Трехмерный протокол дифференцировки клеток нервного гребня черепа in vitro для мультиплексного анализа

Резюме

Мы представляем трехмерный (3D) протокол дифференцировки in vitro , генерирующий нейросферы воспроизводимого размера для производства клеток черепного нервного гребня из эмбриональных стволовых клеток мыши. Мы показываем, что эта методология снижает вариабельность по сравнению с предыдущими протоколами и как она может быть использована для мультиплексного анализа для изучения развития клеток черепного нервного гребня.

Аннотация

Обладая замечательной способностью генерировать как эктодермальные, так и мезенхимальные производные, клетки черепного нервного гребня (CNCC) привлекли большой интерес к изучению механизмов, регулирующих решения о судьбе и пластичность клеток. Возникнув в дорсальном нейроэпителии, эта клеточная популяция является преходящей и относительно редкой в развивающемся эмбрионе, что затрудняет проведение функциональных тестов, геномных скринингов и биохимических анализов in vivo. Чтобы преодолеть эти ограничения, было разработано несколько методов моделирования развития CNCC in vitro. Методы культивирования, основанные на нейросфере (NS), обеспечивают сложное микроокружение, которое повторяет развивающийся передний нейроэпителий в 3D. Эти системы позволяют выращивать много NS в одной и той же пластине для получения большого количества CNCC, но полученные NS имеют высокую вариабельность формы, размера и количества образующихся CNCC, что затрудняет проведение количественных анализов. В этом протоколе описан воспроизводимый метод получения NS из эмбриональных стволовых клеток мыши (mESC) в формате 96 лунок. НС, генерируемые в 96-луночных планшетах, производят клетки черепного нервного гребня (CNCC), которые могут быть дополнительно культивированы. Контролируя количество исходных ячеек, этот подход уменьшает вариабельность размера и формы между NS и повышает воспроизводимость в экспериментах. Наконец, эта система культивирования может быть адаптирована к нескольким приложениям и обеспечивает более высокую степень гибкости, что делает ее легко настраиваемой и пригодной для экспериментальных условий мультиплексирования.

Введение

Клетки нервного гребня черепа (CNCC) представляют собой популяцию стволовых клеток, которая возникает в самой передней части развивающегося эмбриона, на границе между нервной пластинкой и поверхностной эктодермой¹. Затем CNCC подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (EMT), отделяются от нейроэпителия и мигрируют дорсовентрально к различным местам эмбриона, где они дифференцируются в широкий спектр типов клеток². Изучение этой клеточной популяции представляет большой интерес, поскольку она обладает замечательной пластичностью3 и уникальной способностью дифференцироваться как в эктодермальные, так и в мезенхимальные производные, такие как черепно-лицевые кости и хрящи4^. Несмотря на то, что CNCC относительно доступны в эмбрионах, они представляют собой транзиторную популяцию с низким количеством клеток, что затрудняет проведение системных механистических исследований in vivo. В последние несколько лет клеточные линии CNCC были выделены и охарактеризованы для преодоления этих ограничений. В частности, клеточная линия O9-1 CNCC является отличным инструментом для изучения мигрирующего и постмиграционного развития нервного гребня ^5,6; Однако эта клеточная линия не позволяет изучать ранние события, предшествующие миграции, что приводит к индукции и спецификации нервного гребня. В связи с этим были достигнуты значительные успехи в разработке протоколов дифференцировки in vitro для дифференцировки CNCC в чашке с использованием 3D-структур, напоминающих развивающийся нейроэпителий, называемый нейросферами (NS)^7,8-, полученными после дифференцировки колоний эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). Эти 3D-протоколы надежно производят большое количество CNCC, что позволяет проводить биохимические и геномные механистические исследования ^9,10. NS культивируют на пластинах с низким прикреплением в среде с добавками N2B27 вместе с фактором роста фибробластов (FGF) и эпидермальным фактором роста (EGF)^10,11 для стимуляции пролиферации клеток. Эти протоколы проводят в чашках Петри, культивируя многочисленные НС в одной и той же тарелке. В растущем НС клетки агрегируются и продолжают делиться, достигая при созревании диаметра 100-200 мкм. При созревании (примерно на 5-й день) NS прикрепляются к субстрату и дифференцируются в CNCC, напоминая их in vivo аналоги ^9,12. Затем эти ЧПУ проходят ЭМП и расслаиваются на поверхности пластины. Морфологические различия могут наблюдаться в зависимости от размера NS, так как более крупные сферы будут казаться темнее в ядре из-за меньшей доступности питательных веществ и кислорода, что приведет к апоптозу^{клеток 13}. Несмотря на то, что этот тип процедуры генерирует большое количество CNCC в конечной точке дифференцировки, он имеет ряд ограничений, что делает изучение различной молекулярной динамики, происходящей в процессе дифференцировки, практически невозможным. Во-первых, использование колоний ЭСК, которые различаются по размеру, затрудняет контроль начального количества клеток для каждого эксперимента. Это приводит к образованию НС различной формы и диаметра, которые развиваются по-разному за счет активации специфических сигнальных путей, что приводит к изменению дифференцировки клеток и, таким образом, не образует однородную выборку в данный момент времени. Во-вторых, культивирование нескольких NS в одной пластине часто приводит к тому, что они сливаются^{вместе и} потенциально высвобождают сигнальные молекулы, которые влияют на микроокружение их соседей и, таким образом, на их развитие. В целом, эти процедуры порождают большую вариативность между образцами и экспериментами.

В данной статье мы представляем стратегию преодоления этих трудностей, которая позволяет создавать одиночные НСЗ, способные производить CNCC, путем агрегации мышиного ESC (mESC) в 96-луночных планшетах с U-образным дном, не обработанных TC. Начиная с mESC позволяет изучить процесс спецификации и ранние стадии развития CNCC по сравнению с началом работы с уже созданными линиями клеток нервного гребня. Этот протокол начинается с дезагрегации колоний mESC для получения суспензии одиночных клеток, за которым следует посев определенного количества mESC в каждую лунку 96-луночного планшета с U-образным дном, не обработанным TC. Ячейки оставляют для агрегатирования в течение двух дней, а затем перемещают в 96-луночный планшет с плоским дном, не обработанный ТС, в котором NS сможет прикрепиться к дну планшета. Контролируя количество исходных клеток и микроокружение каждой NS в процессе дифференцировки, этот протокол снижает вариабельность образца, что повышает воспроизводимость эксперимента. Мы считаем, что это будет удобная платформа для разработки мультиплексных экспериментов, таких как тестирование влияния различных условий культивирования или проведение скрининга генных возмущений.

протокол

1. Получение суспензии одиночных клеток из колоний ESC мышей

Примечание: Данный протокол адаптирован к использованию CK35 mESC (линия mESC, отвечающая за передачу зародышевой линии, чтобы затем иметь возможность разработки in vivo модели¹⁵), выращенной на инактивированных питателях в покрытом желатином 6-луночном планшете, обработанном TC. Одна скважина из 6-луночной пластины, обработанной ТС, должна давать примерно 1,5 × 10⁶ мЭСК, что достаточно для остальной части протокола. При необходимости его можно масштабировать. Отрегулируйте начальные шаги в соответствии с выбранным штаммом ESC и методом поддерживающей культуры, а также с подходящей питательной средой. Этот протокол должен выполняться в стерильных условиях. Подробные сведения обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

1. Начните с mESC при 70%-80% конфлюенции, выращенной в культуральной среде mESC. В таблице 1 приведен состав питательной среды mESC, использованный в данном исследовании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте mESC разрастаться более чем на 80% слиянию, так как они начнут дифференцироваться, и это повлияет на процесс агрегации. Колонии должны быть компактными и иметь здоровую морфологию (без трещин и волн, отчетливый ядерно-цитоплазменный контраст).
2. Приготовьте среду для дифференцировки ЧПУ. В таблице 1 приведен состав среды для дифференцировки CNCC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления факторов роста среду можно хранить до 3 недель при температуре 4 °C. Убедитесь, что среда защищена от света.
3. Приготовьте свежий раствор коллагеназы в концентрации 2 мг/мл в среде DMEM-Knockout.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование коллагеназы гарантирует, что отделятся только колонии, а не питающиеся, так как их присутствие на следующих этапах будет мешать агрегации НС. Перед применением отфильтровать раствор коллагеназы с помощью фильтра 0,22 мкм.
4. Аспирируйте среду ESC из mESC.
5. Аккуратно добавьте 1 мл PBS на стенку лунки. Осторожно покачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное мытье.
6. Удалите PBS и замените 2 мл раствора коллагеназы. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 30-45 минут.
   1. Проверяйте пластину под световым микроскопом при 10-кратном увеличении после первых 20 минут, а затем каждые 5 минут.
   2. Когда колонии обнаружат загнутые края, энергично постучите по стороне пластины, и колонии отделятся.
7. С помощью серологической пипетки объемом 5 мл соберите колонии и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте планшет под световым микроскопом на наличие остатков колоний. Их можно собрать с помощью промывки PBS.
8. Центрифугируйте колонии при 16 × г в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
9. Отсасывайте как можно больше среды из конической трубки, стараясь не потревожить колонии на дне трубки.
10. Добавьте 1 мл 0,05% раствора трипсина и инкубируйте пробирку при 37 °C в течение 5 минут.
11. Диссоциируйте колонии в пробирке путем энергичного пипетирования вверх и вниз, сначала с помощью микропипетки p1000, а затем с помощью микропипетки p200.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает удержание одноклеточной суспензии.
12. Добавьте 2 мл питательной среды mESC для блокирования трипсина и центрифугируйте при 160 × г в течение 3 мин при RT. Удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл среды для дифференцировки CNCC.
13. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного устройства подсчета клеток или стандартизированной системы под микроскопом, следуя инструкциям производителя.
14. После подсчета разбавляют достаточным количеством дифференцировочной среды CNCC для получения концентрации 3000 живых клеток на 50 мкл.
15. С помощью микропипетки p200 засейте 50 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета, не обработанного ТЦ, затем долейте до 200 мкл среду для дифференцировки CNCC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При заполнении планшета время от времени ресуспендируйте суспензию одиночных клеток с помощью микропипетки p1000 для получения однородной концентрации.
16. Инкубировать в течение ночи в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%_CO2.

2. Перенос в 96-луночный планшет с плоским дном для дифференциации CNCC

1. На следующий день (день 1) понаблюдайте за пластиной под световым микроскопом. Убедитесь, что на дне каждой лунки виден один небольшой кластер ячеек с четкими границами. Поставьте тарелку обратно в инкубатор на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вокруг основного агрегата могут быть какие-то клетки, какие-то мертвые. Это не помешает агрегации NS.
2. На 2-й день медленно удалите по 100 мкл среды из каждой лунки.
   1. При аспирации среды будьте осторожны, чтобы не удалить NS. Чтобы избежать этого, расположите наконечник пипетки близко к поверхности и вдали от дна.
3. Отрежьте кончик микропипетки p200 примерно на 3-4 мм от кончика. Используйте это для аспирации NS с оставшейся средой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить захват NS, осторожно проводите пипеткой вверх и вниз пару раз перед аспирацией.
4. Перенесите NS и оставшуюся среду в 96-луночный планшет с плоским дном, не обработанным ТС, и проверьте перенос под световым микроскопом, затем добавьте в каждую новую лунку 100 мкл предварительно подогретой среды для дифференцировки CNCC. Оставьте NS в инкубаторе при температуре 37 °C, 5%_CO2, до 4 дня.
5. На 4-й день удалите по 100 мкл среды из каждой лунки и замените ее 100 мкл предварительно подогретой среды для дифференцировки CNCC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы не нарушить прикрепление NS в нижней части планшета, медленно отсасывайте и заменяйте среду.
6. На 5 и 6 день проверьте насадку NS под световым микроскопом. Убедитесь, что более светлые элементы - расслаивающиеся из NS -начинают окружать основной корпус NS.
7. На 7 день смените среду, как описано в пункте 2.5. Меняйте среду с помощью одной и той же процедуры каждые 2 дня до конечной точки исследования.

3. Приемка и техническое обслуживание CNCC

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассирование CNCC может быть выполнено, как только вокруг NS будет видно достаточное количество клеток. Это может произойти уже на 7-й день, так как более ранние временные точки не обеспечивают достаточного количества CNCC.

1. Подготовьте среду для технического обслуживания CNCC. В таблице 1 приведен состав среды для технического обслуживания CNCC.
   1. Перед добавлением его в среду отфильтруйте БСА после солюбилизации через фильтр 0,22 мкм. После добавления факторов роста храните среду до 3 недель при температуре 4 °C. Убедитесь, что среда защищена от света.
2. Готовят фибронектин в концентрации 7,5 мкг/мл в PBS. Энергично перемешайте.
3. Покройте лунки 96-луночного планшета, обработанного без ТС, добавив 100 мкл раствора фибронектина на лунку. Оставьте пальто под капюшон на 30 минут при температуре RT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если CNCC предназначены для иммунофлуоресцентного окрашивания, поместите стерильный стеклянный покровный стеклоподъемник на дно лунки перед нанесением покрытия. Следите за тем, чтобы предметное стекло оставалось на дне лунки и не плавало, чтобы избежать покрытия противоположной стороны от той, которая будет использоваться. Следуйте инструкциям в разделе 5 по фиксации и монтажу CNCC.
4. В то же время, в 96-луночном планшете с плоским дном, обработанным без ТЦ, отасканируйте как можно больше дифференцировочной среды CNCC из лунок и замените ее 50 мкл аккутазы. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут.
5. После инкубации добавьте 100 мкл поддерживающей среды CNCC в лунку, чтобы погасить аккутазу. Удалите фибронектин из лунок принимающей 96-луночной пластины с плоским дном, не обработанной ТС. Отфильтруйте отделенные постмиграционные ХНК, пропустив их через фильтр 40 мкм в верхней части лунки принимающей 96-луночной пластины с плоским дном, не обработанным ТС.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит отфильтровать скопления клеток или оставшиеся НС, которые ранее не были удалены. CNCC, выращенный в одинаковых условиях, может быть объединен в одну пробирку объемом 50 мл, а затем засеян в ту же лунку, что и 6-луночный планшет, обработанный TC. В этом случае покройте лунку 1 мл фибронектина и используйте 1 мл поддерживающей среды CNCC для гашения аккутазы.
6. Дайте постмиграционному CNCC прикрепиться в течение 15-30 минут при температуре 37 °C. Выбросьте среду и замените ее 100 μл технической среды CNCC. Меняйте среду каждые 2 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно добавляйте среду, так как быстрый поток вызывает дифференцировку CNCC в нейронные производные. При работе в 6-луночном формате используйте 1 мл поддерживающей среды CNCC.

4. Фиксация и крепление NS для иммунофлюоресценции

1. В нужный момент времени перенесите NS из 96-луночного планшета с плоским дном, не обработанным TC, в пробирку с низким связыванием ДНК объемом 2 мл, разрезав кончик микропипетки p200, и осторожно пипетируйте вверх и вниз, чтобы собрать NS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В более поздние моменты времени (день 7 и далее) NS будет достаточно большим, чтобы его можно было увидеть глазом, но его также будет труднее отделить.
2. Дайте NS отстояться в пробирке в течение 3 минут при RT, удалите как можно больше среды и промойте 1 мл холодной PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе малых NS из ранних временных точек (до 3-4 дней) вращайтесь со скоростью 16 × g в течение 3 минут, чтобы убедиться, что NS оседают на дно.
3. Снимите PBS и в химическом колпаке замените 2 мл 4% PFA в PBS. Инкубировать в течение 20 минут при RT.
   1. Медленно переверните трубку после добавления 4% раствора PFA и дайте ей отдохнуть во время фиксации на боку. Цель состоит в том, чтобы немного раздвинуть НС, чтобы они не слипались на этом этапе.
4. Удалите 4% раствор PFA (в химической вытяжке) и промойте NS 1 мл холодного PBS/0,5% Tween20. Дайте ему отстояться при RT в течение 3 минут. Повторите это всего 3 раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: NS осядет на дне.
5. Удалите PBS/0,5% Tween20 и добавьте 2 мл PBS/0,1% Triton X-100. Переверните трубку и дайте ей откоситься сбоку. Инкубировать в течение 1 ч при РТ.
6. Промойте NS 3 раза в холодном PBS/0,5% Tween20, как указано в шаге 4.4.
7. Удалите PBS/0,5% Tween20 и заблокируйте 2% BSA в PBS при 4 °C минимум на 1 час, желательно на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться в 2% BSA/PBS до 1 недели при температуре 4 °C. Беречь от света.
8. Приготовьте раствор первичного антитела путем добавления правильного разведения первичного антитела до 2% БСА/ПБС в конечном объеме 500 мкл. Первичная смесь антител, использованная в этом исследовании, приведена в таблице 2.
9. Удалите как можно больше блокирующего раствора и перенесите NS в пробирку объемом 0,5 мл, разрезав кончик микропипетки p200.
10. Добавьте первичный раствор антитела и медленно пипетка вверх и вниз, чтобы ресуспендировать NS. Инкубировать в течение ночи на ротаторе при температуре 4 °C.
11. Промойте NS 3 раза в холодном PBS в течение 5 минут при RT.
12. Приготовьте раствор вторичного антитела, разбавив вторичные антитела по выбору в 2% BSA/PBS и добавив 1/1000 DAPI. Вторичная смесь антител, использованная в этом исследовании, приведена в таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубки в защищенном от света месте.
13. Замените PBS 500 мкл раствора вторичного антитела и оберните пробирку алюминиевой фольгой, чтобы защитить ее от света. Инкубировать в течение 1 ч на ротаторе при РТ.
14. Промойте NS 3 раза в холодном PBS, как указано в пункте 4.11.
15. Удалите как можно больше PBS без аспирации NS, замените 50 мкл очищающего агента и следуйте инструкциям производителя.
16. Инкубировать в течение ночи в RT, защищенном от света месте.
17. Подготовьте монтажные камеры.
    1. На предметное стекло микроскопа положите три слоя двустороннего скотча. Используйте прозрачную ленту без волокон, чтобы избежать остатков в монтажной камере.
    2. С помощью бритвы вырежьте в двойной ленте окошко диаметром от 3 мм × 8 мм.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры камеры зависят от точки времени выборки. Этот пример подходит для размещения 50 μL монтажной среды, что оптимально для 10-20 одиночных NS в более поздние временные точки (дни 7-9).
18. Под стереоскопом осторожно перенесите NS в очищающем агенте в монтажную камеру, разрезав наконечник микропипетки p200 с низкой адгезией. Используйте увеличение от 2x до 4x, чтобы обеспечить поле зрения всей камеры и достаточное увеличение для идентификации NS. Если стереоскоп оснащен для флуоресцентной визуализации, работа с синим флуоресцентным фильтром облегчит идентификацию НС, так как окрашивание DAPI выделит прозрачную НС.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что среда образует небольшой выпуклый мениск над камерой. Это обеспечит отсутствие пузырьков в камере.
19. Положите покровное стекло на поверхность и слегка надавите на его боковые стороны, чтобы он прилипал. Выполните этот шаг под стереоскопом и убедитесь, что NS не выталкиваются за пределы камеры.
20. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до момента визуализации.

5. Фиксация и крепление CNCC для иммунофлюоресценции

1. Удалите техническую среду CNCC из лунок и промойте их PBS. Аккуратно добавьте PBS с помощью пипетки на боковой стороне лунки.
2. Продолжайте фиксировать, пермеабилизацию и окрашивание, как описано в шагах 4.3-4.14.
3. Закрепите покровные стекла на предметном стекле для микроскопии, добавив монтажный материал на предметное стекло, захватив и повернув покровное стекло с помощью пинцета так, чтобы постмиграционный CNCC был обращен к стеклянному предметному стеклу, и поместив его на каплю.
   1. Дополнительно: Запечатайте покровное стекло лаком для ногтей или другими широко используемыми уплотнительными системами.
4. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до момента визуализации.

Результаты

В соответствии с протоколом колонии mESC были диссоциированы, и 3000 клеток были засеяны в 96-луночные планшеты, не обработанные TC. На 2-й день агрегированные NS были перенесены в 96-луночные планшеты с плоским дном, не обработанные TC, чтобы их можно было прикрепить. Упрощенная...

Обсуждение

Модели 3D-дифференцировки in vitro позволяют анализировать сложные клеточные взаимодействия, которые могут быть затруднены или не могут наблюдаться в двухмерных культурах клеток. Было разработано несколько моделей для изучения развития CNCC in vitro. Как правило, он...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	ClearLine	146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter Tips	Dutscher	713263
40 µm filters	Falcon	352340
5 mL Serological pipette	Starstedt	86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
Accutase	Merck-Sigma	A6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A31571
Antibiotic-antimycotic solution	Merck-Sigma	A5955
B27 PLUS supplement	Thermofisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin (BSA)	Merck-Sigma	A9418
Chloroform	Carlo Erba	438601
Collagenase Type IV	Thermofisher Scientific, Gibco	17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well plates	Corning	3516
Cover glasses, round	VWR	630-2113
DMEM KnockOut	Thermofisher Scientific	10829018
DMEM/F12+Glutamax	Thermofisher Scientific	10565018
DMEM high glucose	Merck-Sigma	D0822
DNA LoBind Tubes, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermofisher Scientific	10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher Scientific	14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL	Eppendorf	30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL	Eppendorf	30120094
ESGRO mLIF Medium Supplement	Merck-Sigma	ESG1107
Ethanol 70%	Carlo Erba	528170
Fetal Bovine Serum	Merck-Sigma	F7524
Fibronectin	Merck-Sigma	F085-2MG
Fluoromount-G	Invitrogen	00-4958-02
Gelatin solution	Merck-Sigma	ES-006-B
GlutaMAX	Thermofisher Scientific	35050061
Human EGF	Peprotech	AF-100-15-500UG
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human SOX9 Antibody	R&Dsystems	AF3075
Insulin from bovine pancreas	Merck-Sigma	I6634
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	PAX7
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
Neurobasal Medium	Thermofisher Scientific	21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottom	Falcon	351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottom	Falcon	351177
Paraformaldehyde 16% solution, em grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Propan-2-ol	Carlo Erba	415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) Antibody	Biolegend	MMS-435P
RapiClear 1.47	Sunjin Lab	RC147001
RapiClear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 m			Clear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Meridian Bioscience	BIO-98020
Sterile Disposable Surgical Scalpels	Swann-Morton	05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton X-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP
TRIzol Reagent	FisherScientific	15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
Tween-20	Fisher Scientific	10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)	Cell signaling technology	E7E2G
β-mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	31350010