Uma técnica eficiente de uma única pessoa para amostragem de leite de camundongos de laboratório

Resumo

Este artigo descreve como montar um dispositivo que pode ser usado para coletar leite de ratos de laboratório. Este dispositivo é acessível, portátil e permite a coleta de 0,1 a 0,5 mL de leite por uma pessoa treinada. Um protocolo de ordenha detalhado também está incluído.

Resumo

Modelos de roedores têm sido amplamente utilizados em biologia desde o início do século 20 para estudar fisiologia básica e mecanismos bioquímicos. Na pesquisa de lactação e desenvolvimento neonatal, há a necessidade de amostrar o leite para determinar a composição e como o leite pode ser afetado por manipulações experimentais, impactando assim o desenvolvimento do recém-nascido. Coletar biofluidos em quantidades suficientes de pequenos roedores pode ser difícil. Vários estudos demonstraram diferentes técnicas para obter leite de camundongos. No entanto, essas técnicas geralmente exigem pelo menos dois funcionários treinados, o que pode ser desafiador em alguns casos.

Aqui, demonstramos uma técnica de amostragem de leite modificada com base em um método publicado em 2009. Com este método acessível e fácil de montar, uma pessoa treinada pode obter rotineiramente 0,1 a 0,5 mL de leite de uma barragem sob anestesia em menos de 10 minutos. Usando esse método, coletamos leite suficiente no dia 2 pós-parto (PD2) e no dia 10 pós-parto (PD10). Medimos os componentes dos macronutrientes do leite e os comparamos com a literatura existente para validar nosso método de coleta.

Registramos que, no PD2, a proteína do leite foi em média de 70,1 ± 5,2 g/L, a gordura do leite foi de 174,4 ± 7,1 g/L e a lactose do leite foi de 12,3 ± 0,6 g/L. No PD10, enquanto a lactose e a proteína do leite permaneceram em concentrações semelhantes às do PD2, a gordura do leite foi significativamente maior (224,4 ± 17,1 g/L). Também observamos que a abundância relativa de proteínas individuais do leite variou entre PD2 e PD10. Mais especificamente, αS1-caseína e proteína ácida de soro de leite foram maiores, enquanto β-caseína foi menor em PD10 em comparação com PD2. No geral, demonstramos uma técnica eficiente de uma única pessoa para amostragem de leite de camundongos usando um dispositivo que pode ser facilmente montado com equipamentos de laboratório comumente usados.

Introdução

A medicina comparada refere-se à ideia de que humanos e outros animais compartilham semelhanças em anatomia e fisiologia; Assim, as informações aprendidas de uma espécie podem ser usadas para estudar vias semelhantes na outra ^1,2. Desde o início do^século 20, roedores, especificamente camundongos e ratos, têm sido amplamente utilizados em pesquisas biomédicas devido à manipulação genética relativamente fácil para o desenvolvimento de modelos de doenças ^1,2. Além disso, eles são relativamente pequenos; portanto, menos recursos são necessários para manter as colônias em comparação com outros modelos de mamíferos não roedores². No entanto, seus pequenos tamanhos corporais também apresentam desafios. Certos procedimentos não podem ser feitos facilmente em camundongos. Por exemplo, a técnica de diferença arteriovenosa pode ser realizada em ratos ^3,4,5, mas pode ser desafiadora em camundongos, pois seus pequenos vasos sanguíneos podem se romper facilmente ^6,7. A quantidade de tecido que pode ser amostrada de um camundongo também é limitada. Por exemplo, em camundongos lactantes, o tecido adiposo visceral diminui significativamente em tamanho ^8,9 e, em alguns casos, para quantidades quase indetectáveis. Além disso, a amostragem de biofluido de camundongos também é limitada em quantidade; Dependendo da técnica, o volume de sangue amostrado pode variar, mas é sempre um pouco limitado⁷, restringindo o número de análises que podem ser realizadas.

Na pesquisa de lactação e desenvolvimento neonatal, há necessidade de amostragem de leite para avaliar a composição e a produção de leite. Em estudos realizados em camundongos, devido ao volume limitado de leite, as amostras são frequentemente agrupadas de várias mães para produzir uma quantidade adequada¹⁰. Vários estudos demonstram técnicas para a coleta de volumes analíticos suficientes de leite de um único camundongo 11,12,13. Esses métodos, no entanto, geralmente requerem dois funcionários treinados^11,12: um para segurar o animal durante a extração manual do leite e outro para coletar o leite com uma pipeta; ou requerem equipamentos e ferramentas que não estão prontamente disponíveis em um laboratório. Aqui, demonstramos uma modificação de uma técnica desenvolvida por DePeters e Hovey¹⁴. O dispositivo usado neste procedimento pode ser facilmente montado com equipamentos disponíveis no laboratório ou facilmente adquirido de fornecedores comuns. Usando este dispositivo, uma pessoa pode obter rotineiramente 0,1 a 0,5 mL de leite de camundongo em menos de 10 minutos para usar na maioria das análises. Coletamos leite no dia 2 pós-parto (PD2, início da lactação) e no dia 10 pós-parto (PD10, pico da lactação) e medimos os macronutrientes do leite para validar o método.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais e de cuidados com os animais seguiram as diretrizes federais e receberam a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Rutgers. Camundongos fêmeas (C57BL / 6 background) foram acasalados com 8 semanas de idade. Eles foram alimentados com ração reprodutora padrão ad libitum e mantidos em um ciclo regular de 12:12 h claro: escuro. O dia do parto foi contado como dia 1 pós-parto (PD1). No PD2 (início da lactação) e no PD10 (pico da lactação), o leite foi amostrado conforme descrito a seguir.

1. Montagem de um dispositivo de ordenha

1. Prenda uma extremidade do tubo de cloreto de polivinila (PVC) de 5/32 '' de diâmetro interno (ID) à bomba de vácuo e use fita adesiva para prender o acessório (identificado como a na Figura 1A).
   NOTA: A bomba de vácuo pode ser substituída por qualquer bomba adequada ou por um aspirador central (às vezes chamado de "aspirador doméstico") disponível no laboratório.
2. Conecte a outra extremidade do tubo de PVC de 5/32 '' ID ao tubo de PVC de 1/8 '' ID por meio de um conector reto farpado.
3. Prenda a outra extremidade do tubo de PVC de 1/8 '' ID a uma agulha hipodérmica 18G por meio de um conector (identificado como b na Figura 1A).
4. Corte a extremidade de uma ponta de pipeta P200 ~0.2 cm para criar uma abertura maior. Insira a ponta da pipeta P200 através da abertura da rolha do septo de forma que a ponta aponte para cima (Figura 1B).
   NOTA: Troque as pontas da pipeta entre os animais.
5. Conecte a rolha de septo a um tubo coletor estéril. Faça uma punção através da rolha do septo com a agulha hipodérmica 18 G.
6. Verifique a pressão de sucção girando a bomba de vácuo e colocando um dedo (coberto por uma luva de laboratório) contra a abertura da ponta da pipeta.
   NOTA: Você deve sentir uma sucção suave se estiver montado corretamente. O tubo coletor, a agulha hipodérmica de 18 G e as pontas da pipeta P200 devem ser estéreis.

Figura 1: O dispositivo de ordenha. (A) Dispositivo de ordenha com uma bomba de vácuo conectada a uma agulha hipodérmica de 18 G por meio de tubo de PVC. A agulha passa por uma rolha de septo que é conectada a um tubo coletor de microcentrífuga. Uma ponta de pipeta P-200 invertida, que é usada para extrair leite de um teto, é inserida através de uma abertura da rolha do septo. (B) Diagrama transversal do dispositivo de ordenha. (C) Uma mãe sendo ordenhada usando o método descrito. (D) Uma alíquota representativa (0,3 mL) de leite coletada de uma mãe no pico da lactação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Separação da mãe dos filhotes

1. No dia da ordenha, separe a mãe de seus filhotes para permitir o acúmulo de leite nas glândulas.
2. Mantenha os filhotes aquecidos em um ninho.
3. Aguarde 2 h de separação se o leite for coletado durante o início da lactação (por exemplo, PD2 neste estudo).
4. Aguarde 30 a 45 minutos de separação se o leite for coletado durante o pico da lactação (por exemplo, PD10 neste estudo).

3. Anestesia da barragem

1. Quando a mãe estiver pronta para ser ordenhada, administre uma injeção de solução de cetamina/xilazina (intraperitoneal, i.p.) em um lado da cavidade peritoneal entre o^4º e o^5º par de tetinas.
   NOTA: A quantidade de solução anestésica a ser administrada é calculada pelo peso da barragem (80–100 mg/kg de cetamina, 5–12 mg/kg de xilazina, de acordo com o protocolo IACUC da Rutgers University). Esta dose sedará um camundongo por 45 a 60 minutos, proporcionando tempo suficiente para a coleta de leite.
2. Confirme a anestesia apertando um pé com firmeza, mas sem machucá-lo, para testar a percepção do animal sobre sensação e dor. A anestesia adequada é indicada por nenhum tipo de movimento.
3. Aplique pomada oftálmica veterinária nos olhos da barragem para evitar o ressecamento durante a anestesia.

4. Coleta de leite

1. Coloque a barragem anestesiada de costas em uma superfície de trabalho sólida. Limpe suavemente a área mamária com um lenço de preparação com álcool estéril para limpar a área antes da ordenha.
2. Administre 1–2 unidades de ocitocina (i.p.) entre o^4º e o^5º par de no lado da cavidade peritoneal que não recebeu nenhuma injeção.
   NOTA: A ocitocina é uma molécula pequena que pode ser absorvida rapidamente e tem meia-vida curta ^14,15. A ordenha deve começar dentro de um minuto após a injeção.
3. Segure a barragem esfregando suavemente a área do pescoço com a mão não dominante.
4. Extraia manualmente o leite de uma tetina apertando o tecido mamário da base até a ponta da tetina até que uma gota de leite fique visível.
5. Ligue o dispositivo de aspiração ligando o botão liga/desliga.
6. Comece a ordenhar aplicando suavemente a ponta da pipeta P200 invertida em uma tetina. Use um movimento suave de puxar para ajudar a retirar o leite (Figura 1C).
7. Repita os passos 4.4–4.6 em todas as tetinas até que seja recolhido um volume suficiente de leite.
   NOTA: Durante a ordenha, o leite pode ser acidentalmente aspirado para a agulha hipodérmica de 18 G ou tubo de PVC da linha de vácuo. Isso pode ser facilmente remediado trocando a agulha ou o tubo de PVC antes de ordenhar o próximo animal.

5. Recuperação da barragem após a coleta de leite

1. Devolva a mãe anestesiada para a gaiola com seus filhotes e mantenha-a aquecida. Monitore o animal até que ele recupere a consciência.
   NOTA: A mãe pode se recusar a mamar novamente se ela puder acordar sozinha em uma gaiola separada antes de retornar aos filhotes. Isso é mais comum quando a coleta de leite ocorre durante o início da lactação (PD2).
2. Deixe as mães se afastarem de seus filhotes para se recuperar totalmente quando ela começar a acordar; Este é um comportamento normal.
   NOTA: Observamos que as mães retornam aos seus filhotes periodicamente e voltam a amamentar completamente após algumas horas.

6. Análise do leite

1. Use um kit comercial de ensaio de lactose (consulte a Tabela de Materiais) para medir a lactose do leite. Diluir o leite 75x com água estéril e realizar o ensaio de acordo com o protocolo do kit.
2. Medir a gordura do leite pelo método do crematócrito demonstrado em outras ^{publicações16,17}.
3. Estimar a proteína do leite realizando o ensaio de proteína de Bradford¹⁸ com albumina de soro bovino como padrão¹⁹. Antes de realizar o ensaio, centrifugue o leite a 4.000 × g por 15 min a 4 °C. Extrair o infranadante pipetando e diluí-lo a 1:10 com água estéril antes do ensaio.
4. Realizar eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE); separe 10 μg de proteína em um gel Bis-Tris pré-moldado a 4% a 12%, conforme as instruções do fabricante. Transfira as proteínas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) e core-as com Coomassie Blue R-250.

Resultados

Usando esta técnica, amostramos com sucesso leite suficiente em diferentes momentos durante uma lactação de 21 dias. Consideramos o dia do parto como o dia 1 pós-parto (PD1) e, neste trabalho, amostramos leite no PD2 (início da lactação) e PD10 (pico da lactação), n = 4 cada. Obtivemos confortavelmente 0,1–0,5 mL de leite de cada mãe (Figura 1D). Para validar esse método, medimos a composição bruta de macronutrientes dessas amostras de leite e comparamos as diferenças entre o leite coletado no início e no pico da lactação usando o teste t de Student.

Observou-se que a concentração média de lactose no leite foi de 12,3 ± 0,6 g/L no PD2 e de 12,0 ± 0,9 g/L no PD10 (Tabela 1). O percentual de gordura do leite foi de 26,0 ± 1,0% e 33,4 ± 2,5% no PD2 e PD10, respectivamente. A concentração de gordura foi de 174,4 ± 7,1 g/L no PD2 e significativamente maior, 224,4 ± 17,1 g/L no PD10 (Tabela 1). Os teores médios de proteína foram de 70,1 ± 5,2 g/L no PD2 e 75,1 ± 2,6 g/L no PD10 (Tabela 1). Embora o teor total de proteína do leite não tenha sido diferente entre PD2 e PD10, a abundância relativa de proteína individual do leite diferiu. Especificamente, a αS1-caseína e a proteína ácida do soro de leite foram maiores no leite PD10 do que no leite PD2 (p < 0,05), enquanto a β-caseína (p < 0,05) apresentou maior abundância no PD2 do que no PD10 (Figura 2).

Figura 2: Análise da proteína do leite. (A) Análise PAGE corada com azul de Coomassie do leite coletado em PD2 e PD10. A identificação da proteína foi feita conforme descrito anteriormente¹⁴. (B) Os sinais de proteínas individuais foram analisados no ImageJ e normalizados para a proteína total corada. Os resultados foram expressos como a média com barras de erro padrão e pontos de dados individuais como pontos. A abundância média de cada proteína em PD2 e PD10 foi comparada usando um teste t de Student bicaudal. *p < 0,05, n = 4. Abreviaturas: PAGE = eletroforese em gel de poliacrilamida; PDn = dia pós-parto n. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

		Média	SEM	Valor de p
Lactose (g/L)	PD2	12.3	0.6	0.75
	PD10	12.0	0.9
Gordura (g/L)	PD2	174.4	7.1	0.04
	PD10	224.4	17.1
Proteína (g/L)	PD2	70.1	5.2	0.42
	PD10	75.1	2.6

Tabela 1: Composição de macronutrientes do leite coletado em PD2 e PD10. Os resultados, expressos como média e erro padrão da média (EPM), foram analisados para examinar os efeitos do dia de lactação na composição do leite usando um teste t de Student bicaudal, n = 4.

Discussão

Demonstramos uma técnica de ordenha modificada que pode ser realizada por uma pessoa usando um dispositivo que pode ser facilmente montado e portátil. Tradicionalmente, o leite de roedor é coletado por meio de tubos capilares^10,17, pipetas de vidro Pasteur¹² ou micropipetas¹¹. Esses métodos exigem que uma pessoa contenha a barragem e extraia manualmente o leite e outra colete o leite. Às vezes, isso pode ser um desafio, especialmente quando a amostragem de leite ocorre durante fins de semana ou feriados. O leite coletado por esses métodos deve ser transferido para tubos de armazenamento estéreis. Como o leite de roedores é relativamente rico em gordura (como mostrado aqui e em outros estudos^20,21) e, portanto, viscoso, o processo de transferência de leite provavelmente resulta em perda de volume de leite, limitando as quantidades para análises. O dispositivo descrito aqui pode ser montado em menos de 5 minutos com ferramentas disponíveis no laboratório. Pode ser facilmente usado por uma pessoa para provar o volume de leite suficiente em 10 minutos. A abordagem de sucção suave contínua associada a este método alivia o problema da perda de amostra devido à transferência, uma vez que o leite é constantemente puxado diretamente para um tubo coletor. Minimizar a perda de amostra é particularmente importante ao coletar leite já no PD2, uma vez que a produção de leite é relativamente baixa nesta fase¹⁰. Além disso, o mesmo dispositivo e protocolo foram usados para coletar leite com sucesso de outra cepa de camundongo (fundo FVB / N), sugerindo que esse método provavelmente funciona igualmente bem em cepas de camundongos.

Neste estudo, também observamos que o tempo de separação pode diferir dependendo do estágio da lactação. Estudos anteriores relatam que as mães devem ser separadas de seus filhotes por pelo menos 2 h e até 16 h antes da coleta de leite para obter volume de leite suficiente ^11,13. Ao empregar esse método, descobrimos que separar as mães de seus filhotes por 2 h no início da lactação (PD2) e por apenas 30 a 45 minutos no pico da lactação (PD10) foi suficiente para obter um volume adequado de leite. Como leva mais tempo para a mãe se recuperar da anestesia, minimizar a duração da separação não apenas reduz o tempo de amostragem, mas também diminui o impacto potencial que pode representar sobre a mãe e seus filhotes.

Além disso, descobrimos que a coleta de leite já no PD2 pode afetar negativamente o crescimento subsequente dos filhotes devido ao longo tempo de separação e recuperação da mãe, levando a um período de alimentação insuficiente. Isso não foi observado quando o leite foi amostrado no pico da lactação (PD10). Portanto, se um investigador estiver interessado em coletar amostras de leite em diferentes momentos durante o período de lactação de 21 dias, é aconselhável coletar amostras de leite no início da lactação de um conjunto separado de mães. A coleta de leite, no entanto, pode ser realizada na mesma mãe várias vezes durante o pico e o final da lactação para estudos longitudinais.

Alternativamente, os pesquisadores podem optar por outros agentes anestésicos para minimizar o tempo de recuperação da barragem. Por exemplo, a inalação de isoflurano pode ajudar a reduzir o tempo de recuperação, uma vez que os animais normalmente se recuperam rapidamente após a descontinuação do isoflurano²². Embora essa escolha anestésica seja realizada por muitos^13,23, é relatado que a inalação de isoflurano pode afetar negativamente o volume de leite coletado¹³. Além disso, a inalação de isoflurano requer aparelhos apropriados para garantir o controle preciso da dosagem. A pesquisa sobre os efeitos de agentes anestésicos como cetamina/xilazina e isoflurano na lactação e na composição do leite e sua potencial transferência para o leite materno é limitada 24,25,26. Recomenda-se, portanto, que a interpretação dos dados seja realizada com cuidado ao comparar estudos usando diferentes opções de anestesia. Outra alternativa é a amostragem de leite sem anestesia, conforme descrito por outros pesquisadores 14,27,28,29. Este procedimento, no entanto, pode causar estresse excessivo à mãe e exigir uma pessoa adicional para conter o animal.

Este estudo também mostrou que os ensaios de macronutrientes podem ser realizados usando as amostras de leite, com um excedente remanescente para mais procedimentos, como análises ômicas. Os níveis de lactose, proteína e gordura do leite foram medidos e comparados com os dados publicados para validar o método descrito. A concentração de lactose no leite representou ~ 1,2% do componente do leite, o que é semelhante ao de camundongos em uma dieta controle relatada em outros estudos^{30 , 31 , 32} . Confirmou-se que o leite de camundongo possui alto percentual de gordura, variando de 26% a 33%, conforme relatado anteriormente^20,30. A concentração de proteína total aqui relatada foi semelhante à relatada por Chen et ^al.30, mas menor do que a relatada em outros estudos^31,32. Em termos de mudanças do início ao pico da lactação, descobrimos que os níveis de lactose e proteína permaneceram relativamente constantes, mas o percentual de gordura do leite aumentou do início ao pico da lactação. Isso está em desacordo com Ragueneau³², mas a discrepância pode ser devido a diferenças no tamanho da amostra. Embora a concentração de proteína total tenha sido semelhante entre o início e o pico da lactação, descobrimos que a abundância de proteína individual (αS1-caseína, β-caseína e proteína ácida do soro de leite) variou, presumivelmente refletindo mudanças nas necessidades dos neonatos em diferentes estágios de desenvolvimento.

Embora essa técnica não permita a quantificação da produção de leite, esta pode ser calculada por meio do índice de desempenho (PIO) proposto por Falconer em 1947³³. A produção de leite depende muito do tamanho da ninhada e do dia da amostragem. Este índice pode ser usado como uma medida da produção de leite, levando em conta as diferenças no tamanho da ninhada. Por exemplo, toda a cama pode ser pesada em PD10 (quando a mãe é separada para amostragem de leite). A PIO de uma mãe é então calculada dividindo o peso de sua ninhada pelo peso médio de ninhadas do mesmo tamanho em PD10. Em conclusão, demonstramos uma técnica eficiente de uma única pessoa para amostragem de leite de camundongos de laboratório usando um dispositivo que pode ser facilmente montado com equipamentos relativamente baratos e prontamente disponíveis. Essa técnica permite a coleta consistente de quantidades suficientes de leite para a maioria das análises.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL cryogenic vials	Corning	430658	Preferred for early milk collection
1 mL syringe	Exel	26048
2 mL microcentrifuge collecting tube	Fisher Scientific	02-681-344	Preferred for peak and late milk collection
18 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305195
27 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305109
Alcohol prep wipe	Honeywell	154818
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Immobilon -P PVDF Membrane	Immobilon	IPVH00010
Ketamine	Dechra	1000001250	Purchased via Veternarian Office
Laboratory labeling tape	VWR International	89097
Lactose Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK487
Mini Barbed polypropylene fittings	Cole-Parmer Instrument Company	6365-90
Mouse diet	Lab Diet	5015
NuPAGE Bis-Tris Mini Protein Gels, 4–12%	Invitrogen	NP0335BOX
Optixcare Eye Lube	Aventix	N/A	Purchased via Veternarian Office
Oxytocin	Bimeda	1OXY015	Purchased via Veternarian Office
P200 pipette tips	Gilson	F1733001
PVC tubing: 1/8'' ID	VWR International	MFLX07407-75
PVC tubing: 5/32'' ID	VWR International	MFLX07407-77
Septum stopper	Chemglass Life Sciences	CG-3022-91
Vacuum pump	Drummond Scientific Co.	P-103635
Xylazine	Akorn Animal Health	NDC 59399-110-20	Purchased via Veternarian Office