A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
نقدم بروتوكول تمايز ثلاثي الأبعاد (3D) في المختبر يولد مجالات عصبية ذات حجم قابل للتكرار لإنتاج خلايا قمة عصبية قحمية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. نوضح أن هذه المنهجية تقلل من التباين مقارنة بالبروتوكولات السابقة وكيف يمكن استخدامها في الفحص متعدد الإرسال لدراسة تطور خلايا القمة العصبية القحفية.
بفضل قدرتها الرائعة على توليد كل من مشتقات الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة ، جذبت خلايا القمة العصبية القحفية (CNCC) الكثير من الاهتمام بدراسة الآليات التي تنظم قرارات مصير الخلية واللدونة. تنشأ هذه الخلايا في الظهارة العصبية الظهرية ، وهي عابرة ونادرة نسبيا في الجنين النامي - مما يجعل الاختبارات الوظيفية والشاشات الجينومية وفحوصات الكيمياء الحيوية صعبة في الجسم الحي. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير عدة طرق لنمذجة تطوير CNCC في المختبر. توفر طرق الاستزراع القائمة على الغلاف العصبي (NS) بيئة مكروية معقدة تلخص الظهارة العصبية الأمامية النامية في 3D. تسمح هذه الأنظمة بنمو العديد من NS في نفس اللوحة لتوليد كمية كبيرة من CNCC ، لكن NS المنتج يمثل تباينا كبيرا في الشكل والحجم وعدد CNCC المكونة - مما يجعل إجراء المقايسات الكمية صعبة. يحدد هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لتوليد NS من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESC) بتنسيق 96 بئرا. ينتج NS المتولد في صفائح 96 بئرا خلايا قمة عصبية قحفية (CNCC) ، والتي يمكن زراعتها بشكل أكبر. من خلال التحكم في عدد خلايا البداية ، يقلل هذا النهج من التباين في الحجم والشكل بين NS ويزيد من قابلية التكاثر عبر التجارب. أخيرا ، نظام الثقافة هذا قابل للتكيف مع العديد من التطبيقات ويوفر درجة أعلى من المرونة ، مما يجعله قابلا للتخصيص بدرجة كبيرة ومناسبا لتعدد الإرسال في الظروف التجريبية.
خلايا القمة العصبية القحفية (CNCC) هي مجموعة خلايا شبيهة بالجذع تنشأ في الجزء الأمامي من الجنين النامي ، عند الحدود بين الصفيحة العصبية والأديم الظاهرالسطحي 1. ثم يخضع CNCC لانتقال ظهاري إلى لحمة متوسطة (EMT) ، ويتفكك من الظهارة العصبية ، ويهاجر ظهريا البطنيا نحو مواقع مختلفة في الجنين حيث يتمايزون إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا2. تعتبر دراسة هذه المجموعة من الخلايا ذات أهمية كبيرة لأنها تمتلك مرونة رائعة3 وقدرة فريدة على التمايز إلى كل من مشتقات الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة ، مثل العظام القحفية الوجهية والغضاريف4. على الرغم من أن CNCC يمكن الوصول إليها نسبيا في الجنين ، إلا أنها مجموعة عابرة مع عدد قليل من الخلايا ، مما يجعل من الصعب إجراء الدراسات الميكانيكية الجهازية في الجسم الحي. تم عزل خطوط خلايا CNCC وتمييزها في السنوات القليلة الماضية للتغلب على هذه القيود. على وجه الخصوص ، يعد خط خلايا O9-1 CNCC أداة رائعة لدراسة تطور القمة العصبية المهاجرة وما بعد الهجرة5،6 ؛ ومع ذلك ، فإن خط الخلية هذا لا يسمح بدراسة الأحداث المبكرة قبل الهجرة مما يؤدي إلى تحريض القمة العصبية ومواصفاتها. في هذا الصدد ، كانت هناك تطورات مهمة في تطوير بروتوكولات التمايز في المختبر للتمييز بين CNCC في طبق من خلال استخدام هياكل ثلاثية الأبعاد تشبه الظهارة العصبية النامية المسماة المجالات العصبية (NS) 7،8- التي تم الحصول عليها بعد تمايز مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية (ESC). تنتج هذه البروتوكولات ثلاثية الأبعاد بقوة أعدادا كبيرة من CNCC ، مما يسمح بإجراء دراسات ميكانيكية كيميائية حيوية وجينومية9،10. يتم استزراع NS على ألواح منخفضة التعلق في وسط مكمل N2B27 ، جنبا إلى جنب مع عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) وعامل نمو البشرة (EGF) 10،11 لتحفيز تكاثر الخلايا. يتم تنفيذ هذه البروتوكولات في أطباق بتري ، وزراعة العديد من NS في نفس الطبق. داخل NS المتنامي ، تتجمع الخلايا وتستمر في الانقسام - تصل إلى قطر 100-200 ميكرومتر عند النضج. عند النضج (حوالي اليوم 5) ، تلتصق NS بالركيزة وتتمايز إلى CNCC تشبه نظرائها في الجسم الحي 9،12. ثم تخضع CNCC هذه ل EMT وتفكيكها على سطح اللوحة. يمكن ملاحظة الاختلافات المورفولوجية اعتمادا على حجم NS ، حيث ستظهر الكرات الأكبر أغمق في القلب بسبب انخفاض توافر العناصر الغذائية والأكسجين ، مما يؤدي إلى خضوع الخلايا لموت الخلاياالمبرمج 13. في حين أن هذا النوع من الإجراءات يولد عددا كبيرا من CNCC في نهاية التمايز ، إلا أنه يمثل العديد من القيود ، مما يجعل دراسة الديناميكيات الجزيئية المختلفة التي تحدث أثناء عملية التمايز شبه مستحيلة. أولا ، استخدام مستعمرات ESC - التي تختلف في الحجم - يجعل من الصعب التحكم في عدد خلية البداية لكل تجربة. ينتج عن هذا توليد NS من مختلف الأشكال والأقطار التي تتطور بشكل مختلف عن طريق تنشيط مسارات إشارات محددة ، مما يؤدي إلى تغيير تمايز الخلايا ، وبالتالي عدم تكوين عينة موحدة في نقطة زمنية معينة. ثانيا ، غالبا ما يؤدي زراعة NS متعددة في نفس اللوحة إلى اندماجهممعا 14 وربما إطلاق جزيئات إشارات تؤثر على البيئة الدقيقة لجيرانهم ، وبالتالي تطورهم. إجمالا ، تولد هذه الإجراءات الكثير من التباين بين العينات والتجارب.
هنا ، نقدم استراتيجية للتغلب على هذه الصعوبات التي تولد NS مفردة - قادرة على إنتاج CNCC - عن طريق تجميع ESC للفأر (mESC) في ألواح 96 بئرا ذات قاع U غير معالج ب TC. يسمح البدء من mESC بدراسة عملية المواصفات والمراحل المبكرة من تطوير CNCC مقارنة بالبدء من خطوط خلايا القمة العصبية التي تم إنشاؤها بالفعل. يبدأ هذا البروتوكول بتفكيك مستعمرات mESC للحصول على معلق خلية واحدة ، متبوعا ببذر عدد محدد من mESC في كل بئر من صفيحة 96 بئرا معالجة على شكل حرف U غير TC. تترك الخلايا لتتجمع لمدة يومين ثم يتم نقلها لاحقا إلى صفيحة مسطحة القاع غير المعالجة ب TC مكونة من 96 بئرا ، حيث ستتمكن NS من التصاق بقاع اللوحة. من خلال التحكم في عدد خلية البداية والبيئة المكروية لكل NS أثناء عملية التمايز ، يقلل هذا البروتوكول من تباين العينة ، مما يزيد من قابلية التكاثر التجريبي. نعتقد أن هذه ستكون منصة ملائمة لتصميم تجارب متعددة الإرسال ، مثل اختبار تأثير ظروف الاستزراع المختلفة أو إجراء شاشات اضطراب الجينات.
1. توليد تعليق أحادي الخلية من مستعمرات ESC للفأر
ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول مع استخدام CK35 mESC (خط mESC مختص بنقل الخط الجرثومي ، للحصول على خيار التطوير في الجسم الحي نماذج15) المزروعة على مغذيات معطلة في صفيحة TC معالجة بالجيلاتين 6 آبار. يجب أن ينتج عن بئر واحد من صفيحة 6 آبار معالجة TC حوالي 1.5 × 106 mESC ، وهو ما يكفي لبقية البروتوكول. يمكن توسيع نطاق هذا إذا لزم الأمر. اضبط الخطوات الأولية وفقا لطريقة ثقافة الإجهاد والصيانة ESC المختارة ، بالإضافة إلى وسط الاستزراع المناسب. يجب تنفيذ هذا البروتوكول في ظل ظروف معقمة. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل تتعلق بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
2. النقل إلى صفيحة مسطحة القاع 96 بئر لتمايز CNCC
3. مرور وصيانة CNCC
ملاحظة: يمكن إجراء تمرير CNCC بمجرد وجود كمية كافية من الخلايا المرئية حول NS. يمكن أن يكون هذا في وقت مبكر من اليوم 7 ، حيث لا توفر النقاط الزمنية السابقة كمية كافية من CNCC.
4. تثبيت NS وتركيبها للتألق المناعي
5. تثبيت CNCC وتركيبه للتألق المناعي
باتباع البروتوكول ، تم فصل مستعمرات mESC ، وتم زرع 3000 خلية في صفائح 96 بئر U المعالجة ب 96 بئر غير TC. في اليوم 2 ، تم نقل NS المجمعة إلى ألواح مسطحة القاع غير المعالجة ب TC من 96 بئرا للسماح لها بالارتباط. يتم توفير تصور مبسط لبروتوكول تجميع NS في الشكل 1 أ. تم استزراع NS...
تسمح نماذج التمايز ثلاثية الأبعاد في المختبر بتحليل تفاعلات الخلايا المعقدة التي قد تكون صعبة - أو لا يمكن ملاحظتها - في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد. تم تطوير العديد من النماذج لدراسة تطور CNCC في المختبر. هذه مشتقة بشكل عام مباشرة من مستعمرات ESC7،...
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
نشكر الدكتور ريمي كزافييه كوكس على المشورة بشأن تصميم التمهيدي والخبرة في زراعة الخلايا. تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الأوروبي للبحوث (ERC Start Grant 101039995 - REGENECREST) ومؤسسة البحث الطبي AJE202205015403.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm syringe filters | ClearLine | 146560 | |
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter Tips | Dutscher | 713263 | |
40 µm filters | Falcon | 352340 | |
5 mL Serological pipette | Starstedt | 86.1253.001 | |
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352070 | |
Accutase | Merck-Sigma | A6964 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L) | Thermofisher Scientific | A21206 | |
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L) | Thermofisher Scientific | A21203 | |
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L) | Thermofisher Scientific | A31571 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Merck-Sigma | A5955 | |
B27 PLUS supplement | Thermofisher Scientific | 17504044 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Merck-Sigma | A9418 | |
Chloroform | Carlo Erba | 438601 | |
Collagenase Type IV | Thermofisher Scientific, Gibco | 17104019 | |
Costar 6 well clear TC-treated multiple well plates | Corning | 3516 | |
Cover glasses, round | VWR | 630-2113 | |
DMEM KnockOut | Thermofisher Scientific | 10829018 | |
DMEM/F12+Glutamax | Thermofisher Scientific | 10565018 | |
DMEM high glucose | Merck-Sigma | D0822 | |
DNA LoBind Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30108078 | |
DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher Scientific | 14190144 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30121023 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
ESGRO mLIF Medium Supplement | Merck-Sigma | ESG1107 | |
Ethanol 70% | Carlo Erba | 528170 | |
Fetal Bovine Serum | Merck-Sigma | F7524 | |
Fibronectin | Merck-Sigma | F085-2MG | |
Fluoromount-G | Invitrogen | 00-4958-02 | |
Gelatin solution | Merck-Sigma | ES-006-B | |
GlutaMAX | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
Human EGF | Peprotech | AF-100-15-500UG | |
Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
Human SOX9 Antibody | R&Dsystems | AF3075 | |
Insulin from bovine pancreas | Merck-Sigma | I6634 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Biorad | 1708891 | |
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, Unconjugated | DSHB | 3B5 | |
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, Unconjugated | DSHB | PAX7 | |
N2 supplement | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
Neurobasal Medium | Thermofisher Scientific | 21103049 | |
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottom | Falcon | 351172 | |
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottom | Falcon | 351177 | |
Paraformaldehyde 16% solution, em grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Propan-2-ol | Carlo Erba | 415154 | |
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) Antibody | Biolegend | MMS-435P | |
RapiClear 1.47 | Sunjin Lab | RC147001 | |
RapiClear 1.52 | Sunjin Lab | RC152001 | |
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 m | Clear fibreless double sided tape | ||
SensiFAST SYBR No-ROX Kit | Meridian Bioscience | BIO-98020 | |
Sterile Disposable Surgical Scalpels | Swann-Morton | 05XX | |
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
Triton X-100 | Thermofisher Scientific | A16046.AP | |
TRIzol Reagent | FisherScientific | 15596026 | |
Trypsine-EDTA (0.05%) | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | 10113103 | |
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated) | Cell signaling technology | E7E2G | |
β-mercaptoethanol | Thermofisher Scientific | 31350010 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved