Kraniyal Nöral Krest Hücreleri Çoğullanmış Test için Üç Boyutlu İn Vitro Farklılaşma Protokolü

Özet

Fare embriyonik kök hücrelerinden kraniyal nöral krest hücreleri üretmek için tekrarlanabilir boyutta nöroküreler üreten üç boyutlu (3D) bir in vitro farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu metodolojinin önceki protokollere kıyasla değişkenliği azalttığını ve kraniyal nöral krest hücre gelişimini incelemek için çoğullanmış test için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Özet

Hem ektodermal hem de mezenkimal türevler üretme konusundaki olağanüstü kapasiteleri ile kraniyal nöral krest hücreleri (CNCC), hücre kader kararlarını ve plastisitesini düzenleyen mekanizmaların incelenmesinde büyük ilgi görmüştür. Dorsal nöroepitelyumdan kaynaklanan bu hücre popülasyonu geçicidir ve gelişmekte olan embriyoda nispeten nadirdir - fonksiyonel testleri, genomik taramaları ve biyokimya testlerini in vivo olarak gerçekleştirmeyi zorlaştırır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, CNCC gelişimini in vitro olarak modellemek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir.Nörosfer (NS) tabanlı kültürleme yöntemleri, gelişmekte olan ön nöroepiteli 3 boyutlu olarak özetleyen karmaşık bir mikro ortam sağlar. Bu sistemler, büyük miktarda CNCC oluşturmak için aynı plakadaki birçok NS'nin büyümesine izin verir, ancak üretilen NS, şekil, boyut ve oluşan CNCC sayısında yüksek bir değişkenlik sunar - bu da kantitatif tahlillerin gerçekleştirilmesini zorlaştırır. Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinden (mESC) 96 oyuklu bir formatta NS üretmek için tekrarlanabilir bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir. 96 oyuklu plakalarda üretilen NS, daha fazla kültürlenebilen kraniyal nöral krest hücreleri (CNCC) üretir. Bu yaklaşım, başlangıç hücrelerinin sayısını kontrol ederek, NS arasındaki boyut ve şekildeki değişkenliği azaltır ve deneyler arasında tekrarlanabilirliği artırır. Son olarak, bu kültür sistemi çeşitli uygulamalara uyarlanabilir ve daha yüksek derecede esneklik sunar, bu da onu son derece özelleştirilebilir ve deneysel koşulların çoğullanması için uygun hale getirir.

Giriş

Kraniyal nöral krest hücreleri (CNCC), gelişmekte olan embriyonun en ön kısmında, nöral plaka ile yüzey ektodermi¹ arasındaki sınırda ortaya çıkan kök benzeri bir hücre popülasyonudur. CNCC daha sonra epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) uğrar, nöroepitelden delaminasyona uğrar ve dorsoventral olarak embriyonun çeşitli yerlerine doğru göç eder ve burada çok çeşitli hücre tiplerine farklılaşırlar². Bu hücre popülasyonunu incelemek, dikkate değer bir plastisiteye 3 ve kraniyofasiyal kemikler^ve kıkırdaklar⁴ gibi hem ektodermal hem de mezenkimal türevlere farklılaşma konusunda benzersiz bir yeteneğe sahip olduğu için büyük ilgi görmektedir. CNCC embriyoda nispeten erişilebilir olmasına rağmen, düşük sayıda hücreye sahip geçici bir popülasyondur ve sistemik mekanik çalışmaların in vivo olarak yürütülmesini zorlaştırır. CNCC hücre hatları, bu sınırlamaların üstesinden gelmek için son birkaç yılda izole edilmiş ve karakterize edilmiştir. Özellikle, O9-1 CNCC hücre hattı, göç ve göç sonrası nöral krest gelişimini incelemek için harika bir araçtır ^5,6; Bununla birlikte, bu hücre hattı, nöral krest indüksiyonu ve spesifikasyonuna yol açan göçten önceki erken olayların incelenmesine izin vermez. Bu bağlamda, embriyonik kök hücre (ESC) kolonilerinin farklılaşmasından sonra elde edilen nörosfer (NS)^7,8- adı verilen gelişmekte olan nöroepitele benzeyen 3 boyutlu yapıların kullanılması yoluyla bir tabakta CNCC'yi farklılaştırmak için in vitro farklılaşma protokollerinin geliştirilmesinde önemli gelişmeler olmuştur. Bu 3D protokoller, biyokimyasal ve genomik mekanik çalışmaların yürütülmesine izin vererek yüksek sayıda CNCC'yi sağlam bir şekilde üretir ^9,10. NS, hücre proliferasyonunu uyarmak için Fibroblast Büyüme Faktörü (FGF) ve Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)^10,11 ile birlikte N2B27 takviyeli ortamda düşük bağlantı plakaları üzerinde kültürlenir. Bu protokoller Petri kaplarında gerçekleştirilir ve aynı plakada çok sayıda NS yetiştirilir. Büyüyen NS içinde, hücreler toplanır ve bölünmeye devam eder - olgunlaştığında 100-200 μm çapa ulaşır. Olgunlukta (yaklaşık 5. gün), NS substrata bağlanır ve in vivo muadillerine^{benzeyen CNCC'ye farklılaşır 9,12}. Bu CNCC daha sonra EMT'ye tabi tutulur ve plaka yüzeyine delaminasyon yapılır. NS boyutuna bağlı olarak morfolojik farklılıklar gözlenebilir, çünkü daha düşük besin ve oksijen mevcudiyeti nedeniyle daha büyük küreler çekirdekte daha koyu görünecek ve hücrelerin apoptoz geçirmesine yol açacaktır¹³. Bu tür bir prosedür, farklılaşmanın son noktasında çok sayıda CNCC oluştururken, farklılaşma işlemi sırasında meydana gelen çeşitli moleküler dinamiklerin incelenmesini neredeyse imkansız hale getiren çeşitli sınırlamalar sunar. İlk olarak, büyüklükleri değişen ESC kolonilerinin kullanılması, her deney için başlangıç hücre sayısını kontrol etmeyi zorlaştırır. Bu, spesifik sinyal yollarını aktive ederek farklı şekilde gelişen, hücre farklılaşmasının değişmesine yol açan ve dolayısıyla belirli bir zaman noktasında tek tip bir numune oluşturmayan çeşitli şekil ve çaplarda NS üretimi ile sonuçlanır. İkincisi, aynı plakada birden fazla NS'nin kültürlenmesi, genellikle^14'ü bir araya getirmelerine ve potansiyel olarak komşularının mikro çevresini ve dolayısıyla gelişimlerini etkileyen sinyal moleküllerini serbest bırakmalarına yol açar. Toplamda, bu prosedürler numuneler ve deneyler arasında çok fazla değişkenlik oluşturur.

Burada, TC ile muamele edilmemiş U tabanlı 96 oyuklu plakalarda fare ESC'yi (mESC) toplayarak CNCC üretebilen tek NS üreten bu zorlukların üstesinden gelmek için bir strateji sunuyoruz. mESC'den başlamak, halihazırda kurulmuş nöral krest hücre hatlarından başlamaya kıyasla spesifikasyon sürecini ve CNCC gelişiminin erken aşamalarını incelemeye izin verir. Bu protokol, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için mESC kolonilerinin ayrılmasıyla başlar, ardından TC ile muamele edilmemiş U tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda belirli sayıda mESC'nin tohumlanması ile başlar. Hücreler iki gün boyunca toplanmaya bırakılır ve daha sonra NS'nin plaka tabanına yapışabileceği, TC ile muamele edilmemiş düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya taşınır. Bu protokol, farklılaşma işlemi sırasında her NS'nin başlangıç hücre sayısını ve mikro ortamını kontrol ederek, numune değişkenliğini azaltır ve bu da deneysel tekrarlanabilirliği artırır. Bunun, farklı kültür koşullarının etkisini test etmek veya gen bozulma ekranları gerçekleştirmek gibi çoğullanmış deneyler tasarlamak için uygun bir platform olacağına inanıyoruz.

Protokol

1. Fare ESC kolonilerinden tek hücreli bir süspansiyonun üretilmesi

NOT: Bu protokol, jelatin kaplı TC ile muamele edilmiş 6 oyuklu bir plakada inaktive edilmiş besleyiciler üzerinde büyütülen CK35 mESC'nin (germ hattı iletimi için yetkin bir mESC hattı, daha sonra in vivo modeller¹⁵ geliştirme seçeneğine sahip olmak için) kullanımına uyarlanmıştır. TC ile muamele edilmiş 6 oyuklu bir plakanın bir kuyucuğu yaklaşık 1,5 × 10⁶ mESC vermelidir, bu da protokolün geri kalanı için yeterlidir. Gerekirse bu ölçeklendirilebilir. İlk adımları, seçilen ESC gerinim ve bakım kültürü yönteminin yanı sıra uygun kültür ortamına göre ayarlayın. Bu protokol steril koşullar altında yapılmalıdır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. mESC kültür ortamında yetiştirilen %70-80'lik bir birleşimde mESC'den başlayın. Bu çalışmada kullanılan mESC kültür ortamı bileşimi için Tablo 1'e bakınız.
   NOT: mESC'nin %80'in üzerinde birleşmesine izin vermeyin, çünkü farklılaşmaya başlayacaklar ve bu, toplama sürecini etkileyecektir. Koloniler kompakt olmalı ve sağlıklı bir morfoloji göstermelidir (çatlak veya dalga yok, belirgin nükleer-sitoplazma kontrastı).
2. CNCC farklılaşma ortamını hazırlayın. CNCC farklılaşma ortamı bileşimi için Tablo 1'e bakınız.
   NOT: Büyüme faktörleri eklendikten sonra, ortam 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklanabilir. Ortamın ışıktan korunduğundan emin olun.
3. DMEM-Knockout ortamında 2 mg / mL konsantrasyonda taze bir kollajenaz çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Kollajenaz kullanımı, besleyicilerin değil, yalnızca kolonilerin ayrılmasını sağlar, çünkü aşağıdaki adımlardaki varlıkları NS agregasyonunu engelleyecektir. 0.22 μm'lik bir filtre ile kullanmadan önce kollajenaz çözeltisini filtreleyin.
4. ESC ortamını mESC'den aspire edin.
5. Kuyu kenarına yavaşça 1 mL PBS ekleyin. Eşit yıkamayı sağlamak için plakayı hafifçe sallayın.
6. PBS'yi çıkarın ve 2 mL kollajenaz çözeltisi ile değiştirin. 37 °C'de 30-45 dakika inkübe edin.
   1. Plakayı ilk 20 dakikadan sonra ve daha sonra her 5 dakikada bir 10x büyütmede bir ışık mikroskobu altında kontrol edin.
   2. Koloniler kıvrılmış kenarlar gösterdiğinde, plaka tarafına kuvvetlice vurun ve koloniler ayrılacaktır.
7. 5 mL'lik bir serolojik pipet ile kolonileri toplayın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   NOT: Artık koloniler için plakayı ışık mikroskobu altında kontrol edin. Bunlar bir PBS yıkama ile toplanabilir.
8. Kolonileri oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 16 × g'da santrifüjleyin.
9. Tüpün altındaki kolonileri rahatsız etmemeye dikkat ederek konik tüpten mümkün olduğunca fazla besiyeri aspire edin.
10. 1 mL% 0.05 tripsin çözeltisi ekleyin ve tüpü 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
11. Önce bir p1000 ve ardından bir p200 mikropipet ile kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek tüpteki kolonileri ayırın.
    NOT: Bu, tek hücreli bir süspansiyonun elde edilmesini sağlar.
12. Tripsini bloke etmek için 2 mL mESC kültür ortamı ekleyin ve RT'de 3 dakika boyunca 160 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 1 mL CNCC farklılaşma ortamı ekleyin.
13. Üretici talimatlarını izleyerek otomatik bir hücre sayma cihazı veya mikroskop altında standartlaştırılmış bir sistem kullanarak hücreleri sayın.
14. Saydıktan sonra, 50 μL'de 3000 canlı hücre konsantrasyonu elde etmek için yeterli CNCC farklılaşma ortamı ile seyreltin.
15. Bir p200 mikropipet kullanarak, TC ile muamele edilmemiş U-tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL hücre süspansiyonu tohumlayın, daha sonra kuyuyu CNCC farklılaşma ortamı ile 200 μL'ye kadar doldurun.
    NOT: Plakayı doldururken, homojen bir konsantrasyon elde etmek için zaman zaman tek hücreli süspansiyonu bir p1000 mikropipet ile yeniden süspanse edin.
16. Gece boyunca 37 °C, %5 CO_2'de bir inkübatörde inkübe edin.

2. CNCC farklılaşması için düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarma

1. Ertesi gün (1. gün), plakayı ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Her kuyucuğun dibinde net kenarlıkları olan küçük bir hücre kümesinin göründüğünden emin olun. Plakayı gece boyunca inkübatöre geri koyun.
   NOT: Ana agreganın etrafında bazı hücreler olabilir, bazıları ölü olabilir. Bu, NS toplamayı engellemez.
2. 2. günde, her kuyucuktan yavaşça 100 μL ortam çıkarın.
   1. Ortamı aspire ederken, NS'yi çıkarmamaya dikkat edin. Bunu yapmaktan kaçınmak için pipet ucunu yüzeye yakın ve alttan uzağa yerleştirin.
3. Bir p200 mikropipetin ucunu uçtan yaklaşık 3-4 mm uzakta kesin. NS'yi kalan ortamla aspire etmek için bunu kullanın.
   NOT: NS'yi almayı kolaylaştırmak için, aspire etmeden önce birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
4. NS'yi ve kalan ortamı, TC ile muamele edilmemiş düz tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve aktarımı bir ışık mikroskobu altında doğrulayın, ardından her yeni kuyucuğu 100 μL önceden ısıtılmış CNCC farklılaştırma ortamı ile doldurun. NS'yi 4. güne kadar 37 °C, %5 CO_2'de inkübatörde bırakın.
5. 4. günde, her oyuktan 100 μL ortamı çıkarın ve 100 μL önceden ısıtılmış CNCC farklılaştırma ortamı ile değiştirin.
   NOT: Plakanın altındaki NS ekinin bozulmasını önlemek için, ortamı yavaşça aspire edin ve değiştirin.
6. 5. ve 6. günlerde, NS ekini ışık mikroskobu altında kontrol edin. NS'den delaminasyona uğrayan daha hafif hücrelerin NS'nin ana gövdesini çevreleyeceğinden emin olun.
7. 7. günde, ortamı 2.5'te açıklandığı gibi değiştirin. Etüdün son noktasına kadar her 2 günde bir aynı prosedürle ortamı değiştirin.

3. CNCC geçişi ve bakımı

NOT: CNCC geçişi, NS çevresinde görünür yeterli miktarda hücre olduğu anda gerçekleştirilebilir. Bu, 7. gün kadar erken olabilir, çünkü daha önceki zaman noktaları yeterli miktarda CNCC sağlamaz.

1. CNCC Bakım ortamını hazırlayın. CNCC Bakım ortamı bileşimi için Tablo 1'e bakın.
   1. Ortama eklemeden önce, çözündürüldükten sonra BSA'yı 0.22 μm'lik bir filtreden süzün. Büyüme faktörleri eklendikten sonra, ortamı 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın. Ortamın ışıktan korunduğundan emin olun.
2. PBS'de 7.5 μg / mL'de fibronektin hazırlayın. Kuvvetlice karıştırın.
3. Oyuk başına 100 μL fibronektin çözeltisi ekleyerek TC ile muamele edilmemiş 96 oyuklu bir plakanın kuyularını kaplayın. RT'de 30 dakika kaputun altında kaplamaya izin verin.
   NOT: CNCC, immünofloresan boyama için tasarlanmışsa, kaplamadan önce kuyunun dibine steril bir cam lamel yerleştirin. Sürgünün kuyunun dibinde kaldığından ve kullanılacak olanın karşı tarafının kaplanmasını önlemek için yüzmediğinden emin olun. CNCC sabitleme ve montajı için bölüm 5'teki talimatları izleyin.
4. Bu arada, TC ile muamele edilmemiş düz tabanlı 96 oyuklu plakada, kuyucuklardan mümkün olduğunca fazla CNCC farklılaşma ortamını aspire edin ve 50 μL akaktaz ile değiştirin. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin.
5. İnkübasyondan sonra, accutaze'i söndürmek için kuyu başına 100 μL CNCC bakım ortamı ekleyin. Fibronektin'i, TC ile muamele edilmemiş düz tabanlı 96 oyuklu plakanın kuyucuklarından çıkarın. Ayrılmış göç sonrası CNCC'yi, alıcı TC muameleli olmayan düz tabanlı 96 oyuklu plakanın kuyusunun üstündeki 40 μm'lik bir filtreden geçirerek filtreleyin.
   NOT: Bu, daha önce kaldırılmamış hücre kümelerini veya kalan NS'leri filtreleyecektir. Aynı durumda yetiştirilen CNCC, daha sonra TC ile muamele edilmiş 6 oyuklu bir plakanın aynı kuyucuğuna ekilmek üzere 50 mL'lik bir tüpte toplanabilir. Bu durumda, kuyuyu 1 mL fibronektin ile kaplayın ve accutaze'i söndürmek için 1 mL CNCC bakım ortamı kullanın.
6. Göç sonrası CNCC'nin 37 ° C'de 15-30 dakika bağlanmasına izin verin. Ortamı atın ve 100 μL CNCC bakım ortamı ile değiştirin. Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
   NOT: Hızlı akış, CNCC'nin nöral türevlere farklılaşmasına neden olduğu için ortamı yavaşça ekleyin. 6 oyuklu bir formatta çalışıyorsanız, 1 mL CNCC bakım ortamı kullanın.

4. İmmünofloresan için NS fiksasyonu ve montajı

1. İstenilen zaman noktasında, NS'yi TC ile muamele edilmemiş düz tabanlı 96 oyuklu plakadan, bir p200 mikropipetinin ucunu keserek DNA düşük bağlayıcı 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve NS'yi almak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.
   NOT: Daha sonraki zaman noktalarında (7. günden itibaren), NS gözle görülebilecek kadar büyük olacak, ancak çıkarılması da daha zor olacaktır.
2. NS'nin RT'de 3 dakika tüpe yerleşmesine izin verin, mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın ve 1 mL soğuk PBS ile durulayın.
   NOT: Erken zaman noktalarından (3-4. günlerden önce) küçük NS aktarıyorsanız, NS'nin dibe oturmasını sağlamak için 3 dakika boyunca 16 × g'da döndürün.
3. PBS'yi çıkarın ve kimyasal bir başlıkta PBS'de 2 mL% 4 PFA ile değiştirin. RT'de 20 dakika inkübe edin.
   1. % 4 PFA çözeltisi ekledikten sonra tüpü yavaşça ters çevirin ve yan taraftaki sabitleme sırasında dinlenmeye bırakın. Amaç, NS'yi hafifçe yaymaktır, böylece bu adımda birbirine yapışmazlar.
4. % 4 PFA çözeltisini (kimyasal başlıkta) çıkarın ve NS'yi 1 mL soğuk PBS /% 0.5 Tween20 ile yıkayın. 3 dakika RT'de yerleşmesine izin verin. Bunu toplamda 3 kez tekrarlayın.
   NOT: NS en alta yerleşecektir.
5. PBS /% 0.5 Tween20'yi çıkarın ve 2 mL PBS /% 0.1 Triton X-100 ekleyin. Tüpü ters çevirin ve yan tarafta dinlenmesine izin verin. RT'de 1 saat inkübe edin.
6. NS'yi adım 4.4'te belirtildiği gibi soğuk PBS/%0.5 Tween20'de 3 kez yıkayın.
7. PBS/%0,5 Tween20'yi çıkarın ve PBS'de 4 °C'de en az 1 saat, tercihen gece boyunca %2 BSA ile bloke edin.
   NOT: Numuneler, 4 °C'de 1 haftaya kadar %2 BSA/PBS'de saklanabilir. Işıktan koruyun.
8. Primer antikorun doğru seyreltmesini 500 μL'lik bir son hacimde% 2 BSA / PBS'ye ekleyerek primer antikor solüsyonu hazırlayın. Bu çalışmada kullanılan primer antikor karışımı için Tablo 2'ye bakınız.
9. Blokaj solüsyonunun mümkün olduğu kadar çoğunu çıkarın ve bir p200 mikropipetinin ucunu keserek NS'yi 0,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
10. Birincil antikor solüsyonunu ekleyin ve NS'yi yeniden süspanse etmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Gece boyunca 4 °C'de bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
11. NS'yi RT'de 5 dakika boyunca soğuk PBS'de 3 kez yıkayın.
12. Tercih edilen ikincil antikorları% 2 BSA / PBS'de seyrelterek ve 1/1000 DAPI ekleyerek ikincil antikor çözeltisini hazırlayın. Bu çalışmada kullanılan ikincil antikor karışımı için Tablo 2'ye bakınız.
    NOT: Tüpleri ışıktan koruyun.
13. PBS'yi 500 μL ikincil antikor çözeltisi ile değiştirin ve tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarın. RT'de döndürücü üzerinde 1 saat inkübe edin.
14. NS'yi adım 4.11'de belirtildiği gibi soğuk PBS'de 3 kez yıkayın.
15. NS'yi aspire etmeden mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın, yerine 50 μL temizleme maddesi koyun ve üretici talimatlarını izleyin.
16. Işıktan korunarak gece boyunca RT'de inkübe edin.
17. Montaj odalarını hazırlayın.
    1. Bir mikroskop lamına üç kat çift taraflı bant yerleştirin. Montaj haznesinde kalıntıları önlemek için şeffaf, lifsiz bant kullanın.
    2. Bir tıraş bıçağı kullanarak çift bantta 3 mm × 8 mm'lik bir pencere kesin.
       NOT: Hazne boyutları, numune zaman noktasına bağlıdır. Bu örnek, daha sonraki zaman noktalarında (7-9. günler) 10-20 tek NS için en uygun olan 50 μL montaj ortamını barındırmak için uygundur.
18. Bir stereoskop altında, düşük yapışma özelliğine sahip bir p200 mikropipet ucu keserek temizleme maddesindeki NS'yi dikkatlice montaj odasına aktarın. Tüm odanın görüş alanını sağlamak için 2x ile 4x arasında bir büyütme ve NS'yi tanımlamak için yeterli büyütme kullanın. Stereoskop floresan görüntüleme için donatılmışsa, mavi bir floresan filtresiyle çalışmak NS'yi tanımlamayı kolaylaştıracaktır, çünkü DAPI boyaması aksi takdirde şeffaf olan NS'yi öne çıkaracaktır.
    NOT: Ortamın haznenin üzerinde hafif dışbükey bir menisküs oluşturduğunu doğrulayın. Bu, haznede kabarcık olmamasını sağlayacaktır.
19. Yüzeye bir lamel yerleştirin ve yapışmasını sağlamak için yanlarına hafifçe bastırın. Bu adımı stereoskop altında gerçekleştirin ve NS'nin odanın dışına itilmediğini doğrulayın.
20. Görüntülemeye kadar ışıktan koruyarak 4 °C'de saklayın.

5. İmmünofloresan için CNCC fiksasyonu ve montajı

1. CNCC bakım ortamını kuyulardan çıkarın ve PBS ile yıkayın. Kuyunun kenarına pipetleyerek PBS'yi nazikçe ekleyin.
2. Adım 4.3-4.14'te açıklandığı gibi fiksasyon, geçirgenlik ve boyama ile devam edin.
3. Lameli bir mikroskopi cam lam üzerine monte ederek monte edin, lamel cımbız kullanarak lamel tutun ve göç sonrası CNCC cam slayta bakacak şekilde döndürün ve damlanın üzerine yerleştirin.
   1. İsteğe bağlı: Lameli oje veya diğer yaygın olarak kullanılan sızdırmazlık sistemleriyle kapatın.
4. Görüntülemeye kadar ışıktan koruyarak 4 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Protokolü takiben, mESC kolonileri ayrıldı ve 3000 hücre, TC ile muamele edilmemiş U-dipli 96 oyuklu plakalara ekildi. 2. günde, agrega NS, yapışmalarına izin vermek için TC ile muamele edilmemiş düz tabanlı 96 oyuklu plakalara aktarıldı. NS toplama protokolünün basitleştirilmiş bir görselleştirmesi Şekil 1A'da verilmiştir. NS 9. güne kadar kültürlendi ve daha sonra immünofloresan boyama için işlendi. NS'den plakaya göç eden h?...

Tartışmalar

İn vitro 3D farklılaşma modelleri, 2D hücre kültüründe gözlemlenmesi zor olabilecek veya edilemeyecek karmaşık hücre etkileşimlerinin analiz edilmesine izin verir. CNCC gelişimini in vitro olarak incelemek için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bunlar genellikle doğrudan ESC kolonilerinden ^7,21 veya doku eksplantlarından^22,23 türeti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	ClearLine	146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter Tips	Dutscher	713263
40 µm filters	Falcon	352340
5 mL Serological pipette	Starstedt	86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
Accutase	Merck-Sigma	A6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A31571
Antibiotic-antimycotic solution	Merck-Sigma	A5955
B27 PLUS supplement	Thermofisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin (BSA)	Merck-Sigma	A9418
Chloroform	Carlo Erba	438601
Collagenase Type IV	Thermofisher Scientific, Gibco	17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well plates	Corning	3516
Cover glasses, round	VWR	630-2113
DMEM KnockOut	Thermofisher Scientific	10829018
DMEM/F12+Glutamax	Thermofisher Scientific	10565018
DMEM high glucose	Merck-Sigma	D0822
DNA LoBind Tubes, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermofisher Scientific	10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher Scientific	14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL	Eppendorf	30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL	Eppendorf	30120094
ESGRO mLIF Medium Supplement	Merck-Sigma	ESG1107
Ethanol 70%	Carlo Erba	528170
Fetal Bovine Serum	Merck-Sigma	F7524
Fibronectin	Merck-Sigma	F085-2MG
Fluoromount-G	Invitrogen	00-4958-02
Gelatin solution	Merck-Sigma	ES-006-B
GlutaMAX	Thermofisher Scientific	35050061
Human EGF	Peprotech	AF-100-15-500UG
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human SOX9 Antibody	R&Dsystems	AF3075
Insulin from bovine pancreas	Merck-Sigma	I6634
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	PAX7
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
Neurobasal Medium	Thermofisher Scientific	21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottom	Falcon	351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottom	Falcon	351177
Paraformaldehyde 16% solution, em grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Propan-2-ol	Carlo Erba	415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) Antibody	Biolegend	MMS-435P
RapiClear 1.47	Sunjin Lab	RC147001
RapiClear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 m			Clear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Meridian Bioscience	BIO-98020
Sterile Disposable Surgical Scalpels	Swann-Morton	05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton X-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP
TRIzol Reagent	FisherScientific	15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
Tween-20	Fisher Scientific	10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)	Cell signaling technology	E7E2G
β-mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	31350010