Un'efficiente tecnica per una sola persona per il campionamento del latte da topi da laboratorio

Riepilogo

Questo articolo descrive come assemblare un dispositivo che può essere utilizzato per raccogliere il latte dai topi da laboratorio. Questo dispositivo è economico, portatile e consente la raccolta di 0,1-0,5 ml di latte da parte di una persona addestrata. È incluso anche un protocollo di mungitura dettagliato.

Abstract

I modelli di roditori sono stati ampiamente utilizzati in biologia dall'inizio del XX secolo per studiare la fisiologia di base e i meccanismi biochimici. Nella ricerca sull'allattamento e sullo sviluppo neonatale, è necessario campionare il latte per determinare la composizione e il modo in cui il latte può essere influenzato da manipolazioni sperimentali, influenzando così lo sviluppo del neonato. Raccogliere biofluidi in quantità sufficienti da piccoli roditori può essere difficile. Diversi studi hanno dimostrato diverse tecniche per ottenere il latte dai topi. Tuttavia, queste tecniche spesso richiedono almeno due persone addestrate, il che può essere difficile in alcuni casi.

Qui, dimostriamo una tecnica di campionamento del latte modificata basata su un metodo pubblicato nel 2009. Con questo metodo economico e facile da assemblare, una persona addestrata può ottenere regolarmente 0,1-0,5 ml di latte da una madre sotto anestesia in meno di 10 minuti. Utilizzando questo metodo, abbiamo raccolto latte a sufficienza il giorno 2 (PD2) e il giorno 10 (PD10) dopo la consegna. Abbiamo misurato i componenti dei macronutrienti del latte e li abbiamo confrontati con la letteratura esistente per convalidare il nostro metodo di raccolta.

Abbiamo registrato che con PD2, le proteine del latte erano in media di 70,1 ± 5,2 g/L, il grasso del latte era di 174,4 ± 7,1 g/L e il lattosio del latte era di 12,3 ± 0,6 g/L. Con PD10, mentre il lattosio e le proteine del latte sono rimasti a concentrazioni simili a quelle di PD2, il grasso del latte era significativamente più alto (224,4 ± 17,1 g/L). Abbiamo anche osservato che l'abbondanza relativa delle singole proteine del latte variava tra PD2 e PD10. Più specificamente, l'αS1-caseina e la proteina acida del siero di latte erano più elevate, mentre la β-caseina era più bassa a PD10 rispetto a PD2. Nel complesso, dimostriamo un'efficiente tecnica per una sola persona per il campionamento del latte dai topi utilizzando un dispositivo che può essere facilmente assemblato con apparecchiature di laboratorio di uso comune.

Introduzione

La medicina comparata si riferisce all'idea che gli esseri umani e altri animali condividano somiglianze in anatomia e fisiologia; Pertanto, le informazioni apprese da una specie possono essere utilizzate per studiare percorsi simili nell'altra ^1,2. Dall'inizio del XX^secolo, i roditori, in particolare topi e ratti, sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca biomedica a causa della manipolazione genetica relativamente facile per lo sviluppo di modelli di malattia ^1,2. Inoltre, sono relativamente piccoli; Pertanto, sono necessarie meno risorse per mantenere le colonie rispetto ad altri modelli di mammiferi non roditori². Tuttavia, le loro piccole dimensioni corporee comportano anche delle sfide. Alcune procedure non possono essere eseguite facilmente sui topi. Ad esempio, la tecnica della differenza arterovenosa può essere eseguita sui ratti ^3,4,5, ma può essere difficile nei topi poiché i loro piccoli vasi sanguigni possono facilmente rompersi ^6,7. Anche la quantità di tessuto che può essere campionata da un topo è limitata. Ad esempio, nei topi in allattamento, il tessuto adiposo viscerale diminuisce significativamente di dimensioni ^8,9 e, in alcuni casi, fino a quantità quasi impercettibili. Inoltre, anche il campionamento del biofluido dai topi è limitato in quantità; A seconda della tecnica, il volume di sangue prelevato può variare, ma è sempre un po' limitato⁷, limitando il numero di analisi che possono essere eseguite.

Nella ricerca sull'allattamento e sullo sviluppo neonatale, è necessario campionare il latte per valutare la composizione e la produzione di latte. Negli studi condotti sui topi, a causa del volume limitato di latte, i campioni vengono spesso raccolti da diverse madri per produrre una quantità adeguata¹⁰. Numerosi studi dimostrano tecniche per la raccolta di volumi analitici sufficienti di latte da un singolo topo 11,12,13. Questi metodi, tuttavia, di solito richiedono due persone addestrate^11,12: una per tenere l'animale durante l'estrazione manuale del latte e una per raccogliere il latte con una pipetta; oppure richiedono attrezzature e strumenti che non sono prontamente disponibili in un laboratorio. Qui, dimostriamo una modifica di una tecnica ideata da DePeters e Hovey¹⁴. Il dispositivo utilizzato in questa procedura può essere facilmente assemblato con le apparecchiature disponibili in laboratorio o facilmente acquistabile dai comuni fornitori. Utilizzando questo dispositivo, una persona può ottenere regolarmente 0,1-0,5 ml di latte di topo in meno di 10 minuti da utilizzare per la maggior parte delle analisi. Abbiamo raccolto il latte il giorno 2 post-parto (PD2, lattazione precoce) e il giorno 10 post-parto (PD10, picco di lattazione) e misurato i macronutrienti del latte per convalidare il metodo.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali e di cura degli animali hanno seguito le linee guida federali e hanno ricevuto l'approvazione dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Rutgers University. I topi femmina (C57BL/6 background) sono stati accoppiati a 8 settimane di età. Sono stati alimentati con un chow standard da riproduttore ad libitum e tenuti sotto un ciclo regolare di 12:12 ore luce/buio. Il giorno di consegna è stato conteggiato come giorno 1 post-consegna (PD1). Su PD2 (lattazione precoce) e PD10 (picco di lattazione), il latte è stato campionato come descritto di seguito.

1. Montaggio di un dispositivo di mungitura

1. Collegare un'estremità del tubo in cloruro di polivinile (PVC) da 5/32'' di diametro interno (ID) alla pompa del vuoto e utilizzare del nastro adesivo per fissare l'attacco (etichettato a nella Figura 1A).
   NOTA: La pompa per vuoto può essere sostituita con qualsiasi pompa adatta o con un vuoto centralizzato (a volte chiamato "vuoto domestico") disponibile in laboratorio.
2. Collegare l'altra estremità del tubo in PVC ID da 5/32'' al tubo in PVC ID da 1/8'' tramite un connettore diritto spinato.
3. Collegare l'altra estremità del tubo in PVC da 1/8'' ID a un ago ipodermico da 18G tramite un connettore (etichettato b nella Figura 1A).
4. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta P200 ~0,2 cm per creare un'apertura più ampia. Inserire il puntale della pipetta P200 attraverso l'apertura del tappo del setto in modo che il puntale sia rivolto verso l'alto (Figura 1B).
   NOTA: Sostituire i puntali delle pipette tra un animale e l'altro.
5. Collegare il tappo del setto a un tubo di raccolta sterile. Praticare una puntura attraverso il tappo del setto con l'ago ipodermico da 18 G.
6. Controllare la pressione di aspirazione accendendo la pompa del vuoto e posizionando un dito (coperto da un guanto da laboratorio) contro l'apertura del puntale della pipetta.
   NOTA: Dovresti sentire una leggera aspirazione se è assemblato correttamente. Il tubo di raccolta, l'ago ipodermico da 18 G e i puntali delle pipette P200 devono essere sterili.

Figura 1: Il dispositivo di mungitura. (A) Dispositivo di mungitura con pompa a vuoto collegata a un ago ipodermico da 18 G tramite un tubo in PVC. L'ago passa attraverso un tappo del setto che è attaccato a una provetta di raccolta per microcentrifuga. Un puntale per pipetta P-200 rovesciato, utilizzato per prelevare il latte da una tettarella, viene inserito attraverso un'apertura del tappo del setto. (B) Schema della sezione trasversale del dispositivo di mungitura. (C) Una madre che viene munta utilizzando il metodo descritto. (D) Un'aliquota rappresentativa (0,3 ml) di latte raccolto da una madre al picco della lattazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Separazione della madre dai cuccioli

1. Il giorno della mungitura, separare la madre dai suoi cuccioli per consentire l'accumulo di latte nelle ghiandole.
2. Tieni i cuccioli al caldo in un nido.
3. Consentire 2 ore di separazione se il latte viene raccolto durante l'inizio della lattazione (ad esempio, PD2 in questo studio).
4. Consentire 30-45 minuti di separazione se il latte viene raccolto durante il picco di lattazione (ad esempio, PD10 in questo studio).

3. Anestesia della diga

1. Quando la madre è pronta per essere munta, somministrare un'iniezione di soluzione di ketamina/xilazina (intraperitoneale, i.p.) in un lato della cavità peritoneale tra il 4^{° e il} 5^{° paio di} capezzoli.
   NOTA: La quantità di soluzione anestetica da somministrare è calcolata in base al peso della madre (80-100 mg/kg di ketamina, 5-12 mg/kg di xilazina, secondo il protocollo IACUC della Rutgers University). Questa dose sederà un topo per 45-60 minuti, fornendo ampio tempo per la raccolta del latte.
2. Confermare l'anestesia stringendo con forza un piede, ma senza ferirlo, per testare la percezione della sensazione e del dolore dell'animale. Un'anestesia adeguata è indicata dall'assenza di movimenti di alcun tipo.
3. Applicare un unguento oftalmico veterinario sugli occhi della diga per prevenire la secchezza durante l'anestesia.

4. Raccolta del latte

1. Posizionare la madre anestetizzata sulla schiena su una superficie di lavoro solida. Pulisci delicatamente la sua zona mammaria con una salvietta sterile per la preparazione dell'alcol per pulire l'area prima della mungitura.
2. Somministrare 1-2 unità di ossitocina (i.p.) tra il 4^{° e il} 5^° paio di capezzoli sul lato della cavità peritoneale che non ha ricevuto alcuna iniezione.
   NOTA: L'ossitocina è una piccola molecola che può essere assorbita rapidamente e ha una breve emivita ^14,15. La mungitura dovrebbe iniziare entro un minuto dall'iniezione.
3. Tieni la diga strofinando delicatamente la zona del collo con la mano non dominante.
4. Estrarre manualmente il latte da una tettarella schiacciando il tessuto mammario dalla base alla punta della tettarella fino a quando non è visibile una goccia di latte.
5. Accendere il dispositivo di aspirazione accendendo il pulsante di accensione.
6. Iniziare la mungitura applicando delicatamente il puntale della pipetta P200 rovesciato su un capezzolo. Utilizzare un leggero movimento di trazione per estrarre il latte (Figura 1C).
7. Ripetere i passaggi 4.4-4.6 su tutti i capezzoli fino a quando non viene raccolto un volume sufficiente di latte.
   NOTA: Durante la mungitura, il latte può essere aspirato accidentalmente nell'ago ipodermico da 18 g o nel tubo in PVC della linea del vuoto. Questo può essere facilmente rimediato cambiando l'ago o il tubo in PVC prima di mungere l'animale successivo.

5. Recupero della diga dopo la raccolta del latte

1. Rimetti la madre anestetizzata nella gabbia con i suoi cuccioli e tienila al caldo. Monitora l'animale fino a quando non riprende conoscenza.
   NOTA: La madre può rifiutarsi di allattare di nuovo se le viene permesso di svegliarsi da sola in una gabbia separata prima di tornare dai suoi cuccioli. Questo è più comune quando la raccolta del latte avviene durante l'inizio della lattazione (PD2).
2. Lascia che le madri si allontanino dai suoi cuccioli per riprendersi completamente quando inizia a svegliarsi; Questo è un comportamento normale.
   NOTA: Osserviamo che le madri tornano periodicamente dai loro cuccioli e tornano ad allattare completamente dopo poche ore.

6. Analisi del latte

1. Utilizzare un kit per il dosaggio del lattosio in commercio (vedere la Tabella dei materiali) per misurare il lattosio del latte. Diluire il latte 75x con acqua sterile ed eseguire il test secondo il protocollo del kit.
2. Misurare il grasso del latte utilizzando il metodo del creamatocrit dimostrato in altre pubblicazioni ^16,17.
3. Stimare le proteine del latte eseguendo il test proteico di Bradford¹⁸ con albumina sierica bovina come standard¹⁹. Prima di eseguire il test, centrifugare il latte a 4.000 × g per 15 minuti a 4 °C. Estrarre l'infranatante mediante pipettaggio e diluirlo a 1:10 con acqua sterile prima del test.
4. Eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE); separare 10 μg di proteine su un gel prefabbricato al 4%-12% di Bis-Tris come indicato dal produttore. Trasferire le proteine su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) e colorarle con Coomassie Blue R-250.

Risultati

Utilizzando questa tecnica, abbiamo campionato con successo una quantità sufficiente di latte in momenti diversi durante una lattazione di 21 giorni. Consideriamo il giorno del parto come il giorno 1 post-parto (PD1) e, in questo lavoro, abbiamo campionato il latte su PD2 (lattazione precoce) e PD10 (picco di lattazione), n = 4 ciascuno. Abbiamo ottenuto comodamente 0,1-0,5 ml di latte da ciascuna diga (Figura 1D). Per convalidare questo metodo, abbiamo misurato la composizione macronutritiva lorda di questi campioni di latte e confrontato le differenze tra il latte raccolto all'inizio e il picco di lattazione utilizzando il t-test di Student.

Abbiamo scoperto che la concentrazione di lattosio nel latte era in media di 12,3 ± 0,6 g/L su PD2 e 12,0 ± 0,9 g/L su PD10 (Tabella 1). La percentuale di grasso del latte è stata del 26,0 ± dell'1,0% e del 33,4 ± del 2,5% rispettivamente su PD2 e PD10. La concentrazione di grassi era di 174,4 ± 7,1 g/L su PD2 e significativamente più alta, 224,4 ± 17,1 g/L su PD10 (Tabella 1). Il contenuto proteico medio è stato di 70,1 ± 5,2 g/L su PD2 e 75,1 ± 2,6 g/L su PD10 (Tabella 1). Sebbene il contenuto totale di proteine del latte non fosse diverso tra PD2 e PD10, l'abbondanza relativa delle singole proteine del latte differiva. In particolare, l'αS1-caseina e le proteine acide del siero di latte erano più elevate nel latte PD10 rispetto al latte PD2 (p < 0,05), mentre la β-caseina (p < 0,05) ha mostrato una maggiore abbondanza in PD2 rispetto a PD10 (Figura 2).

Figura 2: Analisi delle proteine del latte. (A) Analisi PAGE di Coomassie Blue-stained del latte raccolto a PD2 e PD10. L'identificazione delle proteine è stata effettuata come descritto in precedenza¹⁴. (B) I singoli segnali proteici sono stati analizzati in ImageJ e normalizzati alla proteina totale colorata. I risultati sono stati espressi come media con barre di errore standard e singoli punti dati come punti. L'abbondanza media di ciascuna proteina su PD2 e PD10 è stata confrontata utilizzando un test t di Student a due code. *p < 0,05, n = 4. Abbreviazioni: PAGE = elettroforesi su gel di poliacrilammide; PDn = giorno post-consegna n. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

		Nella media	SEM	Valore p
Lattosio (g/L)	PD2	12.3	0.6	0.75
	PD10	12.0	0.9
Grasso (g/L)	PD2	174.4	7.1	0.04
	PD10	224.4	17.1
Proteina (g/L)	PD2	70.1	5.2	0.42
	PD10	75.1	2.6

Tabella 1: Composizione dei macronutrienti del latte raccolto a PD2 e PD10. I risultati, espressi come errore medio e standard della media (SEM), sono stati analizzati per esaminare gli effetti del giorno della lattazione sulla composizione del latte utilizzando un test t di Student a due code, n = 4.

Discussione

Abbiamo dimostrato una tecnica di mungitura modificata che può essere eseguita da una sola persona utilizzando un dispositivo che può essere facilmente assemblato e portatile. Tradizionalmente, il latte di roditore viene raccolto utilizzando tubi capillari^10,17, pipette Pasteur in vetro¹² o micropipette¹¹. Questi metodi richiedono che una persona trattenga la diga ed estragga manualmente il latte e un'altra raccogli il latte. Questo a volte può essere impegnativo, soprattutto quando il campionamento del latte avviene durante i fine settimana o le vacanze. Il latte raccolto con questi metodi deve essere trasferito in tubi sterili. Poiché il latte di roditore è relativamente ricco di grassi (come mostrato qui e in altri studi^20,21), e quindi viscoso, il processo di trasferimento del latte probabilmente provoca una perdita di volume di latte, limitando le quantità per le analisi. Il dispositivo qui descritto può essere assemblato in meno di 5 minuti con gli strumenti disponibili in laboratorio. Può essere facilmente utilizzato da una sola persona per campionare un volume di latte sufficiente entro 10 minuti. L'approccio di aspirazione continua e delicata associato a questo metodo allevia il problema della perdita di campione dovuta al trasferimento, poiché il latte viene costantemente aspirato direttamente in un tubo di raccolta. Ridurre al minimo la perdita di campione è particolarmente importante quando si raccoglie il latte già a partire da PD2, poiché è noto che la produzione di latte è relativamente bassa in questa fase¹⁰. Inoltre, lo stesso dispositivo e lo stesso protocollo sono stati utilizzati per raccogliere con successo il latte da un altro ceppo di topo (sfondo FVB/N), suggerendo che questo metodo probabilmente funziona altrettanto bene tra i ceppi di topo.

In questo studio, abbiamo anche osservato che il tempo di separazione può variare a seconda dello stadio della lattazione. Studi precedenti riportano che le madri dovrebbero essere separate dai loro cuccioli per almeno 2 ore e fino a 16 ore prima della raccolta del latte per ottenere un volume di latte sufficiente ^11,13. Quando abbiamo impiegato questo metodo, abbiamo scoperto che separare le madri dai loro cuccioli per 2 ore all'inizio della lattazione (PD2) e per soli 30-45 minuti al picco di lattazione (PD10) era sufficiente per ottenere un volume adeguato di latte. Poiché la madre impiega più tempo per riprendersi dall'anestesia, ridurre al minimo la durata della separazione non solo riduce il tempo di campionamento, ma riduce anche il potenziale impatto che può avere sulla madre e sui suoi cuccioli.

Inoltre, abbiamo scoperto che la raccolta del latte già a partire da PD2 può influire negativamente sulla successiva crescita dei cuccioli a causa del lungo tempo di separazione e recupero della madre, portando a un periodo di alimentazione insufficiente. Questo non è stato osservato quando il latte è stato campionato al picco di lattazione (PD10). Pertanto, se un ricercatore è interessato a campionare il latte in diversi momenti durante il periodo di lattazione di 21 giorni, è consigliabile campionare il latte all'inizio della lattazione da una serie separata di madri. La raccolta del latte, tuttavia, può essere eseguita sulla stessa madre più volte durante il picco e la tarda lattazione per gli studi longitudinali.

In alternativa, i ricercatori possono optare per altri agenti anestetici per ridurre al minimo i tempi di recupero della diga. Ad esempio, l'inalazione di isoflurano può aiutare a ridurre il tempo di recupero poiché gli animali in genere si riprendono rapidamente dopo l'interruzione dell'isoflurano²². Sebbene questa scelta di anestesia sia eseguita da molti^13,23, è stato riportato che l'inalazione di isoflurano può influire negativamente sul volume di latte raccolto¹³. Inoltre, l'inalazione di isoflurano richiede un apparato appropriato per garantire un controllo preciso del dosaggio. La ricerca sugli effetti di agenti anestetici come ketamina/xilazina e isoflurano sulla lattazione e sulla composizione del latte e il loro potenziale trasferimento al latte materno è limitata 24,25,26. Si consiglia, pertanto, di eseguire attentamente l'interpretazione dei dati quando si confrontano studi che utilizzano diverse scelte di anestesia. Un'altra alternativa è quella di campionare il latte senza anestesia, come descritto da altri ricercatori 14,27,28,29. Questa procedura, tuttavia, può potenzialmente causare uno stress eccessivo alla diga e richiedere una persona in più per trattenere l'animale.

Questo studio ha anche dimostrato che i saggi dei macronutrienti possono essere eseguiti utilizzando i campioni di latte, con un surplus rimanente per ulteriori procedure come le analisi omiche. I livelli di lattosio, proteine e grassi del latte sono stati misurati e confrontati con i dati pubblicati per convalidare il metodo descritto. La concentrazione di lattosio nel latte rappresentava ~ 1,2% del componente del latte, che è simile a quella dei topi con una dieta di controllo riportata in altri studi 30,31,32. È stato confermato che il latte di topo ha un'alta percentuale di grassi, che va dal 26% al 33%, come riportato in precedenza^20,30. La concentrazione proteica totale qui riportata era simile a quella riportata da Chen et ^al.30 ma inferiore a quella riportata in altri studi^31,32. In termini di cambiamenti dall'inizio al picco di lattazione, abbiamo scoperto che i livelli di lattosio e proteine sono rimasti relativamente costanti, ma la percentuale di grasso del latte è aumentata dall'inizio al picco della lattazione. Questo è in disaccordo con Ragueneau³², ma la discrepanza potrebbe essere dovuta a differenze nella dimensione del campione. Sebbene la concentrazione proteica totale fosse simile tra l'inizio e il picco di lattazione, abbiamo scoperto che l'abbondanza proteica individuale (αS1-caseina, β-caseina e proteina acida del siero di latte) variava, presumibilmente riflettendo i cambiamenti nelle esigenze dei neonati in diversi stadi di sviluppo.

Sebbene questa tecnica non consenta la quantificazione della produzione di latte, questa può essere calcolata utilizzando l'indice di prestazione (IOP) proposto da Falconer nel 1947³³. La produzione di latte dipende in gran parte dalle dimensioni della figliata e dal giorno del campionamento. Questo indice può essere utilizzato come misura della produzione di latte tenendo conto delle differenze di dimensioni della figliata. Ad esempio, l'intera figliata può essere pesata su PD10 (quando la madre viene separata per il campionamento del latte). La IOP di una madre viene quindi calcolata dividendo il peso della sua cucciolata per il peso medio delle cucciolate della stessa dimensione su PD10. In conclusione, dimostriamo un'efficiente tecnica per una sola persona per il campionamento del latte da topi da laboratorio utilizzando un dispositivo che può essere facilmente assemblato con attrezzature relativamente economiche e prontamente disponibili. Questa tecnica consente di raccogliere in modo coerente quantità sufficienti di latte per la maggior parte delle analisi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL cryogenic vials	Corning	430658	Preferred for early milk collection
1 mL syringe	Exel	26048
2 mL microcentrifuge collecting tube	Fisher Scientific	02-681-344	Preferred for peak and late milk collection
18 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305195
27 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305109
Alcohol prep wipe	Honeywell	154818
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Immobilon -P PVDF Membrane	Immobilon	IPVH00010
Ketamine	Dechra	1000001250	Purchased via Veternarian Office
Laboratory labeling tape	VWR International	89097
Lactose Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK487
Mini Barbed polypropylene fittings	Cole-Parmer Instrument Company	6365-90
Mouse diet	Lab Diet	5015
NuPAGE Bis-Tris Mini Protein Gels, 4–12%	Invitrogen	NP0335BOX
Optixcare Eye Lube	Aventix	N/A	Purchased via Veternarian Office
Oxytocin	Bimeda	1OXY015	Purchased via Veternarian Office
P200 pipette tips	Gilson	F1733001
PVC tubing: 1/8'' ID	VWR International	MFLX07407-75
PVC tubing: 5/32'' ID	VWR International	MFLX07407-77
Septum stopper	Chemglass Life Sciences	CG-3022-91
Vacuum pump	Drummond Scientific Co.	P-103635
Xylazine	Akorn Animal Health	NDC 59399-110-20	Purchased via Veternarian Office