Une technique efficace pour l’échantillonnage du lait sur des souris de laboratoire

Résumé

Cet article décrit comment assembler un appareil qui peut être utilisé pour recueillir le lait de souris de laboratoire. Cet appareil est abordable, portable et permet de recueillir de 0,1 à 0,5 ml de lait par une seule personne formée. Un protocole de traite détaillé est également inclus.

Résumé

Les modèles de rongeurs ont été largement utilisés en biologie depuis le début du 20e siècle pour étudier la physiologie de base et les mécanismes biochimiques. Dans la recherche sur la lactation et le développement néonatal, il est nécessaire d’échantillonner le lait pour déterminer la composition et la façon dont le lait peut être affecté par des manipulations expérimentales, ce qui a un impact sur le développement du nouveau-né. Il peut être difficile de collecter des biofluides en quantités suffisantes sur de petits rongeurs. Plusieurs études ont mis en évidence différentes techniques pour obtenir du lait à partir de souris. Cependant, ces techniques nécessitent souvent au moins deux personnes formées, ce qui peut être difficile dans certains cas.

Ici, nous démontrons une technique d’échantillonnage de lait modifiée basée sur une méthode publiée en 2009. Grâce à cette méthode abordable et facile à assembler, une personne formée peut obtenir régulièrement 0,1 à 0,5 ml de lait d’une digue sous anesthésie en moins de 10 minutes. En utilisant cette méthode, nous avons collecté suffisamment de lait le 2e jour (PD2) et le 10e jour 10 (PD10) après l’accouchement. Nous avons mesuré les composants des macronutriments du lait et les avons comparés à la littérature existante pour valider notre méthode de collecte.

Nous avons noté que sur la PD2, la teneur moyenne en protéines du lait était de 70,1 ± 5,2 g/L, celle de la matière grasse du lait de 174,4 ± 7,1 g/L et celle du lactose du lait de 12,3 ± 0,6 g/L. Sur PD10, alors que le lactose et les protéines du lait sont restés à des concentrations similaires à celles de PD2, la matière grasse du lait était significativement plus élevée (224,4 ± 17,1 g/L). Nous avons également observé que l’abondance relative des protéines de lait individuelles variait entre PD2 et PD10. Plus précisément, la caséine αS1 et la protéine acide de lactosérum étaient plus élevées, tandis que la β-caséine était plus faible à PD10 par rapport à PD2. Dans l’ensemble, nous démontrons une technique efficace pour l’échantillonnage du lait de souris par une seule personne à l’aide d’un appareil qui peut facilement être assemblé avec de l’équipement de laboratoire couramment utilisé.

Introduction

La médecine comparée fait référence à l’idée que les humains et les autres animaux partagent des similitudes dans l’anatomie et la physiologie ; Ainsi, les informations apprises d’une espèce peuvent être utilisées pour étudier des voies similaires chez l’autre ^1,2. Depuis le début du 20e^siècle, les rongeurs, en particulier les souris et les rats, ont été largement utilisés dans la recherche biomédicale en raison de la manipulation génétique relativement facile pour le développement de modèles de maladies ^1,2. De plus, ils sont relativement petits ; Ainsi, moins de ressources sont nécessaires pour maintenir les colonies par rapport à d’autres modèles de mammifères non rongeurs². Cependant, leur petite taille s’accompagne également de défis. Certaines procédures ne peuvent pas être effectuées facilement sur des souris. Par exemple, la technique de la différence artérioveineuse peut être réalisée sur des rats ^3,4,5, mais elle peut être difficile chez la souris car leurs petits vaisseaux sanguins peuvent facilement se rompre ^6,7. La quantité de tissu pouvant être prélevée sur une souris est également limitée. Par exemple, chez les souris allaitantes, le tissu adipeux viscéral diminue considérablement en taille ^8,9 et dans certains cas, à des quantités presque indétectables. De plus, l’échantillonnage de biofluide chez la souris est également limité en quantité ; Selon la technique, le volume de sang prélevé peut varier mais est toujours quelque peu limité⁷, limitant le nombre d’analyses pouvant être effectuées.

Dans la recherche sur la lactation et le développement néonatal, il est nécessaire d’échantillonner le lait pour évaluer la composition et le rendement laitier. Dans les études réalisées sur des souris, en raison du volume de lait limité, les échantillons sont souvent regroupés à partir de plusieurs mères pour obtenir une quantité adéquate¹⁰. Un certain nombre d’études ont démontré des techniques permettant de collecter des volumes analytiques suffisants de lait à partir d’une seule souris 11,12,13. Cependant, ces méthodes nécessitent généralement deux personnes formées ^11,12 : l’une pour tenir l’animal tout en exprimant manuellement le lait et l’autre pour recueillir le lait à l’aide d’une pipette ; Ou ils nécessitent de l’équipement et des outils qui ne sont pas facilement disponibles dans un laboratoire. Ici, nous démontrons une modification d’une technique conçue par DePeters et Hovey¹⁴. L’appareil utilisé dans cette procédure peut être facilement assemblé avec l’équipement disponible en laboratoire ou facilement acheté auprès de fournisseurs courants. À l’aide de cet appareil, une personne peut obtenir régulièrement 0,1 à 0,5 mL de lait de souris en moins de 10 minutes pour la plupart des analyses. Nous avons recueilli le lait le 2e jour après l’accouchement (PD2, lactation précoce) et le 10e jour après l’accouchement (PD10, pic de lactation) et mesuré les macronutriments du lait pour valider la méthode.

Protocole

Tous les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont suivi les directives fédérales et ont reçu l’approbation du comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Rutgers. Les souris femelles (C57BL/6 de fond) ont été accouplées à l’âge de 8 semaines. Ils ont été nourris ad libitum avec un chow de reproduction standard et maintenus sous un cycle régulier de 12:12 h lumière/obscurité. Le jour de la livraison a été compté comme le jour 1 après l’accouchement (PD1). Pour les PD2 (lactation précoce) et PD10 (pic de lactation), l’échantillon de lait a été effectué comme décrit ci-dessous.

1. Assemblage d’un appareil de traite

1. Fixez une extrémité du tube en polychlorure de vinyle (PVC) de 5/32'' de diamètre intérieur (ID) à la pompe à vide et utilisez du ruban adhésif pour fixer l’accessoire (étiqueté a dans la Figure 1A).
   REMARQUE : La pompe à vide peut être remplacée par n’importe quelle pompe appropriée ou par un aspirateur central (parfois appelé « aspirateur domestique ») disponible en laboratoire.
2. Fixez l’autre extrémité du tube en PVC 5/32'' ID au tube en PVC 1/8'' ID via un connecteur droit barbelé.
3. Fixez l’autre extrémité du tube en PVC 1/8'' ID à une aiguille hypodermique 18G via un connecteur (étiqueté b sur la Figure 1A).
4. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette P200 ~0,2 cm pour créer une ouverture plus grande. Insérez la pointe de la pipette P200 dans l’ouverture du bouchon de septum de sorte que la pointe pointe vers le haut (Figure 1B).
   REMARQUE : Changez les pointes de pipette entre les animaux.
5. Fixez le bouchon de septum à un tube collecteur stérile. Faites une perforation à travers le bouchon du septum avec l’aiguille hypodermique 18 G.
6. Vérifiez la pression d’aspiration en allumant la pompe à vide et en plaçant un doigt (recouvert d’un gant de laboratoire) contre l’ouverture de la pointe de la pipette.
   REMARQUE : Vous devriez ressentir une légère aspiration s’il est correctement assemblé. Le tube collecteur, l’aiguille hypodermique de 18 G et les pointes de pipette P200 doivent être stériles.

Figure 1 : L’appareil de traite. (A) Dispositif de traite avec une pompe à vide fixée à une aiguille hypodermique de 18 G via un tube en PVC. L’aiguille passe à travers un bouchon de septum qui est attaché à un tube collecteur de microcentrifugeuse. Une pointe de pipette P-200 inversée, qui est utilisée pour aspirer le lait d’une tétine, est insérée à travers une ouverture du bouchon de septum. (B) Schéma en coupe transversale de l’appareil de traite. (C) Une mère traite selon la méthode décrite. (D) Une aliquote représentative (0,3 mL) de lait prélevée sur une mère au plus fort de la lactation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Séparation de la mère des petits

1. Le jour de la traite, séparez la mère de ses petits pour permettre l’accumulation de lait dans les glandes.
2. Gardez les chiots au chaud dans un nid.
3. Prévoyez 2 h de séparation si le lait est recueilli au début de la lactation (p. ex., PD2 dans cette étude).
4. Prévoyez 30 à 45 minutes de séparation si le lait est recueilli pendant le pic de lactation (p. ex., PD10 dans cette étude).

3. Anesthésie du barrage

1. Lorsque la mère est prête à être traite, administrer une injection de solution de kétamine/xylazine (intrapéritonéale, i.p.) dans un côté de la cavité péritonéale entre la 4^e et la 5^e paire de trayons.
   REMARQUE : La quantité de solution anesthésique à administrer est calculée en fonction du poids de la digue (80 à 100 mg / kg de kétamine, 5 à 12 mg / kg de xylazine, selon le protocole IACUC de l’Université Rutgers). Cette dose encadre une souris pendant 45 à 60 minutes, ce qui laisse amplement de temps pour la collecte du lait.
2. Confirmez l’anesthésie en serrant fermement un pied, mais sans le blesser, pour tester la perception de la sensation et de la douleur de l’animal. Une anesthésie adéquate n’est indiquée par aucun mouvement d’aucune sorte.
3. Appliquez une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux de la digue pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.

4. Collecte du lait

1. Placez la digue anesthésiée sur son dos sur une surface de travail solide. Essuyez doucement sa zone mammaire avec une lingette imbibée d’alcool stérile pour nettoyer la zone avant la traite.
2. Administrez 1 à 2 unités d’ocytocine (i.p.) entre la 4^e et la 5^e paire de trayons du côté de la cavité péritonéale qui n’a reçu aucune injection.
   REMARQUE : L’ocytocine est une petite molécule qui peut être absorbée rapidement et a une courte demi-vie ^14,15. La traite doit commencer dans la minute qui suit l’injection.
3. Tenez la digue en ébouriffant doucement la zone de son cou avec la main non dominante.
4. Exprimez manuellement le lait d’un trayon en pressant le tissu mammaire de la base à la pointe du trayon jusqu’à ce qu’un cordon de lait soit visible.
5. Allumez l’appareil à vide en allumant le bouton d’alimentation.
6. Commencez la traite en appliquant délicatement l’embout de pipette P200 inversé sur une tétine. Utilisez un léger mouvement de traction pour aider à extraire le lait (Figure 1C).
7. Répétez les étapes 4.4 à 4.6 sur tous les trayons jusqu’à ce qu’un volume suffisant de lait soit recueilli.
   REMARQUE : Pendant la traite, le lait peut être accidentellement aspiré dans l’aiguille hypodermique de 18 G ou le tube en PVC de la conduite de vide. Il est facile d’y remédier en changeant l’aiguille ou le tube en PVC avant de traire l’animal suivant.

5. Récupération de la digue après la collecte du lait

1. Remettez la mère anesthésiée dans la cage avec ses petits et gardez-la au chaud. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne conscience.
   REMARQUE : La mère peut refuser de téter à nouveau si elle est autorisée à se réveiller seule dans une cage séparée avant de retourner à ses petits. Ceci est plus fréquent lorsque la collecte du lait a lieu au début de la lactation (PD2).
2. Laissez les mères s’éloigner de ses petits pour qu’elle se rétablisse complètement lorsqu’elle commence à se réveiller ; Il s’agit d’un comportement normal.
   REMARQUE : Nous observons les mères retourner périodiquement à leurs petits et recommencer à allaiter complètement après quelques heures.

6. Analyse du lait

1. Utilisez une trousse d’analyse du lactose commerciale (voir la table des matières) pour mesurer le lactose du lait. Diluez le lait 75 fois avec de l’eau stérile et effectuez le dosage selon le protocole du kit.
2. Mesurer la matière grasse du lait à l’aide de la méthode du crématocrite démontrée dans d’autres publications^16,17.
3. Estimez la teneur en protéines du lait en effectuant le dosage des protéines de Bradford¹⁸ avec de l’albumine sérique bovine comme norme¹⁹. Avant d’effectuer le dosage, centrifugez le lait à 4 000 × g pendant 15 min à 4 °C. Extraire l’infranatant par pipetage et le diluer à 1:10 avec de l’eau stérile avant le dosage.
4. Effectuer l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) ; séparer 10 μg de protéines sur un gel de Bis-Tris préfabriqué à 4 % à 12 % selon les instructions du fabricant. Transférez les protéines sur des membranes en polyfluorure de vinylidène (PVDF) et colorez-les avec Coomassie Blue R-250.

Résultats

En utilisant cette technique, nous avons réussi à échantillonner suffisamment de lait à différents moments au cours d’une lactation de 21 jours. Nous considérons que le jour de l’accouchement est le jour 1 après l’accouchement (PD1), et dans ce travail, nous avons échantillonné du lait à PD2 (lactation précoce) et PD10 (pic de lactation), n = 4 chacun. Nous avons obtenu confortablement 0,1 à 0,5 ml de lait de chaque mère (figure 1D). Pour valider cette méthode, nous avons mesuré la composition macronutritive brute de ces échantillons de lait et comparé les différences entre le lait prélevé au début et au pic de lactation à l’aide du test t de Student.

Nous avons constaté que la concentration moyenne de lactose dans le lait était de 12,3 ± 0,6 g/L sur PD2 et de 12,0 ± 0,9 g/L sur PD10 (tableau 1). Le pourcentage de matière grasse du lait était de 26,0 ± 1,0 % et de 33,4 ± 2,5 % sur les PD2 et PD10, respectivement. La concentration de matières grasses était de 174,4 ± 7,1 g/L sur la PD2 et significativement plus élevée, de 224,4 ± 17,1 g/L sur la PD10 (tableau 1). La teneur moyenne en protéines était de 70,1 ± 5,2 g/L pour la PD2 et de 75,1 ± 2,6 g/L pour la PD10 (tableau 1). Bien que la teneur totale en protéines du lait n’ait pas été différente entre la PD2 et la PD10, l’abondance relative des protéines de lait individuelles différait. Plus précisément, la caséine αS1 et la protéine acide de lactosérum étaient plus élevées dans le lait PD10 que dans le lait PD2 (p < 0,05), tandis que la caséine β (p < 0,05) présentait une abondance plus élevée dans PD2 que dans PD10 (Figure 2).

Figure 2 : Analyse des protéines de lait. (A) Analyse PAGE de Coomassie Blue-stained du lait prélevé à PD2 et PD10. L’identification des protéines a été effectuée comme décrit précédemment¹⁴. (B) Les signaux protéiques individuels ont été analysés dans ImageJ et normalisés à la protéine totale colorée. Les résultats ont été exprimés sous forme de moyenne, avec des barres d’erreur standard et des points de données individuels sous forme de points. L’abondance moyenne de chaque protéine sur PD2 et PD10 a été comparée à l’aide d’un test t de Student bilatéral. *p < 0,05, n = 4. Abréviations : PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide ; PDn = jour après l’accouchement n. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.

		Moyenne	SEM	Valeur p
Lactose (g/L)	PD2	12.3	0.6	0.75
	PD10	12.0	0.9
Graisse (g/L)	PD2	174.4	7.1	0.04
	PD10	224.4	17.1
Protéine (g/L)	PD2	70.1	5.2	0.42
	PD10	75.1	2.6

Tableau 1 : Composition en macronutriments du lait prélevé aux PD2 et PD10. Les résultats, exprimés en moyenne et en erreur-type de la moyenne, ont été analysés afin d’examiner les effets du jour de lactation sur la composition du lait à l’aide d’un test t de Student bilatéral, n = 4.

Discussion

Nous avons fait la démonstration d’une technique de traite modifiée qui peut être effectuée par une seule personne à l’aide d’un appareil qui peut être facilement assemblé et portable. Traditionnellement, le lait de rongeur est collecté à l’aide de tubes capillaires^10,17, de pipettes Pasteur en verre¹² ou de micropipettes¹¹. Ces méthodes exigent qu’une personne retienne le barrage et tire manuellement le lait et qu’une autre recueille le lait. Cela peut parfois être difficile, surtout lorsque l’échantillonnage du lait a lieu pendant les week-ends ou les jours fériés. Le lait recueilli par ces méthodes doit être transféré dans des tubes de stockage stériles. Étant donné que le lait de rongeur est relativement riche en matières grasses (comme le montrent ici et dans d’autres études^20,21), et donc visqueux, le processus de transfert du lait entraîne probablement une perte de volume de lait, ce qui limite les quantités pour les analyses. L’appareil décrit ici peut être assemblé en moins de 5 min avec des outils disponibles en laboratoire. Il peut être facilement utilisé par une seule personne pour échantillonner un volume de lait suffisant en 10 minutes. L’approche d’aspiration douce et continue associée à cette méthode atténue le problème de la perte d’échantillon due au transfert, car le lait est constamment aspiré directement dans un tube collecteur. Il est particulièrement important de minimiser les pertes d’échantillons lors de la collecte du lait dès la PD2, car la production laitière est connue pour être relativement faible à ce stade¹⁰. De plus, le même dispositif et le même protocole ont été utilisés pour recueillir avec succès le lait d’une autre souche de souris (fond FVB/N), ce qui suggère que cette méthode fonctionne probablement aussi bien pour toutes les souches de souris.

Dans cette étude, nous avons également observé que le moment de la séparation peut différer en fonction du stade de lactation. Des études antérieures indiquent que les mères doivent être séparées de leurs petits pendant au moins 2 h et jusqu’à 16 h avant la collecte du lait pour obtenir un volume de lait suffisant^11,13. En utilisant cette méthode, nous avons constaté que séparer les mères de leurs petits pendant 2 h au début de la lactation (PD2) et pendant seulement 30 à 45 minutes au pic de lactation (PD10) était suffisant pour obtenir un volume adéquat de lait. Étant donné qu’il faut plus de temps à la mère pour se remettre de l’anesthésie, la minimisation de la durée de la séparation réduit non seulement le temps d’échantillonnage, mais diminue également l’impact potentiel qu’elle peut avoir sur la mère et ses petits.

De plus, nous avons constaté que la collecte du lait dès la PD2 peut affecter négativement la croissance ultérieure des petits en raison du long temps de séparation et de récupération de la mère, entraînant une période d’alimentation insuffisante. Cela n’a pas été observé lorsque le lait a été échantillonné au pic de lactation (PD10). Par conséquent, si un chercheur souhaite prélever du lait à différents moments au cours de la période de lactation de 21 jours, il est conseillé de prélever du lait en début de lactation à partir d’un ensemble distinct de mères. Cependant, la collecte du lait peut être effectuée sur la même mère plusieurs fois pendant le pic et la fin de la lactation pour les études longitudinales.

Alternativement, les chercheurs peuvent opter pour d’autres agents anesthésiques pour minimiser le temps de récupération de la mère. Par exemple, l’inhalation d’isoflurane peut aider à réduire le temps de récupération, car les animaux se rétablissent généralement rapidement après l’arrêt de l’isoflurane²². Bien que ce choix d’anesthésie soit effectué par de nombreux^13,23, il est rapporté que l’inhalation d’isoflurane peut affecter négativement le volume de lait collecté¹³. De plus, l’inhalation d’isoflurane nécessite un appareil approprié pour assurer un contrôle précis du dosage. Les recherches sur les effets des agents anesthésiques tels que la kétamine/xylazine et l’isoflurane sur la lactation et la composition du lait et leur transfert potentiel dans le lait maternel sont limitées 24,25,26. Il est donc conseillé d’interpréter les données avec soin lors de la comparaison d’études utilisant différents choix d’anesthésie. Une autre alternative consiste à prélever du lait sans anesthésie, comme décrit par d’autres chercheurs 14,27,28,29. Cependant, cette procédure peut potentiellement causer un stress excessif au barrage et nécessiter une personne supplémentaire pour retenir l’animal.

Cette étude a également montré que des dosages de macronutriments pouvaient être effectués à l’aide d’échantillons de lait, avec un surplus restant pour d’autres procédures telles que les analyses omiques. Les taux de lactose, de protéines et de matières grasses du lait ont été mesurés et comparés aux données publiées pour valider la méthode décrite. La concentration de lactose dans le lait représentait ~1,2 % de la composante du lait, ce qui est similaire à celui des souris suivant un régime témoin rapporté dans d’autres études 30,31,32. Il a été confirmé que le lait de souris contenait un pourcentage élevé de matières grasses, allant de 26 % à 33 %, comme indiqué précédemment^20,30. La concentration totale en protéines rapportée ici était similaire à celle rapportée par Chen et ^al.30, mais inférieure à celle rapportée dans d’autres études^31,32. En ce qui concerne les changements entre le début et le pic de lactation, nous avons constaté que les niveaux de lactose et de protéines restaient relativement constants, mais que le pourcentage de matière grasse du lait augmentait du début au pic de lactation. Ceci est en désaccord avec Ragueneau³², mais l’écart peut être dû à des différences dans la taille de l’échantillon. Bien que la concentration totale en protéines soit similaire entre le début et le pic de lactation, nous avons constaté que l’abondance des protéines individuelles (caséine αS1, caséine β et protéine acide de lactosérum) variait, reflétant probablement des changements dans les besoins des nouveau-nés à différents stades de développement.

Bien que cette technique ne permette pas de quantifier la production laitière, celle-ci peut être calculée à l’aide de l’indice de performance (IOP) proposé par Falconer en 1947³³. La production de lait dépend grandement de la taille de la portée et du jour de l’échantillonnage. Cet indice peut être utilisé comme mesure de la production laitière en tenant compte des différences de taille des portées. Par exemple, toute la portée peut être pesée sur PD10 (lorsque la mère est séparée pour l’échantillonnage du lait). La PIO d’une mère est ensuite calculée en divisant le poids de sa portée par le poids moyen des portées de même taille sur PD10. En conclusion, nous démontrons une technique efficace d’échantillonnage du lait de souris de laboratoire par une seule personne à l’aide d’un appareil qui peut être facilement assemblé avec un équipement relativement peu coûteux et facilement disponible. Cette technique permet de recueillir régulièrement des quantités suffisantes de lait pour la plupart des analyses.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL cryogenic vials	Corning	430658	Preferred for early milk collection
1 mL syringe	Exel	26048
2 mL microcentrifuge collecting tube	Fisher Scientific	02-681-344	Preferred for peak and late milk collection
18 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305195
27 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305109
Alcohol prep wipe	Honeywell	154818
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Immobilon -P PVDF Membrane	Immobilon	IPVH00010
Ketamine	Dechra	1000001250	Purchased via Veternarian Office
Laboratory labeling tape	VWR International	89097
Lactose Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK487
Mini Barbed polypropylene fittings	Cole-Parmer Instrument Company	6365-90
Mouse diet	Lab Diet	5015
NuPAGE Bis-Tris Mini Protein Gels, 4–12%	Invitrogen	NP0335BOX
Optixcare Eye Lube	Aventix	N/A	Purchased via Veternarian Office
Oxytocin	Bimeda	1OXY015	Purchased via Veternarian Office
P200 pipette tips	Gilson	F1733001
PVC tubing: 1/8'' ID	VWR International	MFLX07407-75
PVC tubing: 5/32'' ID	VWR International	MFLX07407-77
Septum stopper	Chemglass Life Sciences	CG-3022-91
Vacuum pump	Drummond Scientific Co.	P-103635
Xylazine	Akorn Animal Health	NDC 59399-110-20	Purchased via Veternarian Office