JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكول تمايز ثلاثي الأبعاد (3D) في المختبر يولد مجالات عصبية ذات حجم قابل للتكرار لإنتاج خلايا قمة عصبية قحمية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر. نوضح أن هذه المنهجية تقلل من التباين مقارنة بالبروتوكولات السابقة وكيف يمكن استخدامها في الفحص متعدد الإرسال لدراسة تطور خلايا القمة العصبية القحفية.

Abstract

بفضل قدرتها الرائعة على توليد كل من مشتقات الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة ، جذبت خلايا القمة العصبية القحفية (CNCC) الكثير من الاهتمام بدراسة الآليات التي تنظم قرارات مصير الخلية واللدونة. تنشأ هذه الخلايا في الظهارة العصبية الظهرية ، وهي عابرة ونادرة نسبيا في الجنين النامي - مما يجعل الاختبارات الوظيفية والشاشات الجينومية وفحوصات الكيمياء الحيوية صعبة في الجسم الحي. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير عدة طرق لنمذجة تطوير CNCC في المختبر. توفر طرق الاستزراع القائمة على الغلاف العصبي (NS) بيئة مكروية معقدة تلخص الظهارة العصبية الأمامية النامية في 3D. تسمح هذه الأنظمة بنمو العديد من NS في نفس اللوحة لتوليد كمية كبيرة من CNCC ، لكن NS المنتج يمثل تباينا كبيرا في الشكل والحجم وعدد CNCC المكونة - مما يجعل إجراء المقايسات الكمية صعبة. يحدد هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لتوليد NS من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESC) بتنسيق 96 بئرا. ينتج NS المتولد في صفائح 96 بئرا خلايا قمة عصبية قحفية (CNCC) ، والتي يمكن زراعتها بشكل أكبر. من خلال التحكم في عدد خلايا البداية ، يقلل هذا النهج من التباين في الحجم والشكل بين NS ويزيد من قابلية التكاثر عبر التجارب. أخيرا ، نظام الثقافة هذا قابل للتكيف مع العديد من التطبيقات ويوفر درجة أعلى من المرونة ، مما يجعله قابلا للتخصيص بدرجة كبيرة ومناسبا لتعدد الإرسال في الظروف التجريبية.

Introduction

خلايا القمة العصبية القحفية (CNCC) هي مجموعة خلايا شبيهة بالجذع تنشأ في الجزء الأمامي من الجنين النامي ، عند الحدود بين الصفيحة العصبية والأديم الظاهرالسطحي 1. ثم يخضع CNCC لانتقال ظهاري إلى لحمة متوسطة (EMT) ، ويتفكك من الظهارة العصبية ، ويهاجر ظهريا البطنيا نحو مواقع مختلفة في الجنين حيث يتمايزون إلى مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا2. تعتبر دراسة هذه المجموعة من الخلايا ذات أهمية كبيرة لأنها تمتلك مرونة رائعة3 وقدرة فريدة على التمايز إلى كل من مشتقات الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة ، مثل العظام القحفية الوجهية والغضاريف4. على الرغم من أن CNCC يمكن الوصول إليها نسبيا في الجنين ، إلا أنها مجموعة عابرة مع عدد قليل من الخلايا ، مما يجعل من الصعب إجراء الدراسات الميكانيكية الجهازية في الجسم الحي. تم عزل خطوط خلايا CNCC وتمييزها في السنوات القليلة الماضية للتغلب على هذه القيود. على وجه الخصوص ، يعد خط خلايا O9-1 CNCC أداة رائعة لدراسة تطور القمة العصبية المهاجرة وما بعد الهجرة5،6 ؛ ومع ذلك ، فإن خط الخلية هذا لا يسمح بدراسة الأحداث المبكرة قبل الهجرة مما يؤدي إلى تحريض القمة العصبية ومواصفاتها. في هذا الصدد ، كانت هناك تطورات مهمة في تطوير بروتوكولات التمايز في المختبر للتمييز بين CNCC في طبق من خلال استخدام هياكل ثلاثية الأبعاد تشبه الظهارة العصبية النامية المسماة المجالات العصبية (NS) 7،8- التي تم الحصول عليها بعد تمايز مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية (ESC). تنتج هذه البروتوكولات ثلاثية الأبعاد بقوة أعدادا كبيرة من CNCC ، مما يسمح بإجراء دراسات ميكانيكية كيميائية حيوية وجينومية9،10. يتم استزراع NS على ألواح منخفضة التعلق في وسط مكمل N2B27 ، جنبا إلى جنب مع عامل نمو الخلايا الليفية (FGF) وعامل نمو البشرة (EGF) 10،11 لتحفيز تكاثر الخلايا. يتم تنفيذ هذه البروتوكولات في أطباق بتري ، وزراعة العديد من NS في نفس الطبق. داخل NS المتنامي ، تتجمع الخلايا وتستمر في الانقسام - تصل إلى قطر 100-200 ميكرومتر عند النضج. عند النضج (حوالي اليوم 5) ، تلتصق NS بالركيزة وتتمايز إلى CNCC تشبه نظرائها في الجسم الحي 9،12. ثم تخضع CNCC هذه ل EMT وتفكيكها على سطح اللوحة. يمكن ملاحظة الاختلافات المورفولوجية اعتمادا على حجم NS ، حيث ستظهر الكرات الأكبر أغمق في القلب بسبب انخفاض توافر العناصر الغذائية والأكسجين ، مما يؤدي إلى خضوع الخلايا لموت الخلاياالمبرمج 13. في حين أن هذا النوع من الإجراءات يولد عددا كبيرا من CNCC في نهاية التمايز ، إلا أنه يمثل العديد من القيود ، مما يجعل دراسة الديناميكيات الجزيئية المختلفة التي تحدث أثناء عملية التمايز شبه مستحيلة. أولا ، استخدام مستعمرات ESC - التي تختلف في الحجم - يجعل من الصعب التحكم في عدد خلية البداية لكل تجربة. ينتج عن هذا توليد NS من مختلف الأشكال والأقطار التي تتطور بشكل مختلف عن طريق تنشيط مسارات إشارات محددة ، مما يؤدي إلى تغيير تمايز الخلايا ، وبالتالي عدم تكوين عينة موحدة في نقطة زمنية معينة. ثانيا ، غالبا ما يؤدي زراعة NS متعددة في نفس اللوحة إلى اندماجهممعا 14 وربما إطلاق جزيئات إشارات تؤثر على البيئة الدقيقة لجيرانهم ، وبالتالي تطورهم. إجمالا ، تولد هذه الإجراءات الكثير من التباين بين العينات والتجارب.

هنا ، نقدم استراتيجية للتغلب على هذه الصعوبات التي تولد NS مفردة - قادرة على إنتاج CNCC - عن طريق تجميع ESC للفأر (mESC) في ألواح 96 بئرا ذات قاع U غير معالج ب TC. يسمح البدء من mESC بدراسة عملية المواصفات والمراحل المبكرة من تطوير CNCC مقارنة بالبدء من خطوط خلايا القمة العصبية التي تم إنشاؤها بالفعل. يبدأ هذا البروتوكول بتفكيك مستعمرات mESC للحصول على معلق خلية واحدة ، متبوعا ببذر عدد محدد من mESC في كل بئر من صفيحة 96 بئرا معالجة على شكل حرف U غير TC. تترك الخلايا لتتجمع لمدة يومين ثم يتم نقلها لاحقا إلى صفيحة مسطحة القاع غير المعالجة ب TC مكونة من 96 بئرا ، حيث ستتمكن NS من التصاق بقاع اللوحة. من خلال التحكم في عدد خلية البداية والبيئة المكروية لكل NS أثناء عملية التمايز ، يقلل هذا البروتوكول من تباين العينة ، مما يزيد من قابلية التكاثر التجريبي. نعتقد أن هذه ستكون منصة ملائمة لتصميم تجارب متعددة الإرسال ، مثل اختبار تأثير ظروف الاستزراع المختلفة أو إجراء شاشات اضطراب الجينات.

Protocol

1. توليد تعليق أحادي الخلية من مستعمرات ESC للفأر

ملاحظة: تم تكييف هذا البروتوكول مع استخدام CK35 mESC (خط mESC مختص بنقل الخط الجرثومي ، للحصول على خيار التطوير في الجسم الحي نماذج15) المزروعة على مغذيات معطلة في صفيحة TC معالجة بالجيلاتين 6 آبار. يجب أن ينتج عن بئر واحد من صفيحة 6 آبار معالجة TC حوالي 1.5 × 106 mESC ، وهو ما يكفي لبقية البروتوكول. يمكن توسيع نطاق هذا إذا لزم الأمر. اضبط الخطوات الأولية وفقا لطريقة ثقافة الإجهاد والصيانة ESC المختارة ، بالإضافة إلى وسط الاستزراع المناسب. يجب تنفيذ هذا البروتوكول في ظل ظروف معقمة. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل تتعلق بجميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. ابدأ من mESC عند التقاء 70٪ -80٪ يزرع في وسط استزراع mESC. انظر الجدول 1 للاطلاع على تكوين وسط استزراع mESC المستخدم في هذه الدراسة.
    ملاحظة: لا تدع mESC ينمو بنسبة تزيد عن 80٪ من التقاء ، حيث سيبدأون في التمايز ، وسيؤثر ذلك على عملية التجميع. يجب أن تكون المستعمرات مضغوطة وتظهر مورفولوجيا صحية (لا توجد تشققات أو موجات ، تباين مميز بين السيتوبلازم النووي).
  2. تحضير وسيط التمايز CNCC. انظر الجدول 1 للاطلاع على تكوين وسيط التمايز CNCC.
    ملاحظة: بمجرد إضافة عوامل النمو ، يمكن تخزين الوسط لمدة تصل إلى 3 أسابيع عند 4 درجات مئوية. تأكد من حماية الوسيط من الضوء.
  3. تحضير محلول كولاجيناز طازج بتركيز 2 مجم / مل في وسط DMEM-Knockout.
    ملاحظة: يضمن استخدام الكولاجيناز فصل المستعمرات فقط وليس المغذيات ، حيث أن وجودها في الخطوات التالية سيتداخل مع تجميع NS. قم بتصفية محلول الكولاجيناز قبل الاستخدام باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
  4. استنشق وسيط ESC من mESC.
  5. أضف برفق 1 مل من PBS إلى جانب البئر. هز الطبق برفق لضمان الغسيل المتساوي.
  6. قم بإزالة PBS واستبدلها ب 2 مل من محلول الكولاجيناز. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة.
    1. افحص اللوحة تحت المجهر الضوئي بتكبير 10 أضعاف بعد أول 20 دقيقة ثم كل 5 دقائق.
    2. عندما تظهر المستعمرات حوافا ملفوفة ، انقر بقوة على جانب اللوحة ، وسوف تنفصل المستعمرات.
  7. باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل ، اجمع المستعمرات وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    ملاحظة: افحص اللوحة تحت المجهر الضوئي بحثا عن بقايا المستعمرات. يمكن جمعها بغسل PBS.
  8. الطرد المركزي للمستعمرات عند 16 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. استنشق أكبر قدر ممكن من الوسط من الأنبوب المخروطي ، مع الحرص على عدم إزعاج المستعمرات الموجودة في قاع الأنبوب.
  10. أضف 1 مل من محلول التربسين 0.05٪ واحتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  11. قم بفصل المستعمرات في الأنبوب عن طريق سحب العينات بقوة لأعلى ولأسفل ، أولا باستخدام p1000 ثم باستخدام ماصة دقيقة p200.
    ملاحظة: هذا يضمن ثبات نظام التعليق أحادي الخلية.
  12. أضف 2 مل من وسط استزراع mESC لمنع التربسين ، والطرد المركزي عند 160 × جم لمدة 3 دقائق في RT. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 1 مل من وسط التمايز CNCC.
  13. عد الخلايا باستخدام جهاز عد الخلايا الآلي أو نظام موحد تحت المجهر ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  14. بعد العد ، قم بتخفيفه بوسيط تمايز CNC كاف للحصول على تركيز 3000 خلية حية لكل 50 ميكرولتر.
  15. باستخدام ماصة دقيقة p200 ، قم بزرع 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة 96 بئر U المعالجة غير TC ، ثم قم بتعبئة البئر حتى 200 ميكرولتر بوسط تمايز CNCC.
    ملاحظة: أثناء ملء اللوحة، أعد تعليق معلق الخلية المفردة من وقت لآخر باستخدام ماصة دقيقة p1000 للحصول على تركيز متجانس.
  16. احتضن طوال الليل في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.

2. النقل إلى صفيحة مسطحة القاع 96 بئر لتمايز CNCC

  1. في اليوم التالي (اليوم 1) ، راقب اللوحة تحت المجهر الضوئي. تأكد من أن مجموعة خلايا صغيرة ذات حدود واضحة مرئية في قاع كل بئر. ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة طوال الليل.
    ملاحظة: قد تكون هناك بعض الخلايا حول الركام الرئيسي ، وبعضها ميت. لن يتداخل هذا مع تجميع NS.
  2. في اليوم 2 ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط ببطء من كل بئر.
    1. عند شفط الوسط ، احرص على عدم إزالة NS. لتجنب القيام بذلك، ضع طرف الماصة بالقرب من السطح وبعيدا عن القاع.
  3. اقطع طرف الماصة الدقيقة p200 على بعد حوالي 3-4 مم من الحافة. استخدم هذا لشفط NS بالوسط المتبقي.
    ملاحظة: لتسهيل التقاط NS، قم بتحريك الماصة برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل الشفط.
  4. انقل NS والوسط المتبقي إلى صفيحة مسطحة القاع غير معالجة ب TC مكونة من 96 بئرا وتحقق من النقل تحت المجهر الضوئي ، ثم قم بتغطية كل بئر جديد ب 100 ميكرولتر من وسط التمايز CNCC الدافئ مسبقا. اترك NS في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 ، حتى اليوم 4.
  5. في اليوم 4 ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسط من كل بئر واستبدله ب 100 ميكرولتر من وسط تمايز CNCC الدافئ مسبقا.
    ملاحظة: لتجنب إزعاج مرفق NS في الجزء السفلي من اللوحة ، قم بالشفط ببطء واستبدال المتوسط.
  6. في اليومين 5 و 6 ، تحقق من مرفق NS تحت المجهر الضوئي. تأكد من أن الخلايا الأخف وزنا - التي تتلاشى من NS - تبدأ في إحاطة الجسم الرئيسي ل NS.
  7. في اليوم 7 ، قم بتغيير الوسيط كما هو موضح في 2.5. قم بتغيير الوسيط بنفس الإجراء كل يومين حتى نهاية الدراسة.

3. مرور وصيانة CNCC

ملاحظة: يمكن إجراء تمرير CNCC بمجرد وجود كمية كافية من الخلايا المرئية حول NS. يمكن أن يكون هذا في وقت مبكر من اليوم 7 ، حيث لا توفر النقاط الزمنية السابقة كمية كافية من CNCC.

  1. تحضير وسيط صيانة CNCC. انظر الجدول 1 للاطلاع على تكوين وسيط الصيانة CNCC.
    1. قبل إضافته إلى الوسط ، قم بتصفية BSA بعد الذوبان من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. بمجرد إضافة عوامل النمو ، قم بتخزين الوسط لمدة تصل إلى 3 أسابيع عند 4 درجات مئوية. تأكد من حماية الوسيط من الضوء.
  2. تحضير الفيبرونيكتين عند 7.5 ميكروغرام / مل في PBS. تخلط بقوة.
  3. قم بتغطية آبار صفيحة 96 بئرا معالجة غير TC بإضافة 100 ميكرولتر من محلول الفبرونيكتين لكل بئر. اتركيه تحت غطاء المحرك لمدة 30 دقيقة في RT.
    ملاحظة: إذا كان CNCC مخصصا لتلوين التألق المناعي ، فضع غطاء زجاجيا معقما في قاع البئر قبل الطلاء. تأكد من بقاء الشريحة في قاع البئر ولا تطفو لتجنب طلاء الجانب الآخر للجانب الذي سيتم استخدامه. اتبع الإرشادات الواردة في القسم 5 لتثبيت CNCC وتركيبه.
  4. في غضون ذلك ، في الصفيحة المسطحة القاع غير TC ذات القاع المسطح 96 ، استنشق أكبر قدر ممكن من وسط تمايز CNCC من الآبار واستبدلها ب 50 ميكرولتر أكوتاز. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. بعد الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من وسط صيانة CNCC لكل بئر لإخماد الأكوتاز. قم بإزالة الفيبرونيكتين من آبار اللوحة المسطحة القاع غير TC المعالجة ب 96 بئر. قم بتصفية CNCC المنفصلة بعد الهجرة عن طريق تمريرها عبر مرشح 40 ميكرومتر أعلى بئر اللوحة المسطحة غير TC المعالجة بقاع 96 بئر.
    ملاحظة: سيؤدي هذا إلى تصفية كتل الخلايا أو NS المتبقية التي لم تتم إزالتها مسبقا. يمكن تجميع CNCC المزروع في نفس الحالة في أنبوب واحد سعة 50 مل ليتم زرعه بعد ذلك في نفس البئر من صفيحة 6 آبار معالجة ب TC. في هذه الحالة ، قم بتغطية البئر ب 1 مل من الفيبرونيكتين واستخدم 1 مل من وسيط صيانة CNCC لإخماد الأكوتاز.
  6. دع CNCC بعد الهجرة يعلق لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تخلص من الوسط واستبدله ب 100 ميكرولتر من وسط صيانة CNCC. تغيير الوسط كل يومين.
    ملاحظة: أضف الوسيط برفق لأن التدفق السريع يحفز تمايز CNCC إلى مشتقات عصبية. إذا كنت تعمل بتنسيق 6 آبار ، فاستخدم 1 مل من وسط صيانة CNCC.

4. تثبيت NS وتركيبها للتألق المناعي

  1. في النقطة الزمنية المطلوبة ، قم بنقل NS من الصفيحة المسطحة القاع غير المعالجة ب 96 بئر إلى أنبوب 2 مل منخفض ربط الحمض النووي عن طريق قطع طرف ماصة دقيقة p200 وقم بسحب الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل لالتقاط NS.
    ملاحظة: في النقاط الزمنية اللاحقة (اليوم 7 فصاعدا) ، سيكون NS كبيرا بما يكفي لرؤيته بالعين ولكن سيكون من الصعب أيضا فصله.
  2. دع NS يستقر في الأنبوب لمدة 3 دقائق في RT ، وقم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط ، واشطفه ب 1 مل من PBS البارد.
    ملاحظة: في حالة نقل NS صغير من النقاط الزمنية المبكرة (قبل الأيام 3-4) ، قم بالدوران عند 16 × جم لمدة 3 دقائق لضمان استقرار NS في القاع.
  3. قم بإزالة PBS ، وفي غطاء كيميائي ، استبدله ب 2 مل من 4٪ PFA في PBS. احتضن لمدة 20 دقيقة في RT.
    1. اقلب الأنبوب ببطء بعد إضافة محلول PFA بنسبة 4٪ واتركه يرتاح أثناء التثبيت على الجانب. الهدف هو نشر NS قليلا حتى لا يلتصقوا ببعضهم البعض في هذه الخطوة.
  4. قم بإزالة محلول PFA بنسبة 4٪ (في الغطاء الكيميائي) واغسل NS ب 1 مل من PBS البارد / 0.5٪ Tween20. اتركه يستقر عند RT لمدة 3 دقائق. كرر هذا 3 مرات في المجموع.
    ملاحظة: سوف يستقر NS في الأسفل.
  5. قم بإزالة PBS / 0.5٪ Tween20 وأضف 2 مل من PBS / 0.1٪ Triton X-100. اقلب الأنبوب واتركه يرتاح على الجانب. احتضان لمدة 1 ساعة في RT.
  6. اغسل NS 3 مرات في PBS بارد / 0.5٪ Tween20 ، كما هو موضح في الخطوة 4.4.
  7. قم بإزالة PBS / 0.5٪ Tween20 وقم بحظر 2٪ BSA في PBS عند 4 درجات مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة ، ويفضل بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات في 2٪ BSA / PBS لمدة تصل إلى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية. حماية من الضوء.
  8. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الأولية عن طريق إضافة التخفيف الصحيح للجسم المضاد الأولي إلى 2٪ BSA / PBS في حجم نهائي قدره 500 ميكرولتر. للاطلاع على مزيج الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة، انظر الجدول 2.
  9. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من محلول الانسداد وانقل NS إلى أنبوب سعة 0.5 مل عن طريق قطع طرف ماصة دقيقة p200.
  10. أضف محلول الجسم المضاد الأساسي والماصة لأعلى ولأسفل ببطء لإعادة تعليق الأجسام المضادة. احتضن طوال الليل على دوار عند 4 درجات مئوية.
  11. اغسل NS 3 مرات في PBS بارد لمدة 5 دقائق في RT.
  12. تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المفضلة في 2٪ BSA / PBS وإضافة 1/1000 DAPI. للاطلاع على مزيج الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه الدراسة ، انظر الجدول 2.
    ملاحظة: حافظ على الأنابيب محمية من الضوء.
  13. استبدل PBS ب 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية ولف الأنبوب بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء. احتضان لمدة 1 ساعة على المدور في RT.
  14. اغسل NS 3 مرات في PBS البارد ، كما هو موضح في الخطوة 4.11.
  15. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من PBS دون شفط NS، واستبدلها ب 50 ميكرولتر من عامل المقاصة، واتبع تعليمات الشركة المصنعة.
  16. احتضن طوال الليل في RT ، محميا من الضوء.
  17. تحضير غرف التركيب.
    1. على شريحة المجهر ، ضع ثلاث طبقات من الشريط على الوجهين. استخدم شريطا شفافا خاليا من الألياف لتجنب البقايا في حجرة التركيب.
    2. باستخدام ماكينة حلاقة ، قم بقص نافذة مقاس 3 مم × 8 مم في الشريط المزدوج.
      ملاحظة: تعتمد أبعاد الغرفة على العينة الزمنية للنقطة. هذا المثال مناسب لاستضافة 50 ميكرولتر من وسط التركيب ، وهو مثالي ل 10-20 NS فردي في نقاط زمنية لاحقة (الأيام 7-9).
  18. تحت المنظار المجسم، انقل NS بعناية في عامل المقاصة إلى غرفة التركيب عن طريق قطع طرف ماصة دقيقة p200 منخفض الالتصاق. استخدم تكبيرا بين 2x و 4x لتوفير مجال رؤية للغرفة بأكملها وتكبير كاف لتحديد NS. إذا تم تجهيز المجسم للتصوير الفلوري ، فإن العمل باستخدام مرشح مضان أزرق سيجعل التعرف على NS أسهل ، حيث أن تلطيخ DAPI سيجعل NS الشفاف مميزا.
    ملاحظة: تحقق من أن الوسط يشكل غضروفا محدبا طفيفا فوق الغرفة. سيضمن ذلك عدم وجود فقاعات في الغرفة.
  19. ضع غطاء على السطح واضغط برفق على جوانبه لجعله يلتصق. قم بتنفيذ هذه الخطوة تحت المجسم وتحقق من عدم دفع NS خارج الغرفة.
  20. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية محميا من الضوء حتى التصوير.

5. تثبيت CNCC وتركيبه للتألق المناعي

  1. قم بإزالة وسيط صيانة CNCC من الآبار واغسلها باستخدام PBS. أضف PBS برفق عن طريق سحب العينة على جانب البئر.
  2. استمر في التثبيت والنفاذية والتلوين كما هو موضح في الخطوات 4.3-4.14.
  3. قم بتركيب أغطية على شريحة زجاجية مجهرية عن طريق إضافة وسيط تثبيت على الشريحة ، والإمساك بغطاء الغطاء وتدويره باستخدام الملقط بحيث يواجه CNCC بعد الهجرة الشريحة الزجاجية ، ووضعه على القطرة.
    1. اختياري: أغلق الغطاء بطلاء الأظافر أو غيرها من أنظمة الختم الشائعة الاستخدام.
  4. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية محميا من الضوء حتى التصوير.

النتائج

باتباع البروتوكول ، تم فصل مستعمرات mESC ، وتم زرع 3000 خلية في صفائح 96 بئر U المعالجة ب 96 بئر غير TC. في اليوم 2 ، تم نقل NS المجمعة إلى ألواح مسطحة القاع غير المعالجة ب TC من 96 بئرا للسماح لها بالارتباط. يتم توفير تصور مبسط لبروتوكول تجميع NS في الشكل 1 أ. تم استزراع NS...

Discussion

تسمح نماذج التمايز ثلاثية الأبعاد في المختبر بتحليل تفاعلات الخلايا المعقدة التي قد تكون صعبة - أو لا يمكن ملاحظتها - في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد. تم تطوير العديد من النماذج لدراسة تطور CNCC في المختبر. هذه مشتقة بشكل عام مباشرة من مستعمرات ESC7،...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور ريمي كزافييه كوكس على المشورة بشأن تصميم التمهيدي والخبرة في زراعة الخلايا. تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الأوروبي للبحوث (ERC Start Grant 101039995 - REGENECREST) ومؤسسة البحث الطبي AJE202205015403.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm syringe filtersClearLine146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical TubeFalcon352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter TipsDutscher713263
40 µm filtersFalcon352340
5 mL Serological pipetteStarstedt86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical TubeFalcon352070
AccutaseMerck-SigmaA6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)Thermofisher ScientificA31571
Antibiotic-antimycotic solution Merck-SigmaA5955
B27 PLUS supplementThermofisher Scientific17504044
Bovine serum albumin (BSA)Merck-SigmaA9418
ChloroformCarlo Erba438601
Collagenase Type IVThermofisher Scientific, Gibco17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well platesCorning3516
Cover glasses, roundVWR 630-2113 
DMEM KnockOutThermofisher Scientific10829018
DMEM/F12+GlutamaxThermofisher Scientific10565018
DMEM high glucoseMerck-SigmaD0822
DNA LoBind Tubes, 2 mLEppendorf30108078
DNase/RNase-Free Distilled WaterThermofisher Scientific10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermofisher Scientific14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mLEppendorf30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mLEppendorf30120094
ESGRO mLIF Medium SupplementMerck-SigmaESG1107
Ethanol 70%Carlo Erba528170
Fetal Bovine SerumMerck-SigmaF7524
FibronectinMerck-SigmaF085-2MG
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02
Gelatin solutionMerck-SigmaES-006-B
GlutaMAXThermofisher Scientific35050061
Human EGFPeprotechAF-100-15-500UG
Human FGF-basicPeprotech100-18B
Human SOX9 AntibodyR&DsystemsAF3075
Insulin from bovine pancreasMerck-SigmaI6634
iScript cDNA Synthesis KitBiorad1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, UnconjugatedDSHB3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, UnconjugatedDSHBPAX7
N2 supplementThermofisher Scientific17502048
Neurobasal MediumThermofisher Scientific21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottomFalcon351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottomFalcon351177
Paraformaldehyde 16% solution, em gradeElectron Microscopy Sciences15710
Propan-2-olCarlo Erba415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) AntibodyBiolegendMMS-435P
RapiClear 1.47Sunjin LabRC147001
RapiClear 1.52Sunjin LabRC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 mClear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX KitMeridian BioscienceBIO-98020
Sterile Disposable Surgical ScalpelsSwann-Morton05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope SlidesEprediaJ1800AMNZ
Triton X-100Thermofisher ScientificA16046.AP
TRIzol ReagentFisherScientific15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)Thermofisher Scientific25300054
Tween-20Fisher Scientific10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)Cell signaling technologyE7E2G
β-mercaptoethanolThermofisher Scientific31350010

References

  1. Rothstein, M., Bhattacharya, D., Simoes-Costa, M. The molecular basis of neural crest axial identity. Dev Biol. 444, S170-S180 (2018).
  2. Smeriglio, P., Zalc, A. Cranial neural crest cells contribution to craniofacial bone development and regeneration. Curr Osteoporos Rep. 21 (5), 624-630 (2023).
  3. Zalc, A., et al. Reactivation of the pluripotency program precedes formation of the cranial neural crest. Science. 371 (6529), eabb4776 (2021).
  4. Perera, S. N., Kerosuo, L. On the road again: Establishment and maintenance of stemness in the neural crest from embryo to adulthood. Stem Cells. 39 (1), 7-25 (2021).
  5. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. J Vis Exp. (140), e58346 (2018).
  6. Ishii, M., Arias, A. C., Liu, L., Chen, Y. B., Bronner, M. E., Maxson, R. E. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells Dev. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  7. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Prescott, S., Brugmann, S. A., Swigut, T., Wysocka, J. Epigenomic annotation of enhancers predicts transcriptional regulators of human neural crest. Cell Stem Cell. 11 (5), 633-648 (2012).
  8. Cederquist, G. Y., et al. Specification of positional identity in forebrain organoids. Nat Biotechnol. 37 (4), 436-444 (2011).
  9. Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  10. Prescott, S. L., et al. Enhancer divergence and cis-regulatory evolution in the human and chimp neural crest. Cell. 163 (1), 68-83 (2015).
  11. Chaddah, R., Arntfield, M., Runciman, S., Clarke, L., van der Kooy, D. Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies. J Neurosci. 32 (23), 7771-7781 (2012).
  12. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  13. Sipahi, R., Zupanc, G. K. Stochastic cellular automata model of neurosphere growth: Roles of proliferative potential, contact inhibition, cell death, and phagocytosis. J Theor Biol. 445, 151-165 (2018).
  14. Mori, H., et al. Effect of neurosphere size on the growth rate of human neural stem/progenitor cells. J Neurosci Res. 84 (8), 1682-1691 (2006).
  15. Kress, C., Vandormael-Pournin, S., Baldacci, P., Cohen-Tannoudji, M., Babinet, C. Nonpermissiveness for mouse embryonic stem (ES) cell derivation circumvented by a single backcross to 129/Sv strain: establishment of ES cell lines bearing the Omd conditional lethal mutation. Mamm Genome. 9 (12), 998-1001 (1998).
  16. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe. Development. 142 (2), 242-257 (2015).
  17. Memberg, S. P., Hall, A. K. Dividing neuron precursors express neuron-specific tubulin. J Neurobiol. 27 (1), 26-43 (1995).
  18. Kim, C. N., Shin, D., Wang, A., Nowakowski, T. J. Spatiotemporal molecular dynamics of the developing human thalamus. Science. 382, eadf9941 (2023).
  19. Grimaldi, A., Comai, G., Mella, S., Tajbakhsh, S. Identification of bipotent progenitors that give rise to myogenic and connective tissues in mouse. ELife. 11, e70235 (2022).
  20. To, K., et al. A multiomic atlas of human early skeletal development. Nature. 635 (8039), 657-667 (2024).
  21. Bajpai, R., et al. Molecular stages of rapid and uniform neuralization of human embryonic stem cells. Cell Death Differ. 16 (6), 807-825 (2009).
  22. Kerosuo, L., Nie, S., Bajpai, R., Bronner, M. E. Crestospheres, Long-term maintenance of multipotent, premigratory neural crest stem cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 499-507 (2015).
  23. Abe, S., Yamaguchi, S., Sato, Y., Harada, K. Sphere-derived multipotent progenitor cells obtained from human oral mucosa are enriched in neural crest cells. Stem Cells Transl Med. 5 (1), 117-128 (2016).
  24. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).
  25. Ziegler, L., Grigoryan, S., Yang, I. H., Thakor, N. V., Goldstein, R. S. Efficient generation of Schwann cells from human embryonic stem cell-derived neurospheres. Stem Cell Rev Rep. 7 (2), 394-403 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

CNCC NS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved