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摘要

我们提出了一种三维 （3D） 体外 分化方案，生成可重复大小的神经球，以从小鼠胚胎干细胞产生颅神经嵴细胞。我们表明，与以前的方案相比，这种方法减少了可变性，以及它如何用于多路检测以研究颅神经嵴细胞发育。

摘要

凭借其产生外胚层和间充质衍生物的非凡能力，颅神经嵴细胞 （CNCC） 在研究调节细胞命运决定和可塑性的机制方面引起了广泛的兴趣。该细胞群起源于背神经上皮，是短暂的，在发育中的胚胎中相对罕见 - 这使得功能测试、基因组筛选和生化测定难以 在体内进行。为了克服这些限制，已经开发了几种方法来模拟体外 CNCC 的发展 。 基于神经球 （NS） 的培养方法提供了一个复杂的微环境，以 3D 形式概括了发育中的前神经上皮。这些系统允许在同一板中生长许多 NS 以产生大量 CNCC，但产生的 NS 在形状、大小和形成的 CNCC 数量上表现出高度可变性 - 使得定量分析难以进行。该方案概述了一种从 96 孔格式的小鼠胚胎干细胞 （mESC） 生成 NS 的可重复方法。在 96 孔板中产生的 NS 产生颅神经嵴细胞 （CNCC），可以进一步培养。通过控制起始细胞的数量，这种方法减少了 NS 之间大小和形状的可变性，并提高了实验之间的可重复性。最后，该培养系统适用于多种应用，并提供更高的灵活性，使其高度可定制，适用于多重实验条件。

引言

颅神经嵴细胞 （CNCC） 是一种干细胞样细胞群，起源于发育中的胚胎的最前部，位于神经板和表面外胚层1 之间的边界。然后 CNCC 经历上皮到间充质转化 （EMT），从神经上皮分层，并向背腹方向迁移到胚胎中的不同位置，在那里它们分化成多种细胞类型2。研究这种细胞群非常有趣，因为它具有非凡的可塑性3 和分化为外胚层和间充质衍生物（如颅面骨和软骨）的独特能力4。尽管 CNCC 在胚胎中相对容易获得，但它们是一个细胞数量较少的瞬时群体，因此难以在体内进行系统机制研究。在过去几年中，已经分离并表征了 CNCC 细胞系以克服这些限制。特别是，O9-1 CNCC 细胞系是研究迁移和迁移后神经嵴发育的绝佳工具 5,6;然而，该细胞系不允许研究导致神经嵴诱导和规范的迁移之前的早期事件。在这方面，体外分化方案的开发取得了重大进展，通过使用类似于胚胎干细胞 （ESC） 集落分化后获得的称为神经球 （NS）7,8- 的发育中的神经上皮细胞的 3D 结构来区分培养皿中的 CNCC。这些 3D 方案稳健地产生大量 CNCC，允许进行生化和基因组机制研究 9,10。将 NS 在补充 N2B27 的培养基中的低附着板上培养，并与成纤维细胞生长因子 （FGF） 和表皮生长因子 （EGF）一起10,11 以刺激细胞增殖。这些方案在培养皿中进行，在同一板中培养大量 NS。在生长的 NS 中，细胞聚集并继续分裂 - 成熟后达到 100-200 μm 的直径。在成熟时（大约第 5 天），NS 附着在底物上并分化成类似于体内对应物的 CNCC 9,12。然后这些 CNCC 经过 EMT 并分层到板表面。根据 NS 的大小，可以观察到形态差异，因为由于营养物质和氧气的可用性较低，较大的球体在核心中会显得更暗，从而导致细胞凋亡13。虽然这种类型的程序在分化终点产生大量 CNCC，但它存在一些局限性，使得研究分化过程中发生的各种分子动力学几乎是不可能的。首先，使用 ESC 集落 - 大小不同 - 使得难以控制每个实验的起始细胞数。这导致产生各种形状和直径的 NS，这些 NS 通过激活特定的信号通路以不同的方式发育，导致细胞分化改变，因此在给定的时间点无法形成均匀的样品。其次，在同一板中培养多个 NS 通常会导致它们融合在一起14 并可能释放影响其邻居微环境的信号分子，从而影响其发育。总而言之，这些程序在样品和实验之间会产生很大的可变性。

在这里，我们提出了一种策略来克服这些困难，通过在未 TC 处理的 U 形底 96 孔板中聚集小鼠 ESC （mESC） 来产生能够产生 CNCC 的单个 NS。与从已经建立的神经嵴细胞系开始相比，从 mESC 开始可以研究 CNCC 开发的规格过程和早期阶段。该方案首先解聚 mESC 菌落以获得单细胞悬液，然后在未 TC 处理的 U 底 96 孔板的每个孔中接种特定数量的 mESC。将细胞聚集两天，然后移至未经 TC 处理的平底 96 孔板中，其中 NS 将能够附着在板底部。通过在分化过程中控制起始细胞数和每个 NS 的微环境，该方案减少了样品的可变性，从而提高了实验的可重复性。我们相信这将是设计多重实验的便捷平台，例如测试不同培养条件的效果或进行基因扰动筛选。

研究方案

1. 从小鼠 ESC 集落生成单细胞悬液

注意：该方案适用于在明胶包被的 TC 处理的 6 孔板中的灭活饲养员上生长的 CK35 mESC（一种能够进行生殖系传播的 mESC 系，然后可以选择开发 体内模型 15）。TC 处理的 6 孔板的一个孔应产生大约 1.5 × 10个 6 mESC，这对于方案的其余部分来说已经足够了。如有必要，可以按比例扩展。根据所选的 ESC 菌株和维持培养方法以及适当的培养基调整初始步骤。该方案应在无菌条件下进行。有关本协议中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参阅 材料表 。

  1. 从 mESC 开始，在 mESC 培养基中生长的 70%-80% 汇合度。有关本研究中使用的 mESC 培养基成分，请参见 表 1 。
    注意：不要让 mESC 生长超过 80% 汇合，因为它们会开始分化，这会影响聚集过程。集落必须紧凑并显示出健康的形态（没有裂缝或波浪，明显的核质对比）。
  2. 制备 CNCC 分化培养基。CNCC 分化培养基组成见 表 1 。
    注：添加生长因子后，培养基可在 4 °C 下储存长达 3 周。 确保培养基避光。
  3. 在 DMEM-Knockout 培养基中制备浓度为 2 mg/mL 的新鲜胶原酶溶液。
    注：使用胶原酶可确保仅分离菌落而不是饲养层，因为它们在以下步骤中的存在会干扰 NS 聚集。使用前用 0.22 μm 过滤器过滤胶原酶溶液。
  4. 从 mESC 中吸出 ESC 培养基。
  5. 在孔的一侧轻轻加入 1 mL 的 PBS。轻轻摇晃板以确保均匀洗涤。
  6. 去除 PBS 并替换为 2 mL 胶原酶溶液。在 37 °C 下孵育 30-45 分钟。
    1. 前 20 分钟后，在光学显微镜下以 10 倍放大倍率检查板，然后每 5 分钟检查一次。
    2. 当菌落显示出卷起的边缘时，用力敲击板侧，菌落就会分离。
  7. 使用 5 mL 血清移液管收集菌落并将其转移到 15 mL 锥形管中。
    注意：在光学显微镜下检查板是否有残留菌落。这些可以用 PBS 洗涤液收集。
  8. 在室温 （RT） 下以 16 × g 离心菌落 3 分钟。
  9. 从锥形管中吸出尽可能多的培养基，注意不要干扰管底部的菌落。
  10. 加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液，并将试管在 37 °C 下孵育 5 分钟。
  11. 通过上下剧烈移液，先用 p1000，然后用 p200 微量移液器，解离管中的菌落。
    注：这可确保获得单细胞悬液。
  12. 加入 2 mL mESC 培养基以封闭胰蛋白酶，并在室温下以 160 × g 离心 3 分钟。去除上清液并加入 1 mL CNCC 分化培养基。
  13. 按照制造商的说明，使用自动细胞计数设备或显微镜下的标准化系统对细胞进行计数。
  14. 计数后，用足够的 CNCC 分化培养基稀释，以获得每 50 μL 3000 个活细胞的浓度。
  15. 使用 p200 微量移液器，在未经 TC 处理的 U 形底 96 孔板的每个孔中接种 50 μL 细胞悬液，然后用 CNCC 分化培养基加满孔直至 200 μL。
    注：填充板时，不时用 p1000 微量移液管重悬单细胞悬液，以获得均匀的浓度。
  16. 在 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育过夜。

2. 转移到平底 96 孔板中进行 CNCC 鉴别

  1. 第二天（第 1 天），在光学显微镜下观察板。确保在每个孔的底部可以看到一个边界清晰的小细胞簇。将板放回培养箱中过夜。
    注意：主聚集体周围可能有一些细胞，一些是死细胞。这不会干扰 NS 聚合。
  2. 第 2 天，从每个孔中缓慢去除 100 μL 培养基。
    1. 吸取培养基时，注意不要去除 NS。为避免这样做，请将移液器吸头靠近表面并远离底部。
  3. 将 p200 微量移液器的尖端从尖端切下约 3-4 毫米。使用此方法吸出带有剩余培养基的 NS。
    注意：为便于吸取 NS，请在吸液前轻轻上下移液几次。
  4. 将 NS 和剩余的培养基转移到未经 TC 处理的平底 96 孔板中，并在光学显微镜下验证转移，然后在每个新孔上放置 100 μL 预热的 CNCC 分化培养基。将 NS 留在 37 °C、5% CO 2 的培养箱中， 直至第 4 天。
  5. 第 4 天，从每个孔中取出 100 μL 培养基，并用 100 μL 预热的 CNCC 分化培养基代替。
    注：为避免干扰板底部的 NS 附着，请缓慢吸液并更换培养基。
  6. 在第 5 天和第 6 天，在光学显微镜下检查 NS 附件。确保较轻的细胞 - 从 NS 分层 - 开始围绕 NS 的主体。
  7. 第 7 天，按照 2.5 中的说明更换培养基。每 2 天使用相同的程序更换培养基，直到研究结束。

3. 国家网信证书传代及维护

注意：一旦 NS 周围有足够数量的可见细胞，就可以进行 CNCC 传代。这可能最早在第 7 天，因为较早的时间点无法提供足够数量的 CNCC。

  1. 准备 CNCC 维护培养基。CNCC 维护培养基成分见 表 1 。
    1. 在将其添加到培养基中之前，通过 0.22 μm 过滤器溶解后过滤 BSA。添加生长因子后，将培养基在 4 °C 下储存长达 3 周。 确保培养基避光。
  2. 在 PBS 中制备 7.5 μg/mL 的纤连蛋白。用力混合。
  3. 通过每孔添加 100 μL 纤连蛋白溶液，包被未经 TC 处理的 96 孔板的孔。在 RT 下让涂层在引擎盖下 30 分钟。
    注：如果 CNCC 用于免疫荧光染色，请在涂布前将无菌玻璃盖玻片放在孔底部。确保载玻片保持在孔的底部并且不会漂浮，以避免涂覆与要使用的载玻片相反的一侧。按照第 5 节中的说明进行 CNCC 固定和安装。
  4. 同时，在未 TC 处理的平底 96 孔板中，从孔中吸出尽可能多的 CNCC 分化培养基，并用 50 μL accutase 代替。在 37 °C 孵育 5 分钟。
  5. 孵育后，每孔加入 100 μL CNCC 维持培养基以淬灭 accutase。从接收未 TC 处理的平底 96 孔板的孔中去除纤连蛋白。通过将分离的迁移后 CNCC 穿过接收非 TC 处理的平底 96 孔板孔顶部的 40 μm 过滤器来过滤它们。
    注意：这将过滤掉之前未删除的细胞团块或剩余 NS。在相同条件下生长的 CNCC 可以合并在一个 50 mL 管中，然后接种在 TC 处理的 6 孔板的同一孔中。在这种情况下，用 1 mL 纤连蛋白包被孔，并使用 1 mL CNCC 维持培养基淬灭 accutase。
  6. 让迁移后 CNCC 在 37 °C 下附着 15-30 分钟。 丢弃培养基并替换为 100 μL CNCC 维护培养基。每 2 天更换一次培养基。
    注意：轻轻添加培养基，因为快速流动会诱导 CNCC 分化为神经衍生物。如果在 6 孔格式中工作，请使用 1 mL 的 CNCC 维护培养基。

4. 用于免疫荧光的 NS 固定和封片

  1. 在所需的时间点，通过切割 p200 微量移液器的尖端，将 NS 从未经 TC 处理的平底 96 孔板转移到 DNA 低结合 2 mL 管中，然后轻轻上下移液以拾取 NS。
    注意：在以后的时间点（从第 7 天开始），NS 将大到足以被肉眼看到，但也更难分离。
  2. 让 NS 在 RT 下在试管中沉淀 3 分钟，去除尽可能多的培养基，然后用 1 mL 冷 PBS 冲洗。
    注意：如果从早期时间点（第 3-4 天之前）转移小 NS，请在 16 × g 下旋转 3 分钟，以确保 NS 沉降到底部。
  3. 去除 PBS，并在化学通风橱中更换为 2 mL 4% PFA 的 PBS 溶液。在 RT 下孵育 20 分钟。
    1. 加入 4% PFA 溶液后，缓慢倒置试管，并在固定期间将其放在侧面。目标是稍微分散 NS，以便它们在此步骤中不会粘在一起。
  4. 去除 4% PFA 溶液（在化学罩中）并用 1 mL 冷 PBS/0.5% Tween20 洗涤 NS。让它在 RT 下沉淀 3 分钟。总共重复此作 3 次。
    注意：NS 将沉淀在底部。
  5. 去除 PBS/0.5% Tween20 并加入 2 mL PBS/0.1% Triton X-100。将管子倒置，让它放在一边。在 RT 下孵育 1 小时。
  6. 如步骤 4.4 所示，在冷 PBS/0.5% Tween20 中洗涤 NS 3 次。
  7. 去除 PBS/0.5% Tween20 并在 4 °C 下用 2% BSA 的 PBS 溶液封闭至少 1 小时，最好过夜。
    注：样品可在 2% BSA/PBS 中在 4 °C 下储存长达 1 周。 避光。
  8. 通过将正确稀释的一抗添加到 2% BSA/PBS 中，最终体积为 500 μL 来制备一抗溶液。有关本研究中使用的一抗混合物，请参见 表 2。
  9. 尽可能多地去除封闭溶液，并通过切割 p200 微量移液器的尖端将 NS 转移到 0.5 mL 试管中。
  10. 加入一抗溶液并缓慢上下移液以重悬 NS。在 4 °C 的旋转器上孵育过夜。
  11. 在 RT 下用冷 PBS 洗涤 NS 3 次，持续 5 分钟。
  12. 通过在 2% BSA/PBS 中稀释所选二抗并加入 1/1000 DAPI 来制备二抗溶液。有关本研究中使用的二抗混合物，请参见 表 2。
    注意：请避光管子。
  13. 用 500 μL 二抗溶液替换 PBS，并用铝箔包裹试管以避光。在 RT 下在旋转器上孵育 1 小时。
  14. 如步骤 4.11 所示，在冷 PBS 中洗涤 NS 3 次。
  15. 在不吸出 NS 的情况下去除尽可能多的 PBS，用 50 μL 的清除剂代替，并按照制造商的说明进行作。
  16. 在 RT 中避光孵育过夜。
  17. 准备安装室。
    1. 在显微镜载玻片上，放置三层双面胶带。使用透明的无纤维胶带以避免安装室中有残留物。
    2. 使用剃须刀在双带上切出 3 mm × 8 mm 的窗口。
      注意：腔室尺寸取决于采样时间点。本例适用于托管 50 μL 封固剂，最适合在以后的时间点（第 7-9 天）使用 10-20 个单 NS。
  18. 在立体镜下，通过切割低粘附力 p200 微量移液器吸头，小心地将清除剂中的 NS 转移到安装室中。使用 2 倍到 4 倍之间的放大倍率来提供整个腔室的视野和足够的放大倍率来识别 NS。如果立体镜配备了荧光成像，则使用蓝色荧光滤光片将更容易识别 NS，因为 DAPI 染色将使原本透明的 NS 脱颖而出。
    注意：确认培养基在腔室上方形成轻微凸起的弯月面。这将确保腔室中没有气泡。
  19. 将盖玻片放在表面上，轻轻按压其侧面以使其粘附。在立体镜下执行此步骤，并验证 NS 是否未被推出腔室。
  20. 在 4 °C 避光储存直至成像。

5. 用于免疫荧光的 CNCC 固定和封片

  1. 从孔中取出 CNCC 维护培养基并用 PBS 洗涤。通过在孔的侧面移液轻轻添加 PBS。
  2. 按照步骤 4.3-4.14 中的说明进行固定、透化和染色。
  3. 通过在载玻片上添加安装介质，使用镊子抓住并旋转盖玻片，使迁移后的 CNCC 面向载玻片，然后将其放在液滴上，将盖玻片安装在显微镜载玻片上。
    1. 可选：用指甲油或其他常用的密封系统密封盖玻片。
  4. 在 4 °C 避光储存直至成像。

结果

按照方案，解离 mESC 集落，并将 3000 个细胞接种在未经 TC 处理的 U 型底 96 孔板中。第 2 天，将聚集的 NS 转移到未经 TC 处理的平底 96 孔板中，以允许它们附着。 图 1A 提供了 NS 聚合协议的简化可视化。NS 培养至第 9 天，然后进行免疫荧光染色处理。将从 NS 迁移到板上的细胞转移到盖玻片上进行成像，并在 CNCC 维持培养基中培养至第 13 天。同时，?...

讨论

体外 3D 分化模型允许分析在 2D 细胞培养中可能难以或无法观察到的复杂细胞相互作用。已经开发了几种模型来研究体外 CNCC 的发展。这些通常直接来源于 ESC 集落 7,21 或组织外植体22,23。尽管这些系统已被证明可以有效地产生神经嵴细胞，但此类方法对培养方法和微环?...

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢 Remi Xavier Coux 博士关于引物设计和细胞培养专业知识的建议。这项工作得到了欧洲研究委员会 （ERC Starting Grant 101039995 - REGENECREST） 和 Fondation pour la Recherche Médicale （Amorçage - AJE202205015403） 的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm syringe filtersClearLine146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical TubeFalcon352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter TipsDutscher713263
40 µm filtersFalcon352340
5 mL Serological pipetteStarstedt86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical TubeFalcon352070
AccutaseMerck-SigmaA6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)Thermofisher ScientificA21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)Thermofisher ScientificA31571
Antibiotic-antimycotic solution Merck-SigmaA5955
B27 PLUS supplementThermofisher Scientific17504044
Bovine serum albumin (BSA)Merck-SigmaA9418
ChloroformCarlo Erba438601
Collagenase Type IVThermofisher Scientific, Gibco17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well platesCorning3516
Cover glasses, roundVWR 630-2113 
DMEM KnockOutThermofisher Scientific10829018
DMEM/F12+GlutamaxThermofisher Scientific10565018
DMEM high glucoseMerck-SigmaD0822
DNA LoBind Tubes, 2 mLEppendorf30108078
DNase/RNase-Free Distilled WaterThermofisher Scientific10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermofisher Scientific14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mLEppendorf30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mLEppendorf30120094
ESGRO mLIF Medium SupplementMerck-SigmaESG1107
Ethanol 70%Carlo Erba528170
Fetal Bovine SerumMerck-SigmaF7524
FibronectinMerck-SigmaF085-2MG
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02
Gelatin solutionMerck-SigmaES-006-B
GlutaMAXThermofisher Scientific35050061
Human EGFPeprotechAF-100-15-500UG
Human FGF-basicPeprotech100-18B
Human SOX9 AntibodyR&DsystemsAF3075
Insulin from bovine pancreasMerck-SigmaI6634
iScript cDNA Synthesis KitBiorad1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, UnconjugatedDSHB3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, UnconjugatedDSHBPAX7
N2 supplementThermofisher Scientific17502048
Neurobasal MediumThermofisher Scientific21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottomFalcon351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottomFalcon351177
Paraformaldehyde 16% solution, em gradeElectron Microscopy Sciences15710
Propan-2-olCarlo Erba415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) AntibodyBiolegendMMS-435P
RapiClear 1.47Sunjin LabRC147001
RapiClear 1.52Sunjin LabRC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 mClear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX KitMeridian BioscienceBIO-98020
Sterile Disposable Surgical ScalpelsSwann-Morton05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope SlidesEprediaJ1800AMNZ
Triton X-100Thermofisher ScientificA16046.AP
TRIzol ReagentFisherScientific15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)Thermofisher Scientific25300054
Tween-20Fisher Scientific10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)Cell signaling technologyE7E2G
β-mercaptoethanolThermofisher Scientific31350010

参考文献

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