Cellules de crête neurale crânienne : protocole de différenciation in vitro tridimensionnelle pour le dosage multiplexé

Résumé

Nous présentons un protocole de différenciation in vitro tridimensionnel (3D) générant des neurosphères de taille reproductible pour produire des cellules de crête neurale crânienne à partir de cellules souches embryonnaires de souris. Nous montrons que cette méthodologie réduit la variabilité par rapport aux protocoles précédents et comment elle peut être utilisée pour le dosage multiplexé afin d’étudier le développement des cellules de la crête neurale crânienne.

Résumé

Avec leur remarquable capacité à générer à la fois des dérivés ectodermiques et mésenchymateux, les cellules de la crête neurale crânienne (CNCC) ont suscité beaucoup d’intérêt dans l’étude des mécanismes régulant les décisions de destin cellulaire et la plasticité. Originaire du neuroépithélium dorsal, cette population cellulaire est transitoire et relativement rare dans l’embryon en développement, ce qui rend les tests fonctionnels, les criblages génomiques et les tests biochimiques difficiles à réaliser in vivo. Pour pallier ces limitations, plusieurs méthodes ont été développées pour modéliser le développement du CNCC in vitro. Les méthodes de culture basées sur la neurosphère (NS) fournissent un microenvironnement complexe qui récapitule le neuroépithélium antérieur en développement en 3D. Ces systèmes permettent la croissance de nombreux NS dans la même plaque pour générer une grande quantité de CNCC, mais les NS produits présentent une grande variabilité de forme, de taille et de nombre de CNCC formés, ce qui rend les tests quantitatifs difficiles à réaliser. Ce protocole décrit une méthode reproductible pour générer des cellules souches embryonnaires de souris (mESC) dans un format à 96 puits. Les NS générés dans des plaques de 96 puits produisent des cellules de crête neurale crânienne (CNCC), qui peuvent être cultivées davantage. En contrôlant le nombre de cellules de départ, cette approche réduit la variabilité de la taille et de la forme entre les NS et augmente la reproductibilité entre les expériences. Enfin, ce système de culture est adaptable à plusieurs applications et offre un degré de flexibilité plus élevé, ce qui le rend hautement personnalisable et adapté au multiplexage de conditions expérimentales.

Introduction

Les cellules de la crête neurale crânienne (CNCC) sont une population de cellules souches qui se développe dans la partie la plus antérieure de l’embryon en développement, à la frontière entre la plaque neurale et l’ectoderme^{de surface 1}. Les CNCC subissent ensuite une transition épithéliale à mésenchymateuse (EMT), se délaminent du neuroépithélium et migrent dorso-ventralement vers divers endroits de l’embryon où ils se différencient en une grande variété de types cellulaires². L’étude de cette population cellulaire est d’un grand intérêt car elle possède une plasticité remarquable³ et la capacité unique de se différencier en dérivés ectodermiques et mésenchymateux, tels que les os cranio-faciaux et les cartilages⁴. Bien que les CNCC soient relativement accessibles dans l’embryon, il s’agit d’une population transitoire avec un faible nombre de cellules, ce qui rend les études mécanistes systémiques difficiles à mener in vivo. Des lignées cellulaires CNCC ont été isolées et caractérisées au cours des dernières années pour surmonter ces limitations. En particulier, la lignée cellulaire O9-1 CNCC est un excellent outil pour étudier le développement de la crête neurale migratoire et post-migratoire ^5,6 ; Cependant, cette lignée cellulaire ne permet pas d’étudier les événements précoces précédant la migration conduisant à l’induction et à la spécification de la crête neurale. À cet égard, il y a eu des développements significatifs dans le développement de protocoles de différenciation in vitro pour différencier le CNCC dans une boîte via l’utilisation de structures 3D ressemblant au neuroépithélium en développement appelées neurosphères (NS)^7,8- obtenues après différenciation des colonies de cellules souches embryonnaires (ESC). Ces protocoles 3D produisent de manière robuste un grand nombre de CNCC, permettant la réalisation d’études mécanistes biochimiques et génomiques ^9,10. Les NS sont cultivés sur des plaques à faible fixation dans un milieu supplémenté en N2B27, avec le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) et le facteur de croissance épidermique (EGF)^10,11 pour stimuler la prolifération cellulaire. Ces protocoles sont réalisés dans des boîtes de Pétri, en cultivant de nombreux NS dans la même plaque. Au sein du NS en croissance, les cellules s’agrègent et continuent de se diviser, atteignant un diamètre de 100 à 200 μm à maturité. À maturité (vers le 5e jour), les NS se fixent au substrat et se différencient en CNCC ressemblant à leurs homologues in vivo ^9,12. Ces CNCC subissent ensuite une EMT et se délaminent sur la surface de la plaque. Des différences morphologiques peuvent être observées en fonction de la taille des NS, car les sphères plus grandes apparaîtront plus foncées dans le noyau en raison d’une plus faible disponibilité des nutriments et de l’oxygène, conduisant les cellules à subir l’apoptose¹³. Bien que ce type de procédure génère un grand nombre de CNCC au point final de différenciation, il présente plusieurs limites, rendant l’étude des différentes dynamiques moléculaires se produisant au cours du processus de différenciation presque impossible. Tout d’abord, l’utilisation de colonies ESC - dont la taille varie - rend difficile le contrôle du nombre de cellules de départ pour chaque expérience. Cela se traduit par la génération de NS de différentes formes et diamètres qui se développent différemment en activant des voies de signalisation spécifiques, conduisant à une différenciation cellulaire altérée et, par conséquent, ne formant pas un échantillon uniforme à un point temporel donné. Deuxièmement, la culture de plusieurs NS dans la même plaque les amène souvent à fusionner¹⁴ et à libérer potentiellement des molécules de signalisation qui influencent le microenvironnement de leurs voisins et, par conséquent, leur développement. Dans l’ensemble, ces procédures génèrent une grande variabilité entre les échantillons et les expériences.

Ici, nous présentons une stratégie pour surmonter ces difficultés qui génèrent une seule NS - capable de produire de la CNCC - en agrégeant des ESC de souris (mESC) dans des plaques à 96 puits à fond en U non traitées par TC. Partir de mESC permet d’étudier le processus de spécification et les premières étapes du développement du CNCC par rapport au démarrage de lignées cellulaires de crête neurale déjà établies. Ce protocole commence par la désagrégation des colonies de CSEm pour obtenir une suspension cellulaire unique, suivie de l’ensemencement d’un nombre spécifique de CSEm dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond en U non traitée par TC. On laisse les cellules s’agréger pendant deux jours, puis on les déplace vers une plaque à fond plat à 96 puits non traitée par TC, dans laquelle NS pourra se fixer au fond de la plaque. En contrôlant le nombre de cellules de départ et le microenvironnement de chaque NS pendant le processus de différenciation, ce protocole réduit la variabilité de l’échantillon, ce qui augmente la reproductibilité expérimentale. Nous pensons qu’il s’agira d’une plate-forme pratique pour concevoir des expériences multiplexées, telles que tester l’effet de différentes conditions de culture ou effectuer des criblages de perturbation génétique.

Protocole

1. Génération d’une suspension unicellulaire à partir de colonies d’ESC de souris

REMARQUE : Ce protocole est adapté à l’utilisation de CSEm CK35 (une lignée de CSEm compétente pour la transmission de lignées germinales, pour avoir ensuite la possibilité de développer des modèles in vivo ¹⁵) cultivés sur des mangeoires inactivées dans une plaque à 6 puits traitée TC recouverte de gélatine. Un puits d’une plaque à 6 puits traitée par TC devrait produire environ 1,5 × 10⁶ mESC, ce qui est suffisant pour le reste du protocole. Cela peut être étendu si nécessaire. Ajustez les étapes initiales en fonction de la souche ESC choisie et de la méthode de culture d’entretien, ainsi que du milieu de culture approprié. Ce protocole doit être réalisé dans des conditions stériles. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et équipements utilisés dans ce protocole.

1. Commencer à partir de mESC à une confluence de 70 % à 80 % cultivée dans un milieu de culture mESC. Voir le tableau 1 pour la composition du milieu de culture des CSEm utilisée dans cette étude.
   REMARQUE : Ne laissez pas les CSEm croître au-dessus de 80 % de confluence, car elles commenceront à se différencier, ce qui affectera le processus d’agrégation. Les colonies doivent être compactes et présenter une morphologie saine (pas de fissures ni de vagues, contraste nucléaire-cytoplasme distinct).
2. Préparez le milieu de différenciation CNCC. Voir le tableau 1 pour la composition du milieu de différenciation CNCC.
   REMARQUE : Une fois les facteurs de croissance ajoutés, le milieu peut être stocké jusqu’à 3 semaines à 4 °C. Assurez-vous que le support est à l’abri de la lumière.
3. Préparez une solution fraîche de collagénase à une concentration de 2 mg/mL dans le milieu DMEM-Knockout.
   REMARQUE : L’utilisation de la collagénase permet de s’assurer que seules les colonies sont détachées et non les mangeoires, car leur présence dans les étapes suivantes interférera avec l’agrégation des NS. Filtrer la solution de collagénase avant utilisation avec un filtre de 0,22 μm.
4. Aspirez le support ESC à partir de mESC.
5. Ajouter délicatement 1 mL de PBS sur le côté du puits. Basculez doucement la plaque pour assurer un lavage uniforme.
6. Retirer le PBS et le remplacer par 2 ml de solution de collagénase. Incuber à 37 °C pendant 30-45 min.
   1. Vérifiez la plaque au microscope optique à un grossissement de 10x après les 20 premières minutes, puis toutes les 5 minutes.
   2. Lorsque les colonies montrent des bords enroulés, tapotez vigoureusement sur le côté de la plaque et les colonies se détacheront.
7. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml, prélever les colonies et les transférer dans un tube conique de 15 ml.
   REMARQUE : Vérifiez la plaque au microscope optique pour les colonies restantes. Ceux-ci peuvent être collectés avec un lavage PBS.
8. Centrifuger les colonies à 16 × g pendant 3 min à température ambiante (RT).
9. Aspirez autant de milieu que possible du tube conique, en faisant attention de ne pas déranger les colonies au fond du tube.
10. Ajouter 1 mL de solution de trypsine à 0,05 % et incuber le tube à 37 °C pendant 5 min.
11. Dissociez les colonies dans le tube en pipetant vigoureusement de haut en bas, d’abord avec une micropipette p1000, puis avec une micropipette p200.
    REMARQUE : Cela garantit l’obtention d’une suspension à cellule unique.
12. Ajouter 2 mL de milieu de culture mESC pour bloquer la trypsine et centrifuger à 160 × g pendant 3 min à RT. Retirer le surnageant et ajouter 1 mL de milieu de différenciation CNCC.
13. Comptez les cellules à l’aide d’un appareil de comptage automatisé ou d’un système normalisé au microscope, en suivant les instructions du fabricant.
14. Après comptage, diluer avec un milieu de différenciation CNCC suffisant pour obtenir une concentration de 3000 cellules vivantes par 50 μL.
15. À l’aide d’une micropipette p200, ensemencer 50 μL de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 96 puits à fond en U non traitée par TC, puis remplir le puits jusqu’à 200 μL avec un milieu de différenciation CNCC.
    REMARQUE : Lors du remplissage de la plaque, remettre de temps en temps en suspension la suspension unicellulaire à l’aide d’une micropipette p1000 pour obtenir une concentration homogène.
16. Incuber une nuit dans un incubateur à 37 °C, 5 % CO₂.

2. Transfert dans une plaque à fond plat de 96 puits pour la différenciation CNCC

1. Le lendemain (jour 1), observez la plaque au microscope optique. Assurez-vous qu’un petit groupe de cellules avec des bordures claires est visible au fond de chaque puits. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant la nuit.
   REMARQUE : Il peut y avoir des cellules autour de l’agrégat principal, certaines mortes. Cela n’interfère pas avec l’agrégation NS.
2. Le jour 2, retirer lentement 100 μL de milieu de chaque puits.
   1. Lors de l’aspiration du fluide, veillez à ne pas retirer le NS. Pour éviter de le faire, placez la pointe de la pipette près de la surface et loin du fond.
3. Coupez la pointe d’une micropipette p200 à environ 3-4 mm de la pointe. Utilisez-le pour aspirer le NS avec le milieu restant.
   REMARQUE : Pour faciliter la prise du NS, pipetez doucement de haut en bas plusieurs fois avant d’aspirer.
4. Transférez le NS et le milieu restant dans une plaque à fond plat à 96 puits non traitée TC et vérifiez le transfert au microscope optique, puis recouvrez chaque nouveau puits de 100 μL de milieu de différenciation CNCC préchauffé. Laisser NS dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO_2, jusqu’au jour 4.
5. Le jour 4, retirer 100 μL de milieu de chaque puits et le remplacer par 100 μL de milieu de différenciation CNCC préchauffé.
   REMARQUE : Pour éviter de perturber la fixation NS au bas de la plaque, aspirez lentement et replacez le fluide.
6. Les jours 5 et 6, vérifiez l’accessoire NS au microscope optique. Assurez-vous que les cellules plus légères - qui se décollent du NS - commencent à entourer le corps principal du NS.
7. Le jour 7, changez de support comme décrit en 2.5. Changez de milieu avec la même procédure tous les 2 jours jusqu’au point final de l’étude.

3. Passage et maintenance CNCC

REMARQUE : Le passage CNCC peut être effectué dès qu’il y a une quantité suffisante de cellules visibles autour de NS. Cela peut être dès le jour 7, car les points de temps antérieurs ne fournissent pas une quantité suffisante de CNCC.

1. Préparez le support de maintenance CNCC. Voir le tableau 1 pour la composition du milieu d’entretien CNCC.
   1. Avant de l’ajouter au milieu, filtrer BSA après solubilisation à travers un filtre de 0,22 μm. Une fois les facteurs de croissance ajoutés, conservez le milieu jusqu’à 3 semaines à 4 °C. Assurez-vous que le support est à l’abri de la lumière.
2. Préparez la fibronectine à 7,5 μg/mL dans du PBS. Mélangez vigoureusement.
3. Enduisez les puits d’une plaque de 96 puits non traitée TC en ajoutant 100 μL de solution de fibronectine par puits. Laissez enrober sous le capot pendant 30 min à RT.
   REMARQUE : Si les CNCC sont destinés à la coloration par immunofluorescence, placez une lamelle en verre stérile au fond du puits avant d’enrober. Assurez-vous que la lame reste au fond du puits et ne flotte pas pour éviter de recouvrir le côté opposé à celui qui sera utilisé. Suivez les instructions de la section 5 pour la fixation et le montage CNCC.
4. Entre-temps, dans la plaque à fond plat à 96 puits non traitée TC, aspirer autant de milieu de différenciation CNCC que possible des puits et le remplacer par de l’accutase de 50 μL. Incuber à 37 °C pendant 5 min.
5. Après l’incubation, ajouter 100 μL de milieu d’entretien CNCC par puits pour tremper l’accutase. Retirez la fibronectine des puits de la plaque à fond plat à 96 puits non traitée TC réceptrice. Filtrer le CNCC post-migratoire détaché en le faisant passer à travers un filtre de 40 μm situé au-dessus du puits de la plaque à fond plat à 96 puits non traitée CT réceptrice.
   REMARQUE : Cela filtrera les amas de cellules ou les NS restants qui n’ont pas été précédemment éliminés. Le CCNC cultivé dans les mêmes conditions peut être regroupé dans un tube de 50 mL pour être ensuite ensemencé dans le même puits d’une plaque à 6 puits traitée TC. Dans ce cas, enduire le puits de 1 mL de fibronectine et utiliser 1 mL de milieu d’entretien CNCC pour tremper l’accutase.
6. Laisser le CNCC post-migratoire se fixer pendant 15 à 30 min à 37 °C. Jeter le fluide et le remplacer par 100 μL de fluide d’entretien CNCC. Changez de support tous les 2 jours.
   REMARQUE : Ajouter doucement le milieu car l’écoulement rapide induit la différenciation du CNCC en dérivés neuronaux. Si vous travaillez dans un format à 6 puits, utilisez 1 mL de support d’entretien CNCC.

4. Fixation et montage NS pour l’immunofluorescence

1. Au moment souhaité, transférez le NS de la plaque à fond plat à 96 puits non traitée TC dans un tube de 2 mL à faible liaison à l’ADN en coupant l’extrémité d’une micropipette p200 et en pipetant doucement de haut en bas pour prélever le NS.
   REMARQUE : À des moments ultérieurs (à partir du jour 7), NS sera assez grand pour être vu à l’œil nu, mais il sera également plus difficile de s’en détacher.
2. Laisser NS se déposer dans le tube pendant 3 minutes à RT, retirer autant de milieu que possible et rincer avec 1 mL de PBS froid.
   REMARQUE : Si vous transférez de petits NS à partir de points précoces (avant les jours 3-4), essorez-les à 16 × g pendant 3 minutes pour vous assurer que les NS se déposent au fond.
3. Retirer le PBS et, dans une hotte chimique, le remplacer par 2 ml de PFA à 4 % dans du PBS. Incuber pendant 20 min à RT.
   1. Retournez lentement le tube après avoir ajouté une solution PFA à 4 % et laissez-le reposer pendant la fixation sur le côté. Le but est d’étaler légèrement les NS afin qu’ils ne collent pas ensemble dans cette étape.
4. Retirer la solution de PFA à 4 % (dans la hotte chimique) et laver NS avec 1 mL de PBS froid/0,5 % de Tween20. Laissez reposer à RT pendant 3 min. Répétez cette opération 3 fois au total.
   REMARQUE : NS se déposera au fond.
5. Retirer PBS/0,5 % Tween20 et ajouter 2 ml de PBS/0,1 % Triton X-100. Retournez le tube et laissez-le reposer sur le côté. Incuber pendant 1 h à RT.
6. Lavez NS 3 fois dans du PBS/0,5 % Tween20 à froid, comme indiqué à l’étape 4.4.
7. Retirer le PBS/0,5 % Tween20 et le bloquer avec 2 % de BSA dans du PBS à 4 °C pendant au moins 1 h, de préférence toute la nuit.
   REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés dans 2 % BSA/PBS jusqu’à 1 semaine à 4 °C. Protéger de la lumière.
8. Préparez la solution d’anticorps primaires en ajoutant la dilution correcte de l’anticorps primaire à 2 % de BSA/PBS dans un volume final de 500 μL. Pour le mélange d’anticorps primaires utilisé dans cette étude, voir le tableau 2.
9. Retirer la plus grande partie possible de la solution de blocage et transférer le NS dans un tube de 0,5 mL en coupant l’extrémité d’une micropipette p200.
10. Ajouter la solution d’anticorps primaires et pipeter lentement de haut en bas pour remettre le NS en suspension. Incuber toute la nuit sur un rotateur à 4 °C.
11. Laver NS 3 fois dans du PBS froid pendant 5 min à RT.
12. Préparez la solution d’anticorps secondaires en diluant les anticorps secondaires de votre choix dans 2 % de BSA/PBS et en ajoutant 1/1000 de DAPI. Pour le mélange d’anticorps secondaires utilisé dans cette étude, voir le tableau 2.
    REMARQUE : Gardez les tubes à l’abri de la lumière.
13. Remplacez le PBS par 500 μL de solution d’anticorps secondaire et enveloppez le tube d’une feuille d’aluminium pour le protéger de la lumière. Incuber 1 h sur le rotateur à RT.
14. Lavez NS 3 fois dans du PBS froid, comme indiqué à l’étape 4.11.
15. Retirez autant de PBS que possible sans aspirer le NS, remplacez-le par 50 μL d’agent nettoyant et suivez les instructions du fabricant.
16. Incuber toute la nuit à RT, à l’abri de la lumière.
17. Préparez les chambres de montage.
    1. Sur une lame de microscope, placez trois couches de ruban adhésif double face. Utilisez du ruban adhésif transparent et sans fibres pour éviter les résidus dans la chambre de montage.
    2. À l’aide d’un rasoir, découpez une fenêtre de 3 mm × 8 mm dans le ruban double.
       REMARQUE : Les dimensions de la chambre dépendent du point temporel de l’échantillon. Cet exemple est adapté pour l’hébergement de 50 μL de support de montage, ce qui est optimal pour 10 à 20 NS uniques à des points temporels ultérieurs (jours 7 à 9).
18. Sous un stéréoscope, transférez soigneusement le NS dans l’agent nettoyant dans la chambre de montage en découpant une pointe de micropipette p200 à faible adhérence. Utilisez un grossissement compris entre 2x et 4x pour fournir un champ de vision de l’ensemble de la chambre et un grossissement suffisant pour identifier le NS. Si le stéréoscope est équipé pour l’imagerie fluorescente, l’utilisation d’un filtre de fluorescence bleu facilitera l’identification du NS, car la coloration DAPI fera ressortir le NS autrement transparent.
    REMARQUE : Vérifiez que le milieu forme un léger ménisque convexe au-dessus de la chambre. Cela garantira qu’il n’y a pas de bulles dans la chambre.
19. Placez une lamelle sur la surface et appuyez légèrement sur ses côtés pour la faire adhérer. Effectuez cette étape sous le stéréoscope et vérifiez que les NS ne sont pas poussés à l’extérieur de la chambre.
20. Conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie.

5. Fixation et montage CNCC pour l’immunofluorescence

1. Retirez le fluide d’entretien CNCC des puits et lavez-les avec du PBS. Ajouter doucement le PBS en pipetant sur le côté du puits.
2. Procédez à la fixation, à la perméabilisation et à la coloration comme décrit aux étapes 4.3 à 4.14.
3. Montez les lamelles sur une lame de verre de microscopie en ajoutant du support de montage sur la lame, en saisissant et en faisant pivoter la lamelle à l’aide d’une pince à épiler de sorte que le CNCC post-migratoire fasse face à la lame de verre, et en la plaçant sur la goutte.
   1. Facultatif : Scellez la lamelle avec du vernis à ongles ou d’autres systèmes d’étanchéité couramment utilisés.
4. Conserver à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie.

Résultats

Conformément au protocole, les colonies de CSEm ont été dissociées et 3000 cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits à fond en U non traitées par TC. Le jour 2, les SN agrégés ont été transférés dans des plaques à fond plat à 96 puits non traitées par TC pour leur permettre de se fixer. Une visualisation simplifiée du protocole d’agrégation NS est fournie à la figure 1A. Les NS ont été cultivés jusqu’au jour 9, pui...

Discussion

Les modèles de différenciation 3D in vitro permettent d’analyser des interactions cellulaires complexes qui pourraient être difficiles - ou ne pourraient pas - être observées en culture cellulaire 2D. Plusieurs modèles ont été développés pour étudier le développement du CNCC in vitro. Ceux-ci sont généralement directement dérivés de colonies ESC ^7,21 ou d’explants de tissus^2...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	ClearLine	146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter Tips	Dutscher	713263
40 µm filters	Falcon	352340
5 mL Serological pipette	Starstedt	86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
Accutase	Merck-Sigma	A6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A31571
Antibiotic-antimycotic solution	Merck-Sigma	A5955
B27 PLUS supplement	Thermofisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin (BSA)	Merck-Sigma	A9418
Chloroform	Carlo Erba	438601
Collagenase Type IV	Thermofisher Scientific, Gibco	17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well plates	Corning	3516
Cover glasses, round	VWR	630-2113
DMEM KnockOut	Thermofisher Scientific	10829018
DMEM/F12+Glutamax	Thermofisher Scientific	10565018
DMEM high glucose	Merck-Sigma	D0822
DNA LoBind Tubes, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermofisher Scientific	10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher Scientific	14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL	Eppendorf	30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL	Eppendorf	30120094
ESGRO mLIF Medium Supplement	Merck-Sigma	ESG1107
Ethanol 70%	Carlo Erba	528170
Fetal Bovine Serum	Merck-Sigma	F7524
Fibronectin	Merck-Sigma	F085-2MG
Fluoromount-G	Invitrogen	00-4958-02
Gelatin solution	Merck-Sigma	ES-006-B
GlutaMAX	Thermofisher Scientific	35050061
Human EGF	Peprotech	AF-100-15-500UG
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human SOX9 Antibody	R&Dsystems	AF3075
Insulin from bovine pancreas	Merck-Sigma	I6634
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	PAX7
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
Neurobasal Medium	Thermofisher Scientific	21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottom	Falcon	351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottom	Falcon	351177
Paraformaldehyde 16% solution, em grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Propan-2-ol	Carlo Erba	415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) Antibody	Biolegend	MMS-435P
RapiClear 1.47	Sunjin Lab	RC147001
RapiClear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 m			Clear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Meridian Bioscience	BIO-98020
Sterile Disposable Surgical Scalpels	Swann-Morton	05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton X-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP
TRIzol Reagent	FisherScientific	15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
Tween-20	Fisher Scientific	10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)	Cell signaling technology	E7E2G
β-mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	31350010