Dreidimensionales In-vitro-Differenzierungsprotokoll für kraniale Neuralleistenzellen für Multiplex-Assays

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein dreidimensionales (3D) in vitro Differenzierungsprotokoll, das Neurosphären von reproduzierbarer Größe erzeugt, um kraniale Neuralleistenzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus herzustellen. Wir zeigen, dass diese Methodik die Variabilität im Vergleich zu früheren Protokollen reduziert und wie sie für Multiplex-Assays zur Untersuchung der Entwicklung von kranialen Neuralleistenzellen verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Mit ihrer bemerkenswerten Fähigkeit, sowohl ektodermale als auch mesenchymale Derivate zu erzeugen, haben kraniale Neuralleistenzellen (CNCC) großes Interesse an der Erforschung der Mechanismen geweckt, die das Schicksal von Zellen und die Plastizität regulieren. Diese Zellpopulation, die aus dem dorsalen Neuroepithel stammt, ist vorübergehend und im sich entwickelnden Embryo relativ selten - was die Durchführung von Funktionstests, genomischen Screenings und biochemischen Assays in vivo erschwert. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die CNCC-Entwicklung in vitro zu modellieren.Neurosphäre (NS)-basierte Kultivierungsmethoden bieten eine komplexe Mikroumgebung, die das sich entwickelnde anteriore Neuroepithel in 3D rekapituliert. Diese Systeme ermöglichen das Wachstum vieler NS in derselben Platte, um eine große Menge an CNCC zu erzeugen, aber die produzierten NS weisen eine hohe Variabilität in Form, Größe und Anzahl der gebildeten CNCC auf, was die Durchführung quantitativer Assays erschwert. Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Erzeugung von NS aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESC) in einem 96-Well-Format. NS, die in 96-Well-Platten erzeugt werden, produzieren kraniale Neuralleistenzellen (CNCC), die weiter kultiviert werden können. Durch die Kontrolle der Anzahl der Startzellen reduziert dieser Ansatz die Variabilität in Größe und Form zwischen NS und erhöht die Reproduzierbarkeit über Experimente hinweg. Schließlich ist dieses Kultursystem an verschiedene Anwendungen anpassbar und bietet ein höheres Maß an Flexibilität, wodurch es hochgradig anpassbar und für das Multiplexing von experimentellen Bedingungen geeignet ist.

Einleitung

Schädel-Neuralleistenzellen (CNCC) sind eine stammähnliche Zellpopulation, die im vordersten Teil des sich entwickelnden Embryos an der Grenze zwischen der Neuralplatte und dem Oberflächenektoderm^{entsteht 1}. CNCC durchlaufen dann einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT), delaminieren aus dem Neuroepithel und wandern dorsoventral zu verschiedenen Stellen im Embryo, wo sie sich in eine Vielzahl von Zelltypen differenzieren². Die Untersuchung dieser Zellpopulation ist von großem Interesse, da sie eine bemerkenswerte Plastizität³ und die einzigartige Fähigkeit besitzt, sich sowohl in ektodermale als auch in mesenchymale Derivate wie kraniofaziale Knochen und Knorpel^zu differenzieren 4. Obwohl CNCC im Embryo relativ zugänglich sind, handelt es sich um eine vorübergehende Population mit einer geringen Anzahl von Zellen, was die Durchführung systemischer mechanistischer Studien in vivo erschwert. CNCC-Zelllinien wurden in den letzten Jahren isoliert und charakterisiert, um diese Einschränkungen zu überwinden. Insbesondere die O9-1 CNCC-Zelllinie ist ein großartiges Werkzeug für die Untersuchung der Entwicklung der migratorischen und postmigratorischen Neuralleiste ^5,6; Diese Zelllinie erlaubt jedoch nicht die Untersuchung der frühen Ereignisse vor der Migration, die zur Induktion und Spezifizierung der Neuralleiste führen. In diesem Zusammenhang gab es bedeutende Entwicklungen bei der Entwicklung von In-vitro-Differenzierungsprotokollen zur Unterscheidung von CNCC in einer Schale durch die Verwendung von 3D-Strukturen, die dem sich entwickelnden Neuroepithel ähneln, die als Neurosphären (NS)^7,8- bezeichnet werden und nach der Differenzierung von embryonalen Stammzellkolonien (ESC) erhalten werden. Diese 3D-Protokolle erzeugen robust eine hohe Anzahl von CNCC, was die Durchführung biochemischer und genomischer mechanistischer Studien ermöglicht ^9,10. NS werden auf Platten mit niedrigem Adhäsionsgrad in N2B27-supplementiertem Medium zusammen mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF)^10,11 kultiviert, um die Zellproliferation zu stimulieren. Diese Protokolle werden in Petrischalen durchgeführt, wobei mehrere NS auf derselben Platte kultiviert werden. Innerhalb des wachsenden NS aggregieren die Zellen und teilen sich weiter - und erreichen bei der Reife einen Durchmesser von 100-200 μm. Bei der Reife (etwa an Tag 5) heften sich NS an das Substrat und differenzieren sich zu CNCC, ähnlich wie ihre in vivo Gegenstücke ^9,12. Diese CNCC werden dann einer EMT unterzogen und delaminieren auf der Plattenoberfläche. Morphologische Unterschiede können je nach NS-Größe beobachtet werden, da größere Kugeln aufgrund der geringeren Verfügbarkeit von Nährstoffen und Sauerstoff im Kern dunkler erscheinen, was zu einer Apoptose der Zellen führt¹³. Während diese Art von Verfahren eine große Anzahl von CNCC am Endpunkt der Differenzierung erzeugt, weist es einige Einschränkungen auf, die die Untersuchung der verschiedenen Molekulardynamiken, die während des Differenzierungsprozesses auftreten, nahezu unmöglich machen. Erstens macht es die Verwendung von ESC-Kolonien - die in ihrer Größe variieren - schwierig, die Ausgangszellzahl für jedes Experiment zu kontrollieren. Dies führt zur Erzeugung von NS in verschiedenen Formen und Durchmessern, die sich unterschiedlich entwickeln, indem sie spezifische Signalwege aktivieren, was zu einer veränderten Zelldifferenzierung führt und somit zu einem bestimmten Zeitpunkt keine einheitliche Probe bildet. Zweitens führt die Kultivierung mehrerer NS in derselben Platte oft dazu, dass sie miteinander verschmelzen¹⁴ und möglicherweise Signalmoleküle freisetzen, die die Mikroumgebung ihrer Nachbarn und damit ihre Entwicklung beeinflussen. Insgesamt erzeugen diese Verfahren eine große Variabilität zwischen Proben und Experimenten.

Hier stellen wir eine Strategie vor, um diese Schwierigkeiten zu überwinden, die durch die Aggregation von Maus-ESC (mESC) in nicht TC-behandelten 96-Well-Platten mit U-Boden einen einzelnen NS erzeugen, der in der Lage ist, CNCC zu erzeugen. Ausgehend von mESC können Sie den Spezifikationsprozess und die frühen Stadien der CNCC-Entwicklung untersuchen, verglichen mit bereits etablierten Neuralleisten-Zelllinien. Dieses Protokoll beginnt mit der Disaggregation von mES-Kolonien, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, gefolgt von der Aussaat einer bestimmten Anzahl von mESCs in jeder Vertiefung einer nicht TC-behandelten 96-Well-Platte mit U-Boden. Die Zellen werden zwei Tage lang aggregiert und anschließend auf eine nicht TC-behandelte 96-Well-Platte mit flachem Boden gebracht, in der NS an den Plattenboden anlagern kann. Durch die Kontrolle der Ausgangszellzahl und der Mikroumgebung jedes NS während des Differenzierungsprozesses reduziert dieses Protokoll die Probenvariabilität, was die experimentelle Reproduzierbarkeit erhöht. Wir glauben, dass dies eine geeignete Plattform für die Entwicklung von Multiplex-Experimenten sein wird, wie z. B. das Testen der Wirkung verschiedener Kulturbedingungen oder die Durchführung von Genstörungsscreenings.

Protokoll

1. Erzeugung einer einzelligen Suspension aus Maus-ESC-Kolonien

HINWEIS: Dieses Protokoll ist für die Verwendung von CK35 mESC (eine mESC-Linie, die für die Übertragung der Keimbahn geeignet ist, um dann die Möglichkeit zu haben, In-vivo-Modelle ¹⁵ zu entwickeln) angepasst, die auf inaktivierten Feedern in einer gelatinebeschichteten, TC-behandelten 6-Well-Platte gezüchtet werden. Eine Vertiefung einer TC-behandelten 6-Well-Platte sollte etwa 1,5 × 10⁶ mESC ergeben, was für den Rest des Protokolls ausreichend ist. Dies kann bei Bedarf skaliert werden. Passen Sie die ersten Schritte in Übereinstimmung mit der gewählten ESC-Stamm- und Erhaltungskulturmethode sowie dem richtigen Kulturmedium an. Dieses Protokoll ist unter sterilen Bedingungen durchzuführen. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Beginnen Sie mit mESC bei einer Konfluenz von 70 % bis 80 %, die in mESC-Kulturmedium gezüchtet wird. In Tabelle 1 finden Sie die Zusammensetzung des mESC-Kulturmediums, das in dieser Studie verwendet wurde.
   HINWEIS: Lassen Sie mESC nicht über 80 % Konfluenz wachsen, da sie sich dann zu differenzieren beginnen und dies den Aggregationsprozess beeinflusst. Die Kolonien müssen kompakt sein und eine gesunde Morphologie aufweisen (keine Risse oder Wellen, deutlicher Kern-Zytoplasma-Kontrast).
2. CNCC-Differenzierungsmedium vorbereiten. Siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung des CNCC-Differenzierungsmediums.
   HINWEIS: Nach Zugabe von Wachstumsfaktoren kann das Medium bis zu 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass das Medium vor Licht geschützt ist.
3. Bereiten Sie eine frische Kollagenaselösung in einer Konzentration von 2 mg/ml im DMEM-Knockout-Medium vor.
   HINWEIS: Die Verwendung von Kollagenase stellt sicher, dass nur die Kolonien und nicht die Futtertiere abgelöst werden, da ihre Anwesenheit in den folgenden Schritten die NS-Aggregation beeinträchtigt. Kollagenaselösung vor Gebrauch mit einem 0,22 μm Filter filtrieren.
4. Aspirieren Sie das ESC-Medium aus mESC.
5. Geben Sie vorsichtig 1 ml PBS an die Seite der Vertiefung. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Reinigung zu gewährleisten.
6. Entfernen Sie PBS und ersetzen Sie es durch 2 ml Kollagenaselösung. Bei 37 °C 30-45 min inkubieren.
   1. Überprüfen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop bei 10-facher Vergrößerung nach den ersten 20 min und dann alle 5 min.
   2. Wenn die Völker aufgerollte Ränder aufweisen, klopfen Sie kräftig auf die Plattenseite, und die Völker lösen sich.
7. Sammeln Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette die Kolonien und übertragen Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop auf übrig gebliebene Kolonien. Diese können mit einer PBS-Wäsche aufgefangen werden.
8. Die Völker bei 16 × g für 3 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren.
9. Saugen Sie so viel Medium wie möglich aus dem konischen Rohr an und achten Sie darauf, die Kolonien am Boden des Rohrs nicht zu stören.
10. Fügen Sie 1 ml 0,05%ige Trypsinlösung hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen 5 Minuten lang bei 37 °C.
11. Dissoziieren Sie die Kolonien im Röhrchen, indem Sie kräftig auf und ab pipettieren, zuerst mit einer p1000 und dann mit einer p200 Mikropipette.
    HINWEIS: Dadurch wird die Aufnahme einer einzelligen Suspension gewährleistet.
12. Fügen Sie 2 ml mESC-Kulturmedium hinzu, um das Trypsin zu blockieren, und zentrifugieren Sie bei 160 × g für 3 Minuten bei RT. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml CNCC-Differenzierungsmedium hinzu.
13. Zählen Sie Zellen mit einem automatisierten Zellzählgerät oder einem standardisierten System unter dem Mikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers.
14. Nach der Zählung mit ausreichend CNCC-Differenzierungsmedium verdünnen, um eine Konzentration von 3000 lebenden Zellen pro 50 μl zu erhalten.
15. Mit einer p200-Mikropipette 50 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer nicht TC-behandelten 96-Well-Platte mit U-Boden aussäen und dann die Vertiefung auf 200 μl mit CNCC-Differenzierungsmedium auffüllen.
    HINWEIS: Während des Befüllens der Platte die Einzelzellsuspension von Zeit zu Zeit mit einer p1000-Mikropipette resuspendieren, um eine homogene Konzentration zu erhalten.
16. Über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren.

2. Transfer in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden für die CNCC-Differenzierung

1. Betrachten Sie die Platte am nächsten Tag (Tag 1) unter einem Lichtmikroskop. Stellen Sie sicher, dass ein kleiner Zellcluster mit klaren Rändern am Boden jeder Vertiefung sichtbar ist. Stellen Sie die Platte über Nacht wieder in den Inkubator.
   HINWEIS: Es können einige Zellen um das Hauptaggregat herum vorhanden sein, andere sind tot. Dadurch wird die NS-Aggregation nicht beeinträchtigt.
2. Entfernen Sie an Tag 2 langsam 100 μl Medium aus jeder Vertiefung.
   1. Achten Sie beim Ansaugen von Medium darauf, das NS nicht zu entfernen. Um dies zu vermeiden, platzieren Sie die Pipettenspitze nahe an der Oberfläche und weit vom Boden entfernt.
3. Schneiden Sie die Spitze einer p200-Mikropipette etwa 3-4 mm von der Spitze entfernt ab. Verwenden Sie dies, um das NS mit dem restlichen Medium zu aspirieren.
   HINWEIS: Um das Aufnehmen des NS zu erleichtern, pipettieren Sie vor dem Aspirieren einige Male vorsichtig auf und ab.
4. Übertragen Sie NS und das verbleibende Medium in eine nicht TC-behandelte 96-Well-Platte mit flachem Boden, überprüfen Sie den Transfer unter einem Lichtmikroskop und befüllen Sie dann jede neue Vertiefung mit 100 μl vorgewärmtem CNCC-Differenzierungsmedium. Lassen Sie NS bis zum 4. Tag bei 37 °C und 5 % CO₂ im Inkubator.
5. Nehmen Sie an Tag 4 100 μl Medium aus jeder Vertiefung und ersetzen Sie es durch 100 μl vorgewärmtes CNCC-Differenzierungsmedium.
   HINWEIS: Um eine störende NS-Befestigung an der Unterseite der Platte zu vermeiden, saugen Sie das Medium langsam an und ersetzen Sie es.
6. Überprüfen Sie an den Tagen 5 und 6 den NS-Aufsatz unter dem Lichtmikroskop. Stellen Sie sicher, dass leichtere Zellen - die vom NS delaminiert werden - den Hauptkörper des NS umgeben.
7. Wechseln Sie am 7. Tag das Medium wie in 2.5 beschrieben. Wechseln Sie das Medium mit dem gleichen Verfahren alle 2 Tage bis zum Endpunkt der Studie.

3. CNCC-Schaltung und Wartung

HINWEIS: Die CNCC-Passage kann durchgeführt werden, sobald eine ausreichende Anzahl von Zellen um NS herum sichtbar ist. Dies kann bereits am 7. Tag der Fall sein, da frühere Zeitpunkte keine ausreichende Menge an CNCC liefern.

1. CNCC-Wartungsmedium vorbereiten. In Tabelle 1 finden Sie die Zusammensetzung des CNCC-Wartungsmediums.
   1. Vor der Zugabe zum Medium BSA nach der Solubilisierung durch einen 0,22 μm Filter filtrieren. Nach Zugabe von Wachstumsfaktoren lagern Sie das Medium bis zu 3 Wochen bei 4 °C. Stellen Sie sicher, dass das Medium vor Licht geschützt ist.
2. Bereiten Sie Fibronektin mit 7,5 μg/ml in PBS vor. Kräftig mischen.
3. Beschichten Sie die Vertiefungen einer nicht TC-behandelten 96-Well-Platte durch Zugabe von 100 μl Fibronektinlösung pro Vertiefung. Lassen Sie den Mantel 30 min bei RT unter der Kapuze liegen.
   HINWEIS: Wenn CNCC für Immunfluoreszenzfärbungen vorgesehen sind, legen Sie vor der Beschichtung ein Deckglas aus sterilem Glas auf den Boden der Vertiefung. Stellen Sie sicher, dass der Schieber am Boden des Bohrlochs bleibt und nicht schwimmt, um zu vermeiden, dass die gegenüberliegende Seite der zu verwendenden Seite beschichtet wird. Befolgen Sie die Anweisungen in Abschnitt 5 für die CNCC-Befestigung und -Montage.
4. In der Zwischenzeit wird in der nicht TC-behandelten 96-Well-Platte mit flachem Boden so viel CNCC-Differenzierungsmedium wie möglich aus den Wells aspiriert und durch 50 μL Accutase ersetzt. Bei 37 °C 5 min inkubieren.
5. Nach der Inkubation fügen Sie 100 μl CNCC-Erhaltungsmedium pro Vertiefung hinzu, um die Accutase zu löschen. Entfernen Sie Fibronektin aus den Vertiefungen der empfangenden, nicht TC-behandelten 96-Well-Platte mit flachem Boden. Filtern Sie die abgelösten postmigratorischen CNCC, indem Sie sie durch einen 40-μm-Filter auf der Vertiefung der nicht TC-behandelten 96-Well-Platte mit flachem Boden führen.
   HINWEIS: Dadurch werden Zellklumpen oder verbleibende NS herausgefiltert, die zuvor nicht entfernt wurden. CNCC, das unter dem gleichen Zustand angebaut wird, kann in einem 50-ml-Röhrchen gepoolt werden, um dann in derselben Vertiefung einer TC-behandelten 6-Well-Platte ausgesät zu werden. In diesem Fall beschichten Sie die Vertiefung mit 1 ml Fibronektin und verwenden Sie 1 ml CNCC-Erhaltungsmedium, um die Accutase zu löschen.
6. Lassen Sie die nachwandernde CNCC 15-30 min bei 37 °C ansetzen. Das Medium entsorgen und durch 100 μl CNCC-Wartungsmedium ersetzen. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
   HINWEIS: Fügen Sie vorsichtig Medium hinzu, da der schnelle Fluss eine Differenzierung von CNCC in neuronale Ableitungen induziert. Wenn Sie in einem 6-Well-Format arbeiten, verwenden Sie 1 ml CNCC-Wartungsmedium.

4. NS-Fixierung und -Einbettung für Immunfluoreszenz

1. Übertragen Sie NS zum gewünschten Zeitpunkt von der nicht TC-behandelten 96-Well-Platte mit flachem Boden in ein 2-ml-DNA-Röhrchen mit geringer Bindung, indem Sie die Spitze einer p200-Mikropipette abschneiden und vorsichtig auf und ab pipettieren, um die NS aufzunehmen.
   HINWEIS: Zu späteren Zeitpunkten (ab Tag 7) wird NS groß genug sein, um mit dem Auge gesehen zu werden, aber auch schwieriger zu lösen.
2. Lassen Sie NS 3 Minuten lang bei RT in der Tube einwirken, entfernen Sie so viel Medium wie möglich und spülen Sie es mit 1 ml kaltem PBS aus.
   HINWEIS: Wenn Sie kleine NS von frühen Zeitpunkten (vor den Tagen 3-4) übertragen, drehen Sie sie 3 Minuten lang bei 16 × g , um sicherzustellen, dass sich NS am Boden absetzt.
3. Entfernen Sie PBS und ersetzen Sie es in einer chemischen Haube durch 2 ml 4% PFA in PBS. 20 min bei RT inkubieren.
   1. Drehen Sie das Röhrchen nach Zugabe von 4%iger PFA-Lösung langsam um und lassen Sie es während der Fixierung an der Seite ruhen. Ziel ist es, NS leicht zu verteilen, damit sie in diesem Schritt nicht zusammenkleben.
4. Entfernen Sie die 4%ige PFA-Lösung (in der Chemikalienhaube) und waschen Sie NS mit 1 ml kaltem PBS/0,5 % Tween20. 3 min bei RT ruhen lassen. Wiederholen Sie dies insgesamt 3 Mal.
   HINWEIS: NS setzt sich unten ab.
5. Entfernen Sie PBS/0,5 % Tween20 und fügen Sie 2 ml PBS/0,1 % Triton X-100 hinzu. Drehen Sie das Rohr um und lassen Sie es an der Seite ruhen. 1 h bei RT inkubieren.
6. NS 3 Mal in kaltem PBS/0,5 % Tween20 waschen, wie in Schritt 4.4 gezeigt.
7. PBS/0,5 % Tween20 entfernen und mit 2 % BSA in PBS bei 4 °C für mindestens 1 Stunde, vorzugsweise über Nacht, blockieren.
   HINWEIS: Die Proben können in 2 % BSA/PBS bis zu 1 Woche bei 4 °C gelagert werden. Vor Licht schützen.
8. Bereiten Sie die Primärantikörperlösung vor, indem Sie die richtige Verdünnung des Primärantikörpers mit 2 % BSA/PBS in einem Endvolumen von 500 μl hinzufügen. Für den in dieser Studie verwendeten primären Antikörpermix siehe Tabelle 2.
9. Entfernen Sie so viel wie möglich von der Blockierungslösung und geben Sie den NS in ein 0,5-ml-Röhrchen, indem Sie die Spitze einer p200-Mikropipette abschneiden.
10. Fügen Sie die primäre Antikörperlösung hinzu und pipettieren Sie langsam auf und ab, um das NS zu resuspendieren. Über Nacht auf einem Rotator bei 4 °C inkubieren.
11. NS 3 mal in kaltem PBS für 5 min bei RT waschen.
12. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung vor, indem Sie die Sekundärantikörper Ihrer Wahl in 2 % BSA/PBS verdünnen und 1/1000 DAPI hinzufügen. Für den in dieser Studie verwendeten Sekundärantikörpermix siehe Tabelle 2.
    HINWEIS: Bewahren Sie die Röhren vor Licht geschützt auf.
13. Ersetzen Sie PBS durch 500 μl Sekundärantikörperlösung und wickeln Sie das Röhrchen mit Aluminiumfolie ein, um es vor Licht zu schützen. Inkubieren Sie 1 h lang auf dem Rotator bei RT.
14. NS 3 Mal in kaltem PBS waschen, wie in Schritt 4.11 beschrieben.
15. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich, ohne das NS zu aspirieren, ersetzen Sie es durch 50 μl Clearingmittel und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
16. Inkubieren Sie über Nacht bei RT, geschützt vor Licht.
17. Bereiten Sie die Montagekammern vor.
    1. Legen Sie drei Lagen doppelseitiges Klebeband auf einen Objektträger. Verwenden Sie transparentes, faserloses Klebeband, um Rückstände in der Montagekammer zu vermeiden.
    2. Schneide mit einem Rasiermesser ein 3 mm × 8 mm großes Fenster in das Doppelband.
       HINWEIS: Die Abmessungen der Kammer hängen vom Zeitpunkt der Abtastung ab. Dieses Beispiel eignet sich für die Aufnahme von 50 μl Einbettmedium, was optimal für 10-20 einzelne NS zu späteren Zeitpunkten (Tage 7-9) ist.
18. Übertragen Sie das NS im Räummittel vorsichtig unter einem Stereoskop in die Einbettkammer, indem Sie eine p200-Mikropipettenspitze mit geringer Adhäsion abschneiden. Verwenden Sie eine Vergrößerung zwischen 2x und 4x, um ein Sichtfeld der gesamten Kammer und eine ausreichende Vergrößerung zur Identifizierung des NS zu erhalten. Wenn das Stereoskop für die Fluoreszenzbildgebung ausgerüstet ist, erleichtert die Arbeit mit einem blauen Fluoreszenzfilter die Identifizierung des NS, da die DAPI-Färbung den ansonsten transparenten NS hervorhebt.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Medium einen leicht konvexen Meniskus über der Kammer bildet. Dadurch wird sichergestellt, dass sich keine Blasen in der Kammer befinden.
19. Legen Sie ein Deckglas auf die Oberfläche und drücken Sie leicht auf die Seiten, damit es haftet. Führen Sie diesen Schritt unter dem Stereoskop durch und vergewissern Sie sich, dass die NS nicht aus der Kammer gedrückt werden.
20. Bis zur Aufnahme bei 4 °C lichtgeschützt lagern.

5. CNCC-Fixierung und -Einbettung für Immunfluoreszenz

1. Entfernen Sie das CNCC-Wartungsmedium aus den Vertiefungen und waschen Sie sie mit PBS. Geben Sie PBS vorsichtig hinzu, indem Sie es an der Seite der Vertiefung pipettieren.
2. Fahren Sie mit der Fixierung, Permeabilisierung und Färbung fort, wie in den Schritten 4.3-4.14 beschrieben.
3. Montieren Sie Deckgläser auf einem Mikroskopie-Objektträger, indem Sie Eindeckmedium auf den Objektträger aufbringen, das Deckglas mit einer Pinzette greifen und drehen, so dass das postmigratorische CNCC auf den Objektträger zeigt, und es auf den Tropfen legen.
   1. Optional: Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack oder anderen gängigen Dichtungssystemen.
4. Bis zur Aufnahme bei 4 °C lichtgeschützt lagern.

Ergebnisse

Gemäß dem Protokoll wurden mES-Kolonien dissoziiert und 3000 Zellen in nicht-TC-behandelte U-Boden-96-Well-Platten ausgesät. An Tag 2 wurden aggregierte NS in nicht TC-behandelte 96-Well-Platten mit flachem Boden überführt, damit sie sich anlagern konnten. Eine vereinfachte Visualisierung des NS-Aggregationsprotokolls ist in Abbildung 1A dargestellt. NS wurden bis zum Tag 9 kultiviert und dann für die Immunfluoreszenzfärbung verarbeitet. Zellen, die v...

Diskussion

In vitro 3D-Differenzierungsmodelle ermöglichen die Analyse komplexer Zellinteraktionen, die in 2D-Zellkulturen nur schwer oder gar nicht beobachtet werden könnten. Es wurden mehrere Modelle entwickelt, um die CNCC-Entwicklung in vitro zu untersuchen. Diese stammen in der Regel direkt aus ESC-Kolonien ^7,21 oder Gewebeexplantaten^22,23. Obwohl sich diese...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm syringe filters	ClearLine	146560
15 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352096
200 µL ClearLine Plus Low Binding Filter Tips	Dutscher	713263
40 µm filters	Falcon	352340
5 mL Serological pipette	Starstedt	86.1253.001
50 mL High-Clarity Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
Accutase	Merck-Sigma	A6964
Alexa Fluor 488 donkey anti rabbit IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21206
Alexa Fluor 594 donkey anti mouse IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A21203
Alexa Fluor 647 donkey anti goat IgG (H+L)	Thermofisher Scientific	A31571
Antibiotic-antimycotic solution	Merck-Sigma	A5955
B27 PLUS supplement	Thermofisher Scientific	17504044
Bovine serum albumin (BSA)	Merck-Sigma	A9418
Chloroform	Carlo Erba	438601
Collagenase Type IV	Thermofisher Scientific, Gibco	17104019
Costar 6 well clear TC-treated multiple well plates	Corning	3516
Cover glasses, round	VWR	630-2113
DMEM KnockOut	Thermofisher Scientific	10829018
DMEM/F12+Glutamax	Thermofisher Scientific	10565018
DMEM high glucose	Merck-Sigma	D0822
DNA LoBind Tubes, 2 mL	Eppendorf	30108078
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermofisher Scientific	10977-035
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher Scientific	14190144
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL	Eppendorf	30121023
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL	Eppendorf	30120094
ESGRO mLIF Medium Supplement	Merck-Sigma	ESG1107
Ethanol 70%	Carlo Erba	528170
Fetal Bovine Serum	Merck-Sigma	F7524
Fibronectin	Merck-Sigma	F085-2MG
Fluoromount-G	Invitrogen	00-4958-02
Gelatin solution	Merck-Sigma	ES-006-B
GlutaMAX	Thermofisher Scientific	35050061
Human EGF	Peprotech	AF-100-15-500UG
Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Human SOX9 Antibody	R&Dsystems	AF3075
Insulin from bovine pancreas	Merck-Sigma	I6634
iScript cDNA Synthesis Kit	Biorad	1708891
Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	3B5
Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, Unconjugated	DSHB	PAX7
N2 supplement	Thermofisher Scientific	17502048
Neurobasal Medium	Thermofisher Scientific	21103049
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, Flat bottom	Falcon	351172
Non-Tissue culture treated plate, 96 well, U-bottom	Falcon	351177
Paraformaldehyde 16% solution, em grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Propan-2-ol	Carlo Erba	415154
Purified anti-Tubulin β 3 (TUJ1) Antibody	Biolegend	MMS-435P
RapiClear 1.47	Sunjin Lab	RC147001
RapiClear 1.52	Sunjin Lab	RC152001
Scotch Double Sided 12.7 mm × 22.8 m			Clear fibreless double sided tape
SensiFAST SYBR No-ROX Kit	Meridian Bioscience	BIO-98020
Sterile Disposable Surgical Scalpels	Swann-Morton	05XX
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides	Epredia	J1800AMNZ
Triton X-100	Thermofisher Scientific	A16046.AP
TRIzol Reagent	FisherScientific	15596026
Trypsine-EDTA (0.05%)	Thermofisher Scientific	25300054
Tween-20	Fisher Scientific	10113103
TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)	Cell signaling technology	E7E2G
β-mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	31350010