多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

要約

マウス胚性幹細胞から脳神経堤細胞を作製するための再現性のあるサイズのニューロスフェアを生成するための三次元(3D) in vitro 分化プロトコルを提示します。この方法論は、以前のプロトコルと比較して変動性を低減し、脳神経堤細胞の発生を研究するためのマルチプレックスアッセイにどのように使用できるかを示します。

要約

脳神経堤細胞(CNCC)は、外胚葉および間葉系の両方の誘導体を生成する優れた能力により、細胞の運命決定と可塑性を調節するメカニズムの研究に多くの関心を集めています。背側神経上皮に由来するこの細胞集団は、発生中の胚では一過性で比較的まれであるため、機能試験、ゲノムスクリーニング、および生化学アッセイを in vivoで実施することは困難です。これらの制限を克服するために、 in vitro でCNCC開発をモデル化するためのいくつかの方法が開発されています。ニューロスフェア(NS)ベースの培養法は、発達中の前神経上皮を3Dで再現する複雑な微小環境を提供します。これらのシステムにより、同じプレート内で多数のNSを増殖させて大量のCNCCを生成することができますが、生成されたNSは、形状、サイズ、および形成されるCNCCの数に大きなばらつきがあり、定量アッセイの実施が困難になります。このプロトコールは、マウス胚性幹細胞(mESC)から96ウェルフォーマットでNSを生成するための再現性のある方法を概説しています。96ウェルプレートで作製したNSは、脳神経堤細胞(CNCC)を産生し、さらに培養することができます。このアプローチでは、開始細胞の数を制御することで、NS間のサイズと形状のばらつきを減らし、実験間の再現性を向上させます。最後に、この培養システムはいくつかのアプリケーションに適応でき、より高い柔軟性を提供するため、高度にカスタマイズ可能で、実験条件のマルチプレックス化に適しています。

概要

脳神経堤細胞(CNCC)は、発生中の胚の最前部、神経板と表面外胚葉^との境界に発生する幹様細胞集団である1。その後、CNCCは上皮間葉転換(EMT)を受け、神経上皮から剥離し、胚のさまざまな場所に向かって背腹側に移動し、そこでさまざまな細胞タイプに分化します²。この細胞集団の研究は、顕著な可塑性³と、頭蓋顔面骨や軟骨⁴などの外胚葉および間葉系の両方の誘導体に分化する独自の能力を備えているため、非常に興味深いものです。CNCCは胚内で比較的アクセス可能ですが、細胞数が少ない一過性の集団であるため、in vivoでの全身機構研究を行うことは困難です。CNCC細胞株は、これらの制限を克服するために、ここ数年で単離され、特性評価されてきました。特に、O9-1 CNCC細胞株は、遊走性および遊走後の神経堤の発達を研究するための優れたツールです^5,6。しかし、この細胞株では、神経堤の誘導と仕様化につながる遊走前の初期の事象を研究することはできません。この点で、胚性幹細胞(ESC)コロニーの分化後に得られるニューロスフェア(NS)^7,8と呼ばれる発達中の神経上皮に似た3D構造を使用して、皿中のCNCCを分化するためのin vitro分化プロトコルの開発に重要な進展がありました。これらの3Dプロトコルは、多数のCNCCを堅牢に生成し、生化学的およびゲノムメカニスティック研究の実施を可能にする^9,10。NSは、N2B27添加培地中の低接着プレート上で、線維芽細胞増殖因子(FGF)および上皮成長因子(EGF)^10,11とともに培養され、細胞増殖を刺激します。これらのプロトコルはペトリ皿で行われ、同じプレートで多数のNSを培養します。成長中のNS内では、細胞は凝集して分裂を続け、成熟時には直径100〜200μmに達します。成熟時(約5日目)、NSは基質に付着し、in vivoの対応物^9,12に似たCNCCに分化します。次に、これらのCNCCはEMTを受け、プレート表面に剥離されます。NSのサイズによって形態学的な違いが観察され、大きな球体は栄養素と酸素の利用可能性が低いため、コアで暗く見え、細胞がアポトーシスを受けることになります¹³。このタイプの手順では、分化の終点で多数のCNCCが生成されますが、いくつかの制限があり、分化プロセス中に発生するさまざまな分子動力学の研究はほぼ不可能です。まず、サイズが異なるESCコロニーを使用すると、各実験の開始細胞数を制御することが難しくなります。その結果、特定のシグナル伝達経路を活性化することで異なる形で進行するさまざまな形状や直径のNSが生成され、細胞分化が変化し、特定の時点で均一なサンプルが形成されなくなります。第二に、同じプレートで複数のNSを培養すると、多くの場合、それらが融合し¹⁴、隣接する微小環境、ひいてはそれらの発達に影響を与えるシグナル伝達分子が放出される可能性があります。全体として、これらの手順はサンプルと実験の間に多くのばらつきを生じさせます。

ここでは、非TC処理されたU底96ウェルプレートにマウスESC(mESC)を凝集することにより、CNCCを生成できる単一のNSを生成するこれらの困難を克服する戦略を示します。mESCから開始することで、すでに確立された神経堤細胞株から開始する場合と比較して、CNCC開発の仕様プロセスと初期段階を研究することができます。このプロトコルは、mESCコロニーの脱凝集から始まり、単一細胞懸濁液を得るための後、非TC処理U底96ウェルプレートの各ウェルに特定の数のmESCを播種します。細胞を2日間凝集させた後、非TC処理の平底96ウェルプレートに移し、NSをプレート底に付着させることができます。このプロトコルは、分化プロセス中に各NSの開始細胞数と微小環境を制御することにより、サンプルのばらつきを減らし、実験の再現性を高めます。これは、さまざまな培養条件の影響をテストしたり、遺伝子摂動スクリーニングを実行したりするなど、マルチプレックス実験を設計するための便利なプラットフォームになると考えています。

プロトコル

1. マウスESCコロニーからの1細胞懸濁液の作製

注:このプロトコルは、ゼラチンコーティングされたTC処理された6ウェルプレートの不活化フィーダーで成長したCK35 mESC(生殖細胞株の伝達に適したmESCライン、その後、 in vivo モデル¹⁵を開発するオプションを持つ)の使用に適合しています。TC処理した6ウェルプレートの1ウェルは、約1.5 × 10⁶ mESCを生成する必要があり、これはプロトコルの残りの部分に十分です。これは、必要に応じてスケールアップできます。選択したESC株と維持培養方法、および適切な培地に従って、最初のステップを調整します。このプロトコルは、無菌条件下で実施されます。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. mESC培地で成長させた70%〜80%のコンフルエンスでmESCから開始します。この研究で使用したmESC培地組成については、 表1 を参照してください。
   注: mESC が 80% の合流点を超えて成長すると、分化が始まり、これが集約プロセスに影響を与えるため、mESC を成長させないでください。コロニーはコンパクトで、健全な形態を示す必要があります(亀裂や波がなく、核と細胞質のコントラストがはっきりしています)。
2. CNCC分化媒体を準備します。CNCC分化媒体の組成については 、表1 を参照してください。
   注:成長因子を添加すると、培地は4°Cで最大3週間保存できます。 媒体が光から保護されていることを確認してください。
3. DMEM-Knockout培地で2 mg/mLの濃度の新鮮なコラゲナーゼ溶液を調製します。
   注:コラゲナーゼを使用すると、コロニーのみが分離され、フィーダーは分離されません。これは、次のステップでコロニーが存在するとNS凝集が妨げられるためです。使用前にコラゲナーゼ溶液を0.22 μmフィルターでろ過してください。
4. mESCからESC媒体を吸引します。
5. ウェルの側面にPBS1mLをそっと加えます。プレートを優しく揺らして、均一に洗えます。
6. PBSを除去し、2 mLのコラゲナーゼ溶液と交換します。37°Cで30〜45分間インキュベートします。
   1. 最初の20分後、その後5分ごとに10倍の倍率で光学顕微鏡でプレートを確認します。
   2. コロニーの端が丸まっている場合は、プレート側を強くたたいて、コロニーが分離します。
7. 5 mLの血清ピペットでコロニーを採取し、15 mLのコニカルチューブに移します。
   注意: 光学顕微鏡でプレートにコロニーが残っていないか確認してください。これらはPBSウォッシュで収集できます。
8. コロニーを16 × g で室温(RT)で3分間遠心分離します。
9. 円錐形のチューブからできるだけ多くの培地を吸引し、チューブの底のコロニーを乱さないように注意してください。
10. 0.05%トリプシン溶液1 mLを加え、チューブを37°Cで5分間インキュベートします。
11. チューブ内のコロニーを、最初にp1000で、次にp200マイクロピペットで激しく上下にピペッティングして解離します。
    注:これにより、単一細胞懸濁液を確実に得ることができます。
12. 2 mLのmESC培地を加えてトリプシンをブロックし、室温で160 × g で3分間遠心分離します。上清を取り除き、1 mLのCNCC分化培地を加えます。
13. 自動細胞計数装置または顕微鏡下で標準化されたシステムを使用して、製造元の指示に従って細胞をカウントします。
14. カウント後、十分なCNCC分化培地で希釈して、50 μLあたり3000個の生細胞の濃度を得ます。
15. p200マイクロピペットを使用して、TC処理されていないUボトム96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液50μLを播種し、次にCNCC分化培地でウェルを200μLまで補充します。
    注:プレートを充填している間、p1000マイクロピペットで単一細胞懸濁液を時々再懸濁して、均一な濃度を得てください。
16. インキュベーターで37°C、5%CO₂で一晩インキュベートします。

2. CNCC鑑別のための平底96ウェルプレートへの移し替え

1. 翌日(1日目)は、光学顕微鏡でプレートを観察します。各ウェルの底に明確な境界線を持つ1つの小さなセルクラスターが見えていることを確認します。プレートをインキュベーターに一晩戻します。
   注:メインアグリゲートの周囲には、一部のセルが死んでいる場合があります。これにより、NS集約が妨げられることはありません。
2. 2日目に、各ウェルから100μLの培地をゆっくりと取り出します。
   1. 媒体を吸引するときは、NSを取り外さないように注意してください。これを避けるには、ピペットチップを表面に近づけ、底から離れた場所に置きます。
3. p200マイクロピペットの先端を先端から約3〜4mmのところに切ります。これを使用して、残りの媒体でNSを吸引します。
   注意: NSを拾い上げるのを容易にするために、吸引する前に数回ゆっくりとピペットで上下させます。
4. NSと残りの培地をTC処理されていない平底96ウェルプレートに移し、光学顕微鏡で移し替えを確認した後、新しい各ウェルに100 μLの予熱済みCNCC分化培地を上に置きます。NSをインキュベーターに37°C、5%CO₂ で4日目まで放置します。
5. 4日目に、各ウェルから100 μLの培地を取り出し、100 μLの予熱したCNCC分化培地と交換します。
   注意: プレートの下部にあるNSアタッチメントを邪魔しないように、ゆっくりと吸引して媒体を交換してください。
6. 5日目と6日目は、光学顕微鏡でNSアタッチメントを確認します。NSから剥離するセルがNSの本体を取り囲み始めるのを待ちます。
7. 7日目に、2.5の説明に従って媒体を変更します。同じ手順で、研究のエンドポイントまで 2 日ごとに培地を交換します。

3. CNCCの通過と保守

注:CNCC継代は、NSの周囲に十分な量の細胞が見えるとすぐに実行できます。これは、早い時点では十分な量のCNCCが提供されないため、7日目という早い時期になる可能性があります。

1. CNCCメンテナンスメディアを準備します。CNCCメンテナンス培地の組成については 、表1 を参照してください。
   1. 培地に加える前に、0.22 μmフィルターで可溶化した後、BSAをろ過します。成長因子を添加したら、培地を4°Cで最大3週間保存します。 媒体が光から保護されていることを確認してください。
2. PBSで7.5μg/mLのフィブロネクチンを調製します。激しく混ぜます。
3. TC処理されていない96ウェルプレートのウェルに、ウェルあたり100 μLのフィブロネクチン溶液を加えてコーティングします。RTでボンネットの下に30分間コーティングします。
   注:CNCCが免疫蛍光染色用である場合は、コーティングする前にウェルの底に滅菌ガラスカバースリップを置きます。スライドがウェルの底に留まり、スライドが浮かばないようにして、使用するスライドの反対側をコーティングしないようにしてください。CNCCの固定と取り付けについては、セクション5の指示に従ってください。
4. その間、TC処理されていない平底96ウェルプレートでは、ウェルからできるだけ多くのCNCC分化培地を吸引し、50μLのアキュターゼで置き換えます。37°Cで5分間インキュベートします。
5. インキュベーション後、1ウェルあたり100 μLのCNCC維持培地を加えて、アキュターゼをクエンチします。受ける非TC処理平底96ウェルプレートのウェルからフィブロネクチンを除去します。分離した遊走後CNCCを、受け入れる非TC処理平底96ウェルプレートのウェル上部の40μmフィルターに通すことにより、ろ過します。
   注:これにより、以前に除去されていない細胞の凝集体または残りのNSが除外されます。同じ条件で増殖させたCNCCは、1本の50 mLチューブにプールして、TC処理した6ウェルプレートの同じウェルに播種することができます。この場合、ウェルに1 mLのフィブロネクチンをコーティングし、1 mLのCNCC維持培地を使用してアキュターゼをクエンチします。
6. 渡り後のCNCCを37°Cで15〜30分間取り付けます。 培地を廃棄し、100μLのCNCCメンテナンス培地と交換してください。2日ごとに媒体を交換します。
   注:速い流れがCNCCの神経誘導体への分化を誘発するため、培地を穏やかに加えます。6ウェルフォーマットで作業する場合は、1 mLのCNCCメンテナンス培地を使用してください。

4. 免疫蛍光染色のためのNS固定とマウント

1. 所望の時点で、非TC処理された平底96ウェルプレートからp200マイクロピペットの先端を切断してDNA低結合2mLチューブにNSを移し、ゆっくりと上下にピペッティングしてNSをピックアップします。
   注:後の時点(7日目以降)では、NSは目で見えるほど大きくなりますが、取り外すのも難しくなります。
2. NSをRTで3分間チューブに沈殿させ、できるだけ多くの培地を取り除き、1mLの冷たいPBSですすいでください。
   注:早い時点(3〜4日目より前)から小さなNSを移す場合は、NSが底に落ち着くように、16 × g で3分間回転します。
3. PBSを取り出し、ケミカルフードでPBS中の4%PFAを2mLと交換します。室温で20分間インキュベートします。
   1. 4%PFA溶液を加えた後、チューブをゆっくりと反転させ、側面に固定している間は休ませます。目標は、NSをわずかに広げて、このステップでNSがくっつかないようにすることです。
4. 4% PFA 溶液 (ケミカルフード内) を取り出し、1 mL の冷 PBS/0.5% Tween20 で NS を洗浄します。RTで3分間落ち着かせます。これを合計3回繰り返します。
   注:NSは下部に落ち着きます。
5. PBS/0.5% Tween20を取り出し、PBS/0.1% Triton X-100 2 mLを加えます。チューブを反転させ、側面に置きます。RTで1時間インキュベートします。
6. 手順4.4に示すように、NSを冷たいPBS/0.5%Tween20で3回洗浄します。
7. PBS/0.5% Tween20を除去し、PBS中の2% BSAで4°Cで最低1時間、できれば一晩ブロックします。
   注:サンプルは、2% BSA/PBSに4°Cで最大1週間保存できます。 光から保護してください。
8. 一次抗体溶液を調製するには、最終容量500 μLで2% BSA/PBSに適切な希釈率の一次抗体を添加します。この試験で使用した一次抗体ミックスについては、 表2を参照してください。
9. ブロッキング溶液をできるだけ多く取り除き、p200マイクロピペットの先端を切ってNSを0.5mLチューブに移します。
10. 一次抗体溶液を添加し、ゆっくりと上下にピペットで動かしてNSを再懸濁します。ローテーターで4°Cで一晩インキュベートします。
11. NSを冷たいPBSでRTで5分間3回洗浄します。
12. 選択した二次抗体を2% BSA/PBSで希釈し、1/1000 DAPIを添加して、二次抗体溶液を調製します。この試験で使用した二次抗体ミックスについては、 表2を参照してください。
    注意: チューブを光から保護してください。
13. PBSを500μLの二次抗体溶液に交換し、チューブをアルミホイルで包んで光から保護します。RTのローテーターで1時間インキュベートします。
14. 手順4.11に示すように、NSを冷たいPBSで3回洗浄します。
15. NSを吸引せずにできるだけ多くのPBSを除去し、50μLの清澄剤で置き換え、メーカーの指示に従ってください。
16. 光から保護されたRTで一晩インキュベートします。
17. 取り付けチャンバーを準備します。
    1. 顕微鏡のスライドに、両面テープを3層貼ります。取り付けチャンバー内の残留物を避けるために、透明な繊維のないテープを使用してください。
    2. カミソリを使用して、ダブルテープで3mm×8mmの窓を切ります。
       注:チャンバーの寸法は、サンプルの時点によって異なります。この例は、50 μLの封入剤のホスティングに適しており、後の時点(7〜9日目)で10〜20個の単一NSに最適です。
18. ステレオスコープの下で、低接着性のp200マイクロピペットチップを切断することにより、クリアリング剤中のNSを慎重に取り付けチャンバーに移します。2倍から4倍の間の倍率を使用して、チャンバー全体の視野を確保し、NSを識別するのに十分な倍率を提供します。ステレオスコープが蛍光イメージング用に装備されている場合、青色蛍光フィルターを使用すると、DAPI染色により透明なNSが目立つため、NSの識別が容易になります。
    注:培地がチャンバーの上にわずかに凸状のメニスカスを形成していることを確認します。これにより、チャンバー内に気泡が入らないようにすることができます。
19. カバースリップを表面に置き、側面を軽く押して接着させます。ステレオスコープでこの手順を実行し、NSがチャンバーの外に押し出されていないことを確認します。
20. イメージングまで光を避けて4°Cで保管してください。

5. 免疫蛍光法のためのCNCC固定とマウント

1. CNCC維持培地をウェルから取り出し、PBSで洗浄します。PBSをウェルの側面でピペッティングして静かに加えます。
2. ステップ4.3-4.14で説明されているように、固定、透過化、および染色を進めます。
3. 顕微鏡用スライドガラスにカバースリップを取り付けます。スライドに封入剤を追加し、ピンセットを使用してカバースリップをつかんで回転させ、移動後のCNCCがスライドガラスに面するようにしてドロップに置きます。
   1. オプション:マニキュアまたはその他の一般的に使用されるシーリングシステムでカバースリップを密封します。
4. イメージングまで光を避けて4°Cで保管してください。

結果

プロトコールに従って、mESCコロニーを解離し、3000個の細胞を非TC処理U底96ウェルプレートに播種しました。2日目に、凝集したNSを非TC処理された平底96ウェルプレートに移し、付着させました。NS集約プロトコルの簡略化された視覚化を 図1Aに示します。NSを9日目まで培養し、その後免疫蛍光染色のために処理しました。NSからプレート上に移動...

ディスカッション

In vitro 3D分化モデルにより、2D細胞培養では観察が困難な、または観察できなかった複雑な細胞相互作用を解析できます。in vitroでのCNCC開発を研究するために、いくつかのモデルが開発されています。これらは一般に、ESCコロ^ニー7,21または組織外植片^22,23から直接由?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	ClearLine	146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter Tips	Dutscher	713263
40 µm filters	Falcon	352340
5 mL Serological pipette	Starstedt	86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
Accutase	Merck-Sigma	A6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A31571
Antibiotic-antimycotic solution	Merck-Sigma	A5955
B27 PLUS supplement	Thermofisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin (BSA)	Merck-Sigma	A9418
Chloroform	Carlo Erba	438601
Collagenase Type IV	Thermofisher Scientific, Gibco	17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well plates	Corning	3516
Cover glasses, round	VWR	630-2113
DMEM KnockOut	Thermofisher Scientific	10829018
DMEM/F12+Glutamax	Thermofisher Scientific	10565018
DMEM high glucose	Merck-Sigma	D0822
DNA LoBind Tubes, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermofisher Scientific	10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher Scientific	14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL	Eppendorf	30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL	Eppendorf	30120094
ESGRO mLIF Medium Supplement	Merck-Sigma	ESG1107
Ethanol 70%	Carlo Erba	528170
Fetal Bovine Serum	Merck-Sigma	F7524
Fibronectin	Merck-Sigma	F085-2MG
Fluoromount-G	Invitrogen	00-4958-02
Gelatin solution	Merck-Sigma	ES-006-B
GlutaMAX	Thermofisher Scientific	35050061
Human EGF	Peprotech	AF-100-15-500UG
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human SOX9 Antibody	R&Dsystems	AF3075
Insulin from bovine pancreas	Merck-Sigma	I6634
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	PAX7
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
Neurobasal Medium	Thermofisher Scientific	21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottom	Falcon	351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottom	Falcon	351177
Paraformaldehyde 16% solution, em grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Propan-2-ol	Carlo Erba	415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) Antibody	Biolegend	MMS-435P
RapiClear 1.47	Sunjin Lab	RC147001
RapiClear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 m			Clear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Meridian Bioscience	BIO-98020
Sterile Disposable Surgical Scalpels	Swann-Morton	05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton X-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP
TRIzol Reagent	FisherScientific	15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
Tween-20	Fisher Scientific	10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)	Cell signaling technology	E7E2G
β-mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	31350010