Cellule Neurali Della Cresta Cranica Protocollo Tridimensionale In Vitro Di Differenziazione Per Saggio Multiplexed

Riepilogo

Presentiamo un protocollo di differenziazione in vitro tridimensionale (3D) che genera neurosfere di dimensioni riproducibili per produrre cellule della cresta neurale cranica da cellule staminali embrionali di topo. Dimostriamo che questa metodologia riduce la variabilità rispetto ai protocolli precedenti e come può essere utilizzata per saggi multiplexati per studiare lo sviluppo delle cellule della cresta neurale cranica.

Abstract

Con la loro notevole capacità di generare derivati sia ectodermici che mesenchimali, le cellule della cresta neurale cranica (CNCC) hanno suscitato molto interesse nello studio dei meccanismi che regolano le decisioni sul destino cellulare e la plasticità. Originata nel neuroepitelio dorsale, questa popolazione cellulare è transitoria e relativamente rara nell'embrione in via di sviluppo, rendendo difficili da eseguire test funzionali, screening genomici e saggi biochimici in vivo. Per superare queste limitazioni, sono stati sviluppati diversi metodi per modellare lo sviluppo CNCC in vitro. I metodi di coltura basati sulla neurosfera (NS) forniscono un microambiente complesso che ricapitola il neuroepitelio anteriore in via di sviluppo in 3D. Questi sistemi consentono la crescita di molte NS nella stessa piastra per generare una grande quantità di CNCC, ma le NS prodotte presentano un'elevata variabilità in termini di forma, dimensione e numero di CNCC formate, rendendo difficili da eseguire saggi quantitativi. Questo protocollo delinea un metodo riproducibile per generare NS da cellule staminali embrionali di topo (mESC) in un formato a 96 pozzetti. Le NS generate in piastre a 96 pozzetti producono cellule della cresta neurale cranica (CNCC), che possono essere ulteriormente coltivate. Controllando il numero di cellule iniziali, questo approccio riduce la variabilità delle dimensioni e della forma tra le NS e aumenta la riproducibilità tra gli esperimenti. Infine, questo sistema di coltura è adattabile a diverse applicazioni e offre un grado di flessibilità più elevato, rendendolo altamente personalizzabile e adatto al multiplexing di condizioni sperimentali.

Introduzione

Le cellule della cresta neurale cranica (CNCC) sono una popolazione di cellule staminali che nasce nella parte più anteriore dell'embrione in via di sviluppo, al confine tra la placca neurale e l'ectoderma^{di superficie 1}. Le CNCC subiscono quindi una transizione da epitelio a mesenchimale (EMT), si delaminano dal neuroepitelio e migrano dorsoventralmente verso varie posizioni nell'embrione dove si differenziano in un'ampia varietà di tipi di cellule². Lo studio di questa popolazione cellulare è di grande interesse in quanto possiede una notevole plasticità³ e la capacità unica di differenziarsi sia in derivati ectodermici che mesenchimali, come le ossa craniofacciali e le cartilagini⁴. Sebbene le CNCC siano relativamente accessibili nell'embrione, si tratta di una popolazione transitoria con un basso numero di cellule, il che rende difficile condurre studi meccanicistici sistemici in vivo. Le linee cellulari CNCC sono state isolate e caratterizzate negli ultimi anni per superare queste limitazioni. In particolare, la linea cellulare O9-1 CNCC è un ottimo strumento per studiare lo sviluppo della cresta neurale migratoria e post-migratoria ^5,6; Tuttavia, questa linea cellulare non consente lo studio degli eventi precoci prima della migrazione che portano all'induzione e alla specificazione della cresta neurale. A questo proposito, ci sono stati sviluppi significativi nello sviluppo di protocolli di differenziazione in vitro per differenziare la CNCC in un piatto attraverso l'uso di strutture 3D simili al neuroepitelio in via di sviluppo chiamate neurosfere (NS)^7,8- ottenute dopo la differenziazione di colonie di cellule staminali embrionali (ESC). Questi protocolli 3D producono in modo robusto un numero elevato di CNCC, consentendo la conduzione di studi meccanicistici biochimici e genomici ^9,10. Le NS sono coltivate su piastre a basso attacco in terreno integrato con N2B27, insieme al fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) e al fattore di crescita epidermico (EGF)^10,11 per stimolare la proliferazione cellulare. Questi protocolli vengono eseguiti in piastre di Petri, coltivando numerosi NS nella stessa piastra. All'interno del NS in crescita, le cellule si aggregano e continuano a dividersi, raggiungendo un diametro di 100-200 μm alla maturità. Alla maturità (circa il giorno 5), le NS si attaccano al substrato e si differenziano in CNCC simile alle loro controparti in vivo ^9,12. Questi CNCC vengono quindi sottoposti a EMT e delaminati sulla superficie della piastra. Le differenze morfologiche possono essere osservate a seconda delle dimensioni del NS, poiché le sfere più grandi appariranno più scure nel nucleo a causa della minore disponibilità di nutrienti e ossigeno, portando le cellule a subire l'apoptosi¹³. Sebbene questo tipo di procedura generi un gran numero di CNCC al punto finale di differenziamento, presenta diverse limitazioni, rendendo quasi impossibile lo studio delle varie dinamiche molecolari che avvengono durante il processo di differenziamento. In primo luogo, l'uso di colonie di cellule staminali embrionali, che variano in dimensioni, rende difficile controllare il numero di cellule iniziali per ogni esperimento. Ciò si traduce nella generazione di NS di varie forme e diametri che si sviluppano in modo diverso attivando specifiche vie di segnalazione, portando a un'alterata differenziazione cellulare e, quindi, non formando un campione uniforme in un dato momento temporale. In secondo luogo, la coltura di più NS nella stessa piastra spesso porta a fondere insieme¹⁴ e potenzialmente a rilasciare molecole di segnalazione che influenzano il microambiente dei loro vicini e, quindi, il loro sviluppo. Nel complesso, queste procedure generano molta variabilità tra campioni ed esperimenti.

Qui, presentiamo una strategia per superare queste difficoltà che genera un singolo NS - in grado di produrre CNCC - aggregando ESC di topo (mESC) in piastre a 96 pozzetti con fondo a U non trattate con TC. L'avvio della mESC consente di studiare il processo di specificazione e le prime fasi dello sviluppo della CNCC rispetto all'avvio da linee cellulari della cresta neurale già stabilite. Questo protocollo inizia con la disaggregazione delle colonie di mESC per ottenere una sospensione a singola cellula, seguita dalla semina di un numero specifico di mESC in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U non trattata con TC. Le celle vengono lasciate aggregare per due giorni e successivamente spostate in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC, in cui NS sarà in grado di attaccarsi al fondo della piastra. Controllando il numero di cellule iniziali e il microambiente di ciascuna NS durante il processo di differenziazione, questo protocollo riduce la variabilità del campione, aumentando la riproducibilità sperimentale. Riteniamo che questa sarà una piattaforma conveniente per la progettazione di esperimenti multiplexati, come testare l'effetto di diverse condizioni di coltura o eseguire screening di perturbazione genica.

Protocollo

1. Generazione di una sospensione unicellulare da colonie di ESC di topo

NOTA: Questo protocollo è adattato all'uso di CK35 mESC (una linea mESC competente per la trasmissione della linea germinale, per avere poi la possibilità di sviluppare modelli in vivo ¹⁵) coltivata su alimentatori inattivati in una piastra a 6 pozzetti trattata con TC rivestita di gelatina. Un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti trattata con TC dovrebbe produrre circa 1,5 × 10⁶ mESC, che è sufficiente per il resto del protocollo. Se necessario, è possibile aumentarlo. Regolare le fasi iniziali in base al ceppo ESC scelto e al metodo di coltura di mantenimento, nonché al terreno di coltura appropriato. Questo protocollo deve essere eseguito in condizioni sterili. Consultare la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo.

1. Iniziare con mESC con una confluenza del 70%-80% coltivata in terreno di coltura mESC. Vedere la Tabella 1 per la composizione del terreno di coltura mESC utilizzata in questo studio.
   NOTA: Non lasciare che le mESC crescano oltre l'80% di confluenza, poiché inizieranno a differenziarsi e ciò influenzerà il processo di aggregazione. Le colonie devono essere compatte e presentare una morfologia sana (assenza di crepe o onde, contrasto nucleo-citoplasmatico distinto).
2. Preparare il mezzo di differenziazione CNCC. Vedere la Tabella 1 per la composizione del mezzo di differenziazione CNCC.
   NOTA: Una volta aggiunti i fattori di crescita, il terreno può essere conservato per un massimo di 3 settimane a 4 °C. Assicurarsi che il mezzo sia protetto dalla luce.
3. Preparare una soluzione fresca di collagenasi a una concentrazione di 2 mg/mL nel terreno DMEM-Knockout.
   NOTA: L'uso della collagenasi assicura che solo le colonie siano staccate e non gli alimentatori, poiché la loro presenza nei passaggi successivi interferirà con l'aggregazione delle NS. Filtrare la soluzione di collagenasi prima dell'uso con un filtro da 0,22 μm.
4. Aspirare il terreno ESC da mESC.
5. Aggiungere delicatamente 1 ml di PBS sul lato del pozzetto. Scuotere delicatamente la piastra per garantire un lavaggio uniforme.
6. Rimuovere la PBS e sostituirla con 2 ml di soluzione di collagenasi. Incubare a 37 °C per 30-45 min.
   1. Controllare la lastra al microscopio ottico con un ingrandimento di 10x dopo i primi 20 minuti e poi ogni 5 minuti.
   2. Quando le colonie mostrano i bordi arrotolati, picchiettare energicamente sul lato della piastra e le colonie si staccheranno.
7. Con una pipetta sierologica da 5 mL, raccogliere le colonie e trasferirle in una provetta conica da 15 mL.
   NOTA: Controllare la piastra al microscopio ottico per verificare la presenza di colonie rimanenti. Questi possono essere raccolti con un lavaggio PBS.
8. Centrifugare le colonie a 16 × g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).
9. Aspirare quanto più terreno possibile dal tubo conico, facendo attenzione a non disturbare le colonie sul fondo del tubo.
10. Aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina allo 0,05% e incubare la provetta a 37 °C per 5 minuti.
11. Dissociare le colonie nel tubo pipettando energicamente su e giù, prima con una p1000 e poi con una micropipetta p200.
    NOTA: Ciò garantisce l'ottenimento di una sospensione a cella singola.
12. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura mESC per bloccare la tripsina e centrifugare a 160 × g per 3 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione CNCC.
13. Contare le cellule utilizzando un dispositivo di conteggio cellulare automatizzato o un sistema standardizzato al microscopio, seguendo le istruzioni del produttore.
14. Dopo il conteggio, diluire con una quantità sufficiente di terreno di differenziazione CNCC per ottenere una concentrazione di 3000 cellule vive per 50 μL.
15. Utilizzando una micropipetta p200, seminare 50 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U non trattata con TC, quindi rabboccare il pozzetto fino a 200 μl con mezzo di differenziazione CNCC.
    NOTA: Durante il riempimento della piastra, risospendere di tanto in tanto la sospensione a singola cellula con una micropipetta p1000 per ottenere una concentrazione omogenea.
16. Incubare per una notte in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂.

2. Trasferimento in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti per la differenziazione CNCC

1. Il giorno successivo (giorno 1), osservare la lastra al microscopio ottico. Assicurati che un piccolo gruppo di celle con bordi chiari sia visibile sul fondo di ogni pozzetto. Rimetti la piastra nell'incubatrice per una notte.
   NOTA: Potrebbero esserci alcune celle attorno all'aggregato principale, alcune morte. Ciò non interferirà con l'aggregazione NS.
2. Il giorno 2, rimuovere lentamente 100 μL di terreno da ciascun pozzetto.
   1. Quando si aspira il fluido, fare attenzione a non rimuovere l'NS. Per evitare di farlo, posizionare il puntale della pipetta vicino alla superficie e lontano dal fondo.
3. Tagliare la punta di una micropipetta p200 a circa 3-4 mm dalla punta. Usalo per aspirare il NS con il terreno rimanente.
   NOTA: Per facilitare la raccolta dell'NS, pipettare delicatamente su e giù un paio di volte prima di aspirare.
4. Trasferire NS e il terreno rimanente in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC e verificare il trasferimento al microscopio ottico, quindi riempire ogni nuovo pozzetto con 100 μl di terreno di differenziazione CNCC preriscaldato. Lasciare NS nell'incubatore a 37 °C, 5% CO_2, fino al giorno 4.
5. Il giorno 4, rimuovere 100 μL di terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 100 μL di terreno di differenziazione CNCC preriscaldato.
   NOTA: Per evitare di disturbare l'attacco NS nella parte inferiore della piastra, aspirare lentamente e sostituire il fluido.
6. Nei giorni 5 e 6, controllare l'attacco NS al microscopio ottico. Assicurarsi che le celle più leggere - delaminandosi dal NS - inizino a circondare il corpo principale del NS.
7. Il giorno 7, cambiare il mezzo come descritto in 2.5. Cambiare il mezzo con la stessa procedura ogni 2 giorni fino al punto finale dello studio.

3. Passaggio e manutenzione CNCC

NOTA: Il passaggio CNCC può essere eseguito non appena è visibile una quantità sufficiente di celle intorno a NS. Questo può avvenire già dal giorno 7, poiché i punti temporali precedenti non forniscono una quantità sufficiente di CNCC.

1. Preparare il mezzo di manutenzione CNCC. Vedere la Tabella 1 per la composizione del mezzo di manutenzione CNCC.
   1. Prima di aggiungerlo al terreno, filtrare il BSA dopo la solubilizzazione attraverso un filtro da 0,22 μm. Una volta aggiunti i fattori di crescita, conservare il terreno per un massimo di 3 settimane a 4 °C. Assicurarsi che il mezzo sia protetto dalla luce.
2. Preparare la fibronectina a 7,5 μg/mL in PBS. Mescolate energicamente.
3. Rivestire i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti non trattata con TC aggiungendo 100 μl di soluzione di fibronectina per pozzetto. Lasciare il cappotto sotto il cappuccio per 30 minuti a RT.
   NOTA: Se i CNCC sono destinati alla colorazione in immunofluorescenza, posizionare un vetrino coprioggetti in vetro sterile sul fondo del pozzetto prima del rivestimento. Assicurarsi che il vetrino rimanga sul fondo del pozzo e non galleggi per evitare di rivestire il lato opposto a quello che verrà utilizzato. Seguire le istruzioni nella sezione 5 per il fissaggio e il montaggio CNCC.
4. Nel frattempo, nella piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC, aspirare quanto più mezzo di differenziazione CNCC possibile dai pozzetti e sostituirlo con 50 μL di accutasi. Incubare a 37 °C per 5 min.
5. Dopo l'incubazione, aggiungere 100 μl di terreno di mantenimento CNCC per pozzetto per estinguere l'accutasi. Rimuovere la fibronectina dai pozzetti della piastra ricevente a fondo piatto a 96 pozzetti non trattata con TC. Filtrare i CNCC post-migratori staccati facendoli passare attraverso un filtro da 40 μm sulla parte superiore della piastra ricevente a fondo piatto a 96 pozzetti non trattata con TC.
   NOTA: Questo filtrerà i grumi di cellule o le NS rimanenti che non sono state precedentemente rimosse. La CNCC coltivata nelle stesse condizioni può essere raggruppata in una provetta da 50 mL per essere poi seminata nello stesso pozzetto di una piastra a 6 pozzetti trattata con TC. In questo caso, rivestire il pozzetto con 1 mL di fibronectina e utilizzare 1 mL di terreno di mantenimento CNCC per spegnere l'accutasi.
6. Lasciare attaccare il CNCC post-migratorio per 15-30 minuti a 37 °C. Eliminare il terreno e sostituirlo con 100 μL di mezzo di manutenzione CNCC. Cambiare il fluido ogni 2 giorni.
   NOTA: Aggiungere delicatamente il terreno poiché il flusso veloce induce la differenziazione della CNCC in derivati neurali. Se si lavora in un formato a 6 pozzetti, utilizzare 1 mL di terreno di manutenzione CNCC.

4. Fissazione e montaggio delle NS per l'immunofluorescenza

1. Al momento desiderato, trasferire le NS dalla piastra a 96 pozzetti a fondo piatto non trattata con TC in una provetta da 2 mL a basso legame di DNA tagliando la punta di una micropipetta p200 e pipettando delicatamente su e giù per prelevare le NS.
   NOTA: Nei momenti successivi (dal giorno 7 in poi), NS sarà abbastanza grande da essere visto ad occhio, ma sarà anche più difficile da staccare.
2. Lasciare riposare NS nella provetta per 3 minuti a RT, rimuovere quanto più terreno possibile e risciacquare con 1 mL di PBS freddo.
   NOTA: Se si trasferisce un NS piccolo dai primi punti temporali (prima dei giorni 3-4), centrifugare a 16 × g per 3 minuti per assicurarsi che NS si stabilizzi sul fondo.
3. Rimuovere il PBS e, in una cappa chimica, sostituirlo con 2 mL di PFA al 4% in PBS. Incubare per 20 minuti a RT.
   1. Capovolgere lentamente il tubo dopo aver aggiunto la soluzione di PFA al 4% e lasciarlo riposare durante il fissaggio laterale. L'obiettivo è quello di diffondere leggermente NS in modo che non si attacchino in questo passaggio.
4. Rimuovere la soluzione di PFA al 4% (nella cappa chimica) e lavare NS con 1 mL di PBS freddo/0,5% Tween20. Lasciare riposare a RT per 3 min. Ripeti l'operazione 3 volte in totale.
   NOTA: NS si stabilirà in fondo.
5. Rimuovere PBS/0,5% Tween20 e aggiungere 2 ml di PBS/0,1% Triton X-100. Capovolgere il tubo e lasciarlo riposare di lato. Incubare per 1 ora a RT.
6. Lavare NS 3 volte in PBS freddo/0,5% Tween20, come indicato al punto 4.4.
7. Rimuovere PBS/0,5% Tween20 e bloccare con 2% BSA in PBS a 4 °C per almeno 1 ora, preferibilmente durante la notte.
   NOTA: I campioni possono essere conservati in BSA/PBS al 2% per un massimo di 1 settimana a 4 °C. Proteggere dalla luce.
8. Preparare la soluzione di anticorpi primari aggiungendo la corretta diluizione dell'anticorpo primario al 2% di BSA/PBS in un volume finale di 500 μL. Per la miscela di anticorpi primari utilizzata in questo studio, vedere la Tabella 2.
9. Rimuovere la maggior parte possibile della soluzione bloccante e trasferire l'NS in una provetta da 0,5 mL tagliando la punta di una micropipetta p200.
10. Aggiungere la soluzione di anticorpi primari e pipettare lentamente su e giù per risospendere l'NS. Incubare per una notte su un rotatore a 4 °C.
11. Lavare NS 3 volte in PBS freddo per 5 minuti a RT.
12. Preparare la soluzione di anticorpi secondari diluendo gli anticorpi secondari di scelta in BSA/PBS al 2% e aggiungendo 1/1000 DAPI. Per la miscela di anticorpi secondari utilizzata in questo studio, vedere la Tabella 2.
    NOTA: Tenere i tubi al riparo dalla luce.
13. Sostituire il PBS con 500 μL di soluzione di anticorpi secondari e avvolgere la provetta con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce. Incubare per 1 ora sul rotatore a RT.
14. Lavare NS 3 volte in PBS freddo, come indicato al punto 4.11.
15. Rimuovere la maggior quantità possibile di PBS senza aspirare l'NS, sostituirla con 50 μl di agente chiarificante e seguire le istruzioni del produttore.
16. Incubare per una notte a RT, al riparo dalla luce.
17. Preparare le camere di montaggio.
    1. Su un vetrino da microscopio, posizionare tre strati di nastro biadesivo. Utilizzare nastro trasparente e privo di fibre per evitare residui nella camera di montaggio.
    2. Usando un rasoio, taglia una finestra di 3 mm × 8 mm nel doppio nastro.
       NOTA: Le dimensioni della camera dipendono dal punto di tempo del campione. Questo esempio è adatto per ospitare 50 μL di terreno di montaggio, che è ottimale per 10-20 singoli NS in punti temporali successivi (giorni 7-9).
18. Sotto uno stereoscopio, trasferire con cautela l'NS nell'agente di pulizia nella camera di montaggio tagliando un puntale per micropipetta p200 a bassa aderenza. Utilizzare un ingrandimento compreso tra 2x e 4x per fornire un campo visivo dell'intera camera e un ingrandimento sufficiente per identificare l'NS. Se lo stereoscopio è attrezzato per l'imaging fluorescente, lavorare con un filtro a fluorescenza blu faciliterà l'identificazione della NS, poiché la colorazione DAPI farà risaltare la NS altrimenti trasparente.
    NOTA: Verificare che il mezzo formi un leggero menisco convesso sopra la camera. Ciò assicurerà che non ci siano bolle nella camera.
19. Posizionare un vetrino coprioggetti sulla superficie e premere leggermente sui lati per farlo aderire. Eseguire questo passaggio sotto lo stereoscopio e verificare che i NS non vengano spinti fuori dalla camera.
20. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'imaging.

5. Fissazione e montaggio CNCC per l'immunofluorescenza

1. Rimuovere il mezzo di manutenzione CNCC dai pozzetti e lavarli con PBS. Aggiungere delicatamente il PBS pipettandolo sul lato del pozzetto.
2. Procedere con la fissazione, la permeabilizzazione e la colorazione come descritto nei passaggi 4.3-4.14.
3. Montare i vetrini coprioggetti su un vetrino per microscopia aggiungendo un mezzo di montaggio sul vetrino, afferrando e ruotando il vetrino coprioggetti con l'uso di una pinzetta in modo che il CNCC post-migratorio sia rivolto verso il vetrino e posizionandolo sulla goccia.
   1. Opzionale: sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie o altri sistemi di sigillatura comunemente impiegati.
4. Conservare a 4 °C al riparo dalla luce fino all'imaging.

Risultati

Seguendo il protocollo, le colonie di mESC sono state dissociate e 3000 cellule sono state seminate in piastre a 96 pozzetti con fondo a U non trattate con TC. Il giorno 2, le NS aggregate sono state trasferite in piastre a fondo piatto a 96 pozzetti non trattate con TC per consentirne l'adesione. Una visualizzazione semplificata del protocollo di aggregazione NS è fornita nella Figura 1A. Le NS sono state coltivate fino al giorno 9 e poi processate per la ...

Discussione

I modelli di differenziazione 3D in vitro consentono di analizzare interazioni cellulari complesse che potrebbero essere difficili - o non potrebbero - essere osservate in colture cellulari 2D. Diversi modelli sono stati sviluppati per studiare lo sviluppo della CNCC in vitro. Questi sono generalmente derivati direttamente dalle colonie di ESC ^7,21 o dagli espianti di tessuto^22,23

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	ClearLine	146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter Tips	Dutscher	713263
40 µm filters	Falcon	352340
5 mL Serological pipette	Starstedt	86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
Accutase	Merck-Sigma	A6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A31571
Antibiotic-antimycotic solution	Merck-Sigma	A5955
B27 PLUS supplement	Thermofisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin (BSA)	Merck-Sigma	A9418
Chloroform	Carlo Erba	438601
Collagenase Type IV	Thermofisher Scientific, Gibco	17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well plates	Corning	3516
Cover glasses, round	VWR	630-2113
DMEM KnockOut	Thermofisher Scientific	10829018
DMEM/F12+Glutamax	Thermofisher Scientific	10565018
DMEM high glucose	Merck-Sigma	D0822
DNA LoBind Tubes, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermofisher Scientific	10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher Scientific	14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL	Eppendorf	30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL	Eppendorf	30120094
ESGRO mLIF Medium Supplement	Merck-Sigma	ESG1107
Ethanol 70%	Carlo Erba	528170
Fetal Bovine Serum	Merck-Sigma	F7524
Fibronectin	Merck-Sigma	F085-2MG
Fluoromount-G	Invitrogen	00-4958-02
Gelatin solution	Merck-Sigma	ES-006-B
GlutaMAX	Thermofisher Scientific	35050061
Human EGF	Peprotech	AF-100-15-500UG
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human SOX9 Antibody	R&Dsystems	AF3075
Insulin from bovine pancreas	Merck-Sigma	I6634
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	PAX7
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
Neurobasal Medium	Thermofisher Scientific	21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottom	Falcon	351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottom	Falcon	351177
Paraformaldehyde 16% solution, em grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Propan-2-ol	Carlo Erba	415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) Antibody	Biolegend	MMS-435P
RapiClear 1.47	Sunjin Lab	RC147001
RapiClear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 m			Clear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Meridian Bioscience	BIO-98020
Sterile Disposable Surgical Scalpels	Swann-Morton	05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton X-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP
TRIzol Reagent	FisherScientific	15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
Tween-20	Fisher Scientific	10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)	Cell signaling technology	E7E2G
β-mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	31350010