仔数和采样日期。该指数可用作衡量产奶量的指标，并考虑窝产仔数差异。例如，可以在 PD10 上对整个窝产仔猪进行称重（当母猪分开进行牛奶采样时）。然后通过将母猪的幼崽重量除以 PD10 上相同大小的幼崽的平均重量来计算母猪的 IOP。总之，我们展示了一种高效的单人技术，用于从实验室小鼠中进行牛奶采样，该技术使用一种设备，该设备可以很容易地与相对便宜且容易获得的设备组装在一起。该技术可以始终如一地收集足够量的牛奶以进行大多数分析。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL cryogenic vials	Corning	430658	Preferred for early milk collection
1 mL syringe	Exel	26048
2 mL microcentrifuge collecting tube	Fisher Scientific	02-681-344	Preferred for peak and late milk collection
18 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305195
27 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305109
Alcohol prep wipe	Honeywell	154818
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Immobilon -P PVDF Membrane	Immobilon	IPVH00010
Ketamine	Dechra	1000001250	Purchased via Veternarian Office
Laboratory labeling tape	VWR International	89097
Lactose Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK487
Mini Barbed polypropylene fittings	Cole-Parmer Instrument Company	6365-90
Mouse diet	Lab Diet	5015
NuPAGE Bis-Tris Mini Protein Gels, 4–12%	Invitrogen	NP0335BOX
Optixcare Eye Lube	Aventix	N/A	Purchased via Veternarian Office
Oxytocin	Bimeda	1OXY015	Purchased via Veternarian Office
P200 pipette tips	Gilson	F1733001
PVC tubing: 1/8'' ID	VWR International	MFLX07407-75
PVC tubing: 5/32'' ID	VWR International	MFLX07407-77
Septum stopper	Chemglass Life Sciences	CG-3022-91
Vacuum pump	Drummond Scientific Co.	P-103635
Xylazine	Akorn Animal Health	NDC 59399-110-20	Purchased via Veternarian Office