טכניקה יעילה לאדם יחיד לדגימת חלב מעכברי מעבדה

Summary

מאמר זה מתאר כיצד להרכיב מכשיר שניתן להשתמש בו לאיסוף חלב מעכברי מעבדה. מכשיר זה זול, נייד ומאפשר איסוף של 0.1-0.5 מ"ל חלב על ידי אדם מיומן אחד. פרוטוקול חליבה מפורט כלול גם כן.

Abstract

מודלים של מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה מאז תחילת המאה ה-20 כדי לחקור פיזיולוגיה בסיסית ומנגנונים ביוכימיים. במחקר הנקה והתפתחות יילודים, יש צורך לדגום חלב כדי לקבוע את ההרכב וכיצד החלב עשוי להיות מושפע ממניפולציות ניסיוניות, ובכך להשפיע על התפתחות היילוד. איסוף נוזלים ביולוגיים בכמויות מספיקות ממכרסמים קטנים יכול להיות קשה. מספר מחקרים הדגימו טכניקות שונות להשגת חלב מעכברים. עם זאת, טכניקות אלו דורשות לרוב לפחות שני אנשי צוות מיומנים, מה שעשוי להיות מאתגר במקרים מסוימים.

כאן, אנו מדגימים טכניקת דגימת חלב שונה המבוססת על שיטה שפורסמה בשנת 2009. בשיטה זולה וקלה להרכבה, אדם מיומן אחד יכול להשיג באופן שגרתי 0.1-0.5 מ"ל חלב מסכר בהרדמה תוך פחות מ-10 דקות. באמצעות שיטה זו, אספנו מספיק חלב ביום השני לאחר הלידה (PD2) וביום ה-10 לאחר הלידה (PD10). מדדנו את מרכיבי המאקרו-נוטריינטים של החלב והשווינו אותם עם הספרות הקיימת כדי לאמת את שיטת האיסוף שלנו.

רשמנו כי ב-PD2, חלבון חלב היה בממוצע 70.1 ±-5.2 גרם/ליטר, שומן חלב היה 174.4 ±-7.1 גרם/ליטר, ולקטוז חלב היה 12.3 ±-0.6 גרם/ליטר. ב-PD10, בעוד שלקטוז חלב וחלבון נשארו בריכוזים דומים ל-PD2, שומן החלב היה גבוה יותר באופן משמעותי (224.4 ±-17.1 גרם/ליטר). ראינו גם שהשפע היחסי של חלבוני חלב בודדים משתנה בין PD2 ל-PD10. ליתר דיוק, αS1-קזאין וחלבון חומצי מי גבינה היו גבוהים יותר, ואילו β-קזאין היה נמוך יותר ב-PD10 בהשוואה ל-PD2. בסך הכל, אנו מדגימים טכניקה יעילה של אדם אחד לדגימת חלב מעכברים באמצעות מכשיר שניתן להרכיב בקלות עם ציוד מעבדה נפוץ.

Introduction

רפואה השוואתית מתייחסת לרעיון שבני אדם ובעלי חיים אחרים חולקים קווי דמיון באנטומיה ובפיזיולוגיה; לפיכך, מידע שנלמד ממין אחד יכול לשמש לחקר מסלולים דומים^ב-1,2 השני. מאז תחילת המאה^ה-20, מכרסמים, במיוחד עכברים וחולדות, נמצאים בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי בשל מניפולציה גנטית קלה יחסית לפיתוח מודלים של מחלות ^1,2. בנוסף, הם קטנים יחסית; לפיכך נדרשים פחות משאבים לתחזוקת מושבות בהשוואה למודלים אחרים של יונקים שאינם מכרסמים². עם זאת, מידות הגוף הקטנות שלהן מגיעות גם עם אתגרים. לא ניתן לבצע הליכים מסוימים בקלות על עכברים. לדוגמה, ניתן לבצע את טכניקת ההבדל העורקי בחולדות ^3,4,5, אך היא יכולה להיות מאתגרת בעכברים מכיוון שכלי הדם הקטנים שלהם יכולים להיקרע בקלות ^6,7. כמות הרקמה שניתן לדגום מעכבר מוגבלת גם היא. לדוגמה, בעכברים מניקות, רקמת השומן הקרביים פוחתת משמעותית בגודל ^8,9 ובמקרים מסוימים, לכמויות כמעט בלתי ניתנות לזיהוי. בנוסף, גם דגימת הנוזל הביולוגי מעכברים מוגבלת בכמות; בהתאם לטכניקה, נפח הדם שנדגם עשוי להשתנות אך הוא^{תמיד מוגבל} במקצת, מה שמגביל את מספר הניתוחים שניתן לבצע.

במחקר הנקה והתפתחות יילודים, יש צורך לדגום חלב כדי להעריך את ההרכב ואת תפוקת החלב. במחקרים שבוצעו בעכברים, עקב נפח חלב מוגבל, דגימות נאספות לעתים קרובות מכמה סכרים כדי להניב כמות מספקת¹⁰. מספר מחקרים מדגימים טכניקות לאיסוף כמויות אנליטיות מספיקות של חלב מעכבר בודד 11,12,13. שיטות אלה, לעומת זאת, דורשות בדרך כלל שני אנשי צוות מיומנים^11,12: אחד להחזיק את החיה תוך כדי שאיבת חלב ידנית ואחד לאסוף חלב עם פיפטה; או שהם דורשים ציוד וכלים שאינם זמינים במעבדה. כאן, אנו מדגימים שינוי של טכניקה שתוכננה על ידי DePeters^{ו-Hovey 14}. ניתן להרכיב את המכשיר המשמש בהליך זה בקלות עם ציוד הזמין במעבדה או לרכוש בקלות מספקים נפוצים. באמצעות מכשיר זה, אדם אחד יכול להשיג באופן שגרתי 0.1-0.5 מ"ל חלב עכבר בפחות מ-10 דקות לשימוש ברוב הניתוחים. אספנו חלב ביום השני לאחר הלידה (PD2, הנקה מוקדמת) וביום ה-10 לאחר הלידה (PD10, שיא הנקה) ומדדנו את המאקרו-נוטריינטים של החלב כדי לאמת את השיטה.

Protocol

כל הליכי הטיפול והניסוי בבעלי חיים פעלו בהתאם להנחיות הפדרליות וקיבלו אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ראטגרס. עכברים נקבות (רקע C57BL/6) הזדווגו בגיל 8 שבועות. הם הוזנו במגדל סטנדרטי של צ'או אד ליביטום והוחזקו במחזור רגיל של 12:12 שעות אור: חושך. יום המסירה נספר כיום 1 לאחר המסירה (PD1). ב-PD2 (הנקה מוקדמת) ו-PD10 (שיא הנקה), נדגם חלב כמתואר להלן.

1. הרכבת מכשיר חליבה

1. חבר קצה אחד של צינור הפוליוויניל כלוריד (PVC) בקוטר פנימי (ID) בגודל 5/32 אינץ' למשאבת הוואקום והשתמש בסרט כדי לאבטח את החיבור (מסומן באיור 1A).
   הערה: ניתן להחליף את משאבת הוואקום בכל משאבה מתאימה או בוואקום מרכזי (המכונה לפעמים "ואקום ביתי") הקיים במעבדה.
2. חבר את הקצה השני של צינורות ה-PVC בגודל 5/32 אינץ' לצינורות ה-PVC בגודל 1/8 אינץ' באמצעות מחבר ישר דוקרני.
3. חבר את הקצה השני של צינור ה-PVC בגודל 1/8 אינץ' למחט היפודרמית 18G באמצעות מחבר (מסומן b באיור 1A).
4. חותכים את קצה קצה הפיפטה P200 ~ 0.2 ס"מ ליצירת פתח גדול יותר. הכנס את קצה הפיפטה P200 דרך פתח פקק המחיצה כך שהקצה יצביע כלפי מעלה (איור 1B).
   הערה: החלף את קצות הפיפטות בין בעלי חיים.
5. חבר את פקק המחיצה לצינור איסוף סטרילי. בצע ניקוב דרך פקק המחיצה בעזרת המחט ההיפודרמית 18 G.
6. בדוק את לחץ היניקה על ידי הפעלת משאבת הוואקום והנחת אצבע (מכוסה בכפפת מעבדה) כנגד פתח קצה הפיפטה.
   הערה: אתה אמור להרגיש יניקה עדינה אם היא מורכבת כהלכה. צינור האיסוף, מחט היפודרמית 18 גרם וקצות פיפטה P200 צריכים להיות סטריליים.

איור 1: מכשיר החליבה. (א) מכשיר חליבה עם משאבת ואקום המחוברת למחט היפודרמית 18 גרם באמצעות צינורות PVC. המחט עוברת דרך פקק מחיצה המחובר לצינור איסוף מיקרוצנטריפוגה. קצה פיפטה P-200 הפוך, המשמש לשאיבת חלב מפטמה, מוחדר דרך פתח של פקק המחיצה. (B) תרשים חתך של מכשיר החליבה. (ג) סכר שנחלב בשיטה המתוארת. (D) כמות מייצגת (0.3 מ"ל) של חלב שנאסף מסכר בשיא ההנקה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הפרדת הסכר מגורים

1. ביום החליבה יש להפריד את הסכר מהגורים שלה כדי לאפשר הצטברות חלב בבלוטות.
2. שמור על חום הגורים בקן.
3. יש להמתין שעתיים של הפרדה אם נאסף חלב במהלך ההנקה המוקדמת (למשל, PD2 במחקר זה).
4. אפשר 30-45 דקות של הפרדה אם החלב נאסף במהלך שיא ההנקה (למשל, PD10 במחקר זה).

3. הרדמת הסכר

1. כאשר הסכר מוכן לחליבה, יש להזריק תמיסת קטמין/קסילזין (תוך-צפקית, i.p.) לצד אחד של חלל הצפק^{בין זוג} הפטמות הרביעי^{והחמישי}.
   הערה: כמות תמיסת ההרדמה שיש לתת מחושבת לפי משקל הסכר (80-100 מ"ג/ק"ג קטמין, 5-12 מ"ג/ק"ג קסילזין, על פי פרוטוקול IACUC של אוניברסיטת ראטגרס). מנה זו תרגיע עכבר למשך 45-60 דקות, ותספק מספיק זמן לאיסוף חלב.
2. אשר את ההרדמה על ידי לחיצה חזקה על כף הרגל, אך מבלי לפצוע אותה, כדי לבחון את תפיסת התחושה והכאב של בעל החיים. הרדמה נאותה מסומנת על ידי היעדר תנועה מכל סוג שהוא.
3. מרחו משחה עיניים וטרינרית על עיני הסכר כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה.

4. איסוף חלב

1. הניחו את הסכר המרדים על גבה על משטח עבודה מוצק. נגב בעדינות את אזור החלב שלה עם מגבון סטרילי להכנת אלכוהול כדי לנקות את האזור לפני החליבה.
2. יש לתת 1-2 יחידות של אוקסיטוצין (i.p.)^{בין זוג} הפטמות הרביעי^{והחמישי} בצד חלל הצפק שלא קיבל זריקה.
   הערה: אוקסיטוצין היא מולקולה קטנה שיכולה להיספג במהירות ויש לה זמן מחצית חיים קצר ^14,15. החליבה צריכה להתחיל תוך דקה לאחר ההזרקה.
3. החזיקו את הסכר על ידי קרצוף עדין של אזור הצוואר שלה ביד הלא דומיננטית.
4. שאבו חלב באופן ידני מהפטמה על ידי סחיטת רקמת החלב מהבסיס לקצה הפטמה עד שנראה חרוז חלב.
5. הפעל את מכשיר הוואקום על ידי הפעלת לחצן ההפעלה.
6. התחל לחלוב על ידי מריחה עדינה של קצה הפיפטה P200 ההפוך על פטמה. השתמשו בתנועת משיכה עדינה כדי לסייע בשאיבת חלב (איור 1C).
7. חזור על שלבים 4.4-4.6 על כל הפטמות עד לאיסוף נפח מספיק של חלב.
   הערה: במהלך החליבה, חלב יכול להישאב בטעות למחט ההיפודרמית 18 גרם או לצינורות PVC של קו הוואקום. ניתן לתקן זאת בקלות על ידי החלפת המחט או צינורות ה-PVC לפני חליבת החיה הבאה.

5. התאוששות הסכר לאחר איסוף חלב

1. החזירו את הסכר המורדם לכלוב עם הגורים שלה והתחממו. עקוב אחר החיה עד שהיא חוזרת להכרה.
   הערה: הסכר רשאי לסרב לינוק שוב אם נותנים לה להתעורר בעצמה בכלוב נפרד לפני שהיא חוזרת לגורים שלה. זה נפוץ יותר כאשר איסוף החלב מתרחש במהלך ההנקה המוקדמת (PD2).
2. תנו לסכרים להתרחק מהגורים שלה כדי להתאושש לחלוטין כשהיא תתחיל להתעורר; זו התנהגות נורמלית.
   הערה: אנו צופים בסכרים חוזרים לגורים שלהם מעת לעת וחוזרים לינוק באופן מלא לאחר מספר שעות.

6. ניתוח חלב

1. השתמש בערכת בדיקת לקטוז מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי למדוד את לקטוז החלב. יש לדלל את החלב פי 75 במים סטריליים ולבצע את הבדיקה בהתאם לפרוטוקול הערכה.
2. מדוד את שומן החלב בשיטת creamatocrit שהודגמה בפרסומים אחרים^16,17.
3. העריכו את חלבון החלב על ידי ביצוע בדיקת חלבון ברדפורד¹⁸ עם אלבומין בסרום בקר כסטנדרט¹⁹. לפני ביצוע הבדיקה, צנטריפוגה את החלב ב-4,000 × גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. חלץ את האינפראנטנט על ידי פיפטינג ודלל אותו ל-1:10 במים סטריליים לפני הבדיקה.
4. לבצע אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד (PAGE); הפרד 10 מיקרוגרם חלבון על ג'ל ביס-טריס 4%-12% לפי הוראות היצרן. העבירו את החלבונים על ממברנות פלואוריד פוליווינילידן (PVDF) וצבעו אותם ב-Coomassie Blue R-250.

תוצאות

באמצעות טכניקה זו, דגמנו בהצלחה מספיק חלב בזמנים שונים במהלך 21 יום הנקה. אנו מחשיבים את יום הלידה ליום 1 לאחר הלידה (PD1), ובעבודה זו דגמנו חלב על PD2 (הנקה מוקדמת) ו-PD10 (שיא הנקה), n = 4 כל אחד. השגנו בנוחות 0.1-0.5 מ"ל חלב מכל סכר (איור 1D). כדי לאמת שיטה זו, מדדנו את ההרכב הגולמי של דגימות החלב הללו והשווינו את ההבדלים בין חלב שנאסף בתחילת ההנקה לשיא ההנקה באמצעות מבחן t של סטודנט.

מצאנו שריכוז הלקטוז בחלב היה בממוצע 12.3 ± 0.6 גרם לליטר ב-PD2 ו-12.0 ±-0.9 גרם לליטר ב-PD10 (טבלה 1). אחוז השומן בחלב היה 26.0 ±-1.0% ו-33.4 ±-2.5% ב-PD2 ו-PD10, בהתאמה. ריכוז השומן היה 174.4 ±-7.1 גרם/ליטר ב-PD2 וגבוה משמעותית, 224.4 ±-17.1 גרם/ליטר ב-PD10 (טבלה 1). תכולת החלבון הממוצעת הייתה 70.1 ±-5.2 גרם/ליטר ב-PD2 ו-75.1 ±-2.6 גרם/ליטר ב-PD10 (טבלה 1). למרות שתכולת חלבון החלב הכוללת לא הייתה שונה בין PD2 ל-PD10, השפע היחסי של חלבון חלב בודד היה שונה. באופן ספציפי, αS1-קזאין וחלבון חומצי מי גבינה היו גבוהים יותר בחלב PD10 מאשר בחלב PD2 (p < 0.05), בעוד ש-β-קזאין (p < 0.05) הראו שכיחות גבוהה יותר ב-PD2 מאשר PD10 (איור 2).

איור 2: ניתוח חלבון חלב. (A) ניתוח PAGE מוכתם כחול של Coomassie של חלב שנאסף ב-PD2 ו-PD10. זיהוי החלבון נעשה כמתואר קודם לכן¹⁴. (B) אותות חלבון בודדים נותחו ב-ImageJ ונורמלו לחלבון הכולל המוכתם. התוצאות בוטאו כממוצע עם קווי שגיאה סטנדרטיים ונקודות נתונים בודדות כנקודות. השכיחות הממוצעת של כל חלבון ב-PD2 ו-PD10 הושוותה באמצעות מבחן Student's t דו-זנבי. *p < 0.05, n = 4. קיצורים: PAGE = אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד; PDn = יום לאחר המסירה n. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

		ממוצע	SEM	ערך p
לקטוז (גרם/ליטר)	PD2	12.3	0.6	0.75
	PD10	12.0	0.9
שומן (גרם/ליטר)	PD2	174.4	7.1	0.04
	PD10	224.4	17.1
חלבון (גרם/ליטר)	PD2	70.1	5.2	0.42
	PD10	75.1	2.6

טבלה 1: הרכב מקרו-נוטריינטים של חלב שנאסף ב-PD2 ו-PD10. התוצאות, שהתבטאו כממוצע וטעות התקן של הממוצע (SEM), נותחו כדי לבחון את ההשפעות של יום ההנקה על הרכב החלב באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי, n = 4.

Discussion

הדגמנו טכניקת חליבה מותאמת שיכולה להתבצע על ידי אדם אחד באמצעות מכשיר שניתן להרכיב ונייד בקלות. באופן מסורתי, חלב מכרסמים נאסף באמצעות צינורות נימיים^10,17, פיפטות פסטר מזכוכית¹² או מיקרופיפטות¹¹. שיטות אלה דורשות מאדם אחד לרסן את הסכר ולשאוב חלב באופן ידני ואחר לאסוף חלב. לפעמים זה יכול להיות מאתגר, במיוחד כאשר דגימת חלב מתרחשת בסופי שבוע או חגים. חלב שנאסף בשיטות אלה חייב להיות מועבר לצינורות אחסון סטריליים. מכיוון שחלב מכרסמים עשיר יחסית בשומן (כפי שמוצג כאן ובמחקרים אחרים^20,21), ולכן צמיג, תהליך העברת החלב מביא ככל הנראה לאובדן נפח החלב, מה שמגביל את כמויות הניתוח. ניתן להרכיב את המכשיר המתואר כאן תוך פחות מחמש דקות עם כלים הזמינים במעבדה. אדם אחד יכול להשתמש בו בקלות כדי לדגום נפח חלב מספיק תוך 10 דקות. גישת היניקה העדינה המתמשכת הקשורה לשיטה זו מקלה על נושא אובדן הדגימה עקב העברה, מכיוון שחלב נמשך כל הזמן ישר לתוך צינור איסוף. מזעור אובדן הדגימה חשוב במיוחד בעת איסוף חלב כבר ב-PD2 מכיוון שתפוקת החלב ידועה כנמוכה יחסית בשלב^{זה 10}. יתר על כן, אותו מכשיר ופרוטוקול שימשו לאיסוף מוצלח של חלב מזן עכבר אחר (רקע FVB/N), מה שמצביע על כך ששיטה זו ככל הנראה עובדת באותה מידה על פני זני עכברים.

במחקר זה, ראינו גם שזמן ההפרדה עשוי להשתנות בהתאם לשלב ההנקה. מחקרים קודמים מדווחים כי יש להפריד את הסכרים מהגורים שלהם לפחות שעתיים ועד 16 שעות לפני איסוף החלב כדי להשיג נפח חלב מספיק^11,13. כאשר השתמשנו בשיטה זו, מצאנו שהפרדת סכרים מהגורים שלהם למשך שעתיים בהנקה מוקדמת (PD2) ולמשך 30-45 דקות בלבד בשיא ההנקה (PD10) הייתה מספיקה כדי להשיג נפח מספיק של חלב. מכיוון שלוקח לסכר זמן נוסף להתאושש מההרדמה, מזעור משך ההפרדה לא רק מפחית את זמן הדגימה אלא גם מפחית את ההשפעה הפוטנציאלית שהוא עלול להוות על הסכר ועל הגורים שלה.

בנוסף, מצאנו שאיסוף חלב כבר ב-PD2 עלול להשפיע לרעה על הגדילה הבאה של הגורים עקב זמן ההפרדה וההתאוששות הארוך של הסכר, מה שמוביל לתקופה של הזנה לא מספקת. זה לא נצפה כאשר חלב נדגם בשיא ההנקה (PD10). לכן, אם חוקר מעוניין לדגום חלב בנקודות זמן שונות במהלך תקופת ההנקה של 21 יום, רצוי לדגום חלב הנקה מוקדמת ממערכת נפרדת של סכרים. איסוף חלב, לעומת זאת, יכול להתבצע על אותו סכר מספר פעמים במהלך שיא ההנקה וההנקה המאוחרת למחקרי אורך.

לחלופין, חוקרים עשויים לבחור בחומרי הרדמה אחרים כדי למזער את זמן ההחלמה של הסכר. לדוגמה, שאיפת איזופלורן עשויה לעזור להפחית את זמן ההחלמה מכיוון שבעלי חיים בדרך כלל מתאוששים במהירות עם הפסקת איזופלורן²². למרות שבחירה זו של הרדמה מבוצעת על ידי^{רבים 13,23}, דווח כי שאיפת איזופלורן עלולה להשפיע לרעה על נפח החלב שנאסף¹³. בנוסף, שאיפת איזופלורן דורשת מכשיר מתאים כדי להבטיח שליטה מדויקת במינון. המחקר על ההשפעות של חומרי הרדמה כגון קטמין/קסילזין ואיזופלורן על הנקה והרכב החלב והעברתם הפוטנציאלית לחלב אם מוגבל 24,25,26. לכן, מומלץ לבצע בזהירות פרשנות נתונים בעת השוואת מחקרים המשתמשים באפשרויות שונות של הרדמה. חלופה נוספת היא דגימת חלב ללא הרדמה, כפי שתוארו על ידי חוקרים אחרים 14,27,28,29. עם זאת, הליך זה עלול לגרום ללחץ עודף על הסכר ולדרוש מאדם נוסף לרסן את החיה.

מחקר זה הראה גם שניתן לבצע בדיקות מקרו-נוטריינטים באמצעות דגימות החלב, כאשר נותר עודף להליכים נוספים כגון ניתוחי אומיקס. רמות החלב, הלקטוז, החלבון והשומן נמדדו והושוו לנתונים שפורסמו כדי לאמת את השיטה המתוארת. ריכוז הלקטוז בחלב היווה ~1.2% ממרכיב החלב, הדומה לזה של עכברים בדיאטת ביקורת שדווחה במחקרים אחרים 30,31,32. חלב עכברים אושר כבעל אחוז שומן גבוה, שנע בין 26% ל-33%, כפי שדווח בעבר^20,30. ריכוז החלבון הכולל שדווח כאן היה דומה לזה שדווח על ידי Chen et ^al.30 אך נמוך מזה שדווח במחקרים אחרים^31,32. מבחינת השינויים מתחילת ההנקה לשיא, מצאנו שרמות הלקטוז והחלבון נשארו קבועות יחסית, אך אחוז השומן בחלב עלה מתחילת ההנקה לשיא. זה לא מסכים עם Ragueneau³², אבל הפער עשוי לנבוע מהבדלים בגודל המדגם. למרות שריכוז החלבון הכולל היה דומה בין הנקה מוקדמת לשיא, מצאנו ששפע החלבון הבודד (αS1-קזאין, β-קזאין וחלבון חומצי מי גבינה) השתנה, ככל הנראה משקף שינויים בצרכי היילודים בשלבי התפתחות שונים.

למרות שטכניקה זו אינה מאפשרת כימות של ייצור החלב, ניתן לחשב זאת באמצעות מדד הביצועים (IOP) שהוצע על ידי פלקונר ב-1947³³. ייצור החלב תלוי מאוד בגודל המלטה וביום הדגימה. מדד זה יכול לשמש כמדידה של ייצור החלב תוך התחשבות בהבדלים בגודל המלטה. לדוגמה, ניתן לשקול את כל ההמלטה על PD10 (כאשר הסכר מופרד לדגימת חלב). לאחר מכן מחושב ה-IOP של סכר על ידי חלוקת משקל ההמלטה שלה במשקל הממוצע של המלטות באותו גודל ב-PD10. לסיכום, אנו מדגימים טכניקה יעילה של אדם אחד לדגימת חלב מעכברי מעבדה באמצעות מכשיר שניתן להרכיב בקלות עם ציוד זול יחסית וזמין. טכניקה זו מאפשרת איסוף עקבי של כמויות מספיקות של חלב עבור רוב הניתוחים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL cryogenic vials	Corning	430658	Preferred for early milk collection
1 mL syringe	Exel	26048
2 mL microcentrifuge collecting tube	Fisher Scientific	02-681-344	Preferred for peak and late milk collection
18 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305195
27 G hypodermic needle	BD PrecisionGlide	305109
Alcohol prep wipe	Honeywell	154818
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Immobilon -P PVDF Membrane	Immobilon	IPVH00010
Ketamine	Dechra	1000001250	Purchased via Veternarian Office
Laboratory labeling tape	VWR International	89097
Lactose Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK487
Mini Barbed polypropylene fittings	Cole-Parmer Instrument Company	6365-90
Mouse diet	Lab Diet	5015
NuPAGE Bis-Tris Mini Protein Gels, 4–12%	Invitrogen	NP0335BOX
Optixcare Eye Lube	Aventix	N/A	Purchased via Veternarian Office
Oxytocin	Bimeda	1OXY015	Purchased via Veternarian Office
P200 pipette tips	Gilson	F1733001
PVC tubing: 1/8'' ID	VWR International	MFLX07407-75
PVC tubing: 5/32'' ID	VWR International	MFLX07407-77
Septum stopper	Chemglass Life Sciences	CG-3022-91
Vacuum pump	Drummond Scientific Co.	P-103635
Xylazine	Akorn Animal Health	NDC 59399-110-20	Purchased via Veternarian Office