فحص الجزيئات الصغيرة واختبار السمية في يرقات الزرد في المراحل المبكرة

Summary

يصف هذا البروتوكول إجراء فحص الأدوية في يرقات الزرد بعد 3-7 أيام من الإخصاب متبوعا بالتقييم المورفولوجي.

Abstract

أصبحت أسماك الزرد كائنا نموذجيا بارزا للأبحاث الانتقالية البشرية ، واختبار سمية الجزيئات الصغيرة والملوثات البيئية ، واكتشاف الأدوية العلاجية ، وتطبيقات البحوث الطبية الحيوية الأخرى. يهدف البروتوكول المقدم إلى توفير دليل واضح لفحص الأدوية واختبار السمية في يرقات الزرد في المراحل المبكرة (التي تتراوح أعمارها بين 3-7 أيام بعد الإخصاب ، dpf). تم نشر العديد من المنهجيات التي تصف اختبار السمية في يرقات الزرد ، وإن كانت تفتقر إلى بروتوكول موحد لفترات التعرض ، ومعدل تغيرات الوسائط ، وتسجيل التشكل ، من بين أمور أخرى. لقد حددنا تجريبيا أعمار اليرقات المثالية لإجراء التجارب ، وأحجام الألواح التي تعمل بشكل أفضل لتلك الأعمار ، ومعدل تغيرات الوسائط التي توفر نتائج موثوقة مع الحد من هدر مركب الاختبار ، ونظام تسجيل التشكل الذي يمكن قياسه بسهولة بطريقة إحصائية. تصف المخطوطة بالتفصيل بروتوكولا لاختبار السمية في يرقات الزرد التي تتراوح أعمارها بين 3 إلى 7 dpf ، بهدف استهداف الفجوة في اختبار سمية الأدوية واتخاذ الخطوة الأولى نحو طريقة موحدة مشابهة لاختبار السمية الحادة لجنين السمك.

Introduction

برزت أسماك الزرد (Danio rerio) مؤخرا ككائن حي نموذجي قوي للفقاريات ، وأصبحت شائعة بشكل متزايد للدراسات الرامية إلى تطوير البحوث الطبية^{الحيوية 1}. حوالي 70٪ من جينات ترميز البروتين البشري لديها تقويم واحد على الأقل لسمكة الزرد ، مع ~ 82٪ من الجينات المسببة للأمراض البشرية التي تحتوي على جين متعامد واحد على الأقل في الزرد². إن الحفظ الجيني ، إلى جانب نقوش الأعضاء الأساسية المماثلة ومورفولوجيا ، يجعل من سمك الزرد نموذجا مثيرا للاهتمام لأبحاث الأمراض البشرية ، مما يسمح بإجراء مقارنات بين الأنواع على المستوى الجزيئي^1،2،3 ، وهو أمر بالغ الأهمية لتطوير الأدوية.

تتطور أسماك الزرد بسرعة مع تكوين برعم الذيل بعد 10 ساعات من الإخصاب (HPF) وظهور الجسيدات الأولى عند 16 HPF. تخرج الأجنة من المشيمة في ~ 2-3 أيام بعد الإخصاب (dpf). بحلول 4 dpf ، يكون الجهاز الهضمي قد تطور بالكامل وبواسطة 5 dpf ، تضخمت مثانة السباحة ، مما يسمح لهم بالسباحة بحرية والبحث عن الطعام. على الرغم من القدرة على التغذية بمقدار 5 dpf ، يمكن لليرقات غير المغذية البقاء على قيد الحياة فقط على العناصر الغذائية المشتقة من صفار البيض حتى 7 dpf على الأقل ، والتحايل على الحاجة إلى التغذية الخارجية التي قد تسبب التلوث وتتداخل مع فحص الأدوية وعلم السموم والاختبارات السلوكية⁴. بحلول 7 dpf ، تطور اليرقات أيضا خطة جسم كاملة مع العديد من أنظمة الأعضاء البدائية ، بما في ذلك القلب والأوعية الدموية والعضلات والعظام^5،6. يتم أيضا تخصيب أجنة الزرد من الجسم الحي ، وتتطور خارجيا ، وتكون شفافة بصريا في مراحل الحياة المبكرة ، مما يجعلها سهلة الوصول إلى تحرير الجينات وفحص الجزيئات الصغيرة³. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح حجمها الصغير ومعدل الخصوبة المرتفع بإدراج المزيد من التكرارات ، مما يزيد من القوة الإحصائية ، وكذلك لاستخدام الألواح متعددة الآبار ، مما يوفر كميات الأدوية ويزيد من الإنتاجية.

يعد فحص الجزيئات الصغيرة الجديدة في النموذج الحيواني أمرا مهما لتحديد قدرة الأدوية على إحداث آثار مفيدة أو ضارة ، وبالتالي تحديد المركبات القابلة للتطبيق لمزيد من الاختبارات وغيرها من المركبات التي قد تتطلب تعديلا لتغيير نشاطها. كجزء من عملية فحص المخدرات ، يجب تحديد التركيز المميت 50 (LC₅₀) للمركب / المركب المستهدف. يوفر هذا تركيزا عمليا يسبب الوفاة في 50٪ من الاختبار كجزء من اختبار السمية الأولي.

يوجد بروتوكول موحد لاختبار السمية في أجنة أسماك الزرد حتى 96 ساعة بعد الإخصاب (HPF) ، وهو اختبار السمية الحادة لجنين الأسماك (FET) (TG236) ⁷. في اختبار FET ، يتعرض البويضات المخصبة حديثا لخمسة تركيزات من مادة كيميائية لمدة تصل إلى 96 ساعة ويتم ملاحظتها لعلامات الفتك ، وهي (أنا) تخثر البيض ، (ثانيا) نقص تكوين الجسيدات ، (ثالثا) عدم انفصال برعم الذيل عن كيس الصفار ، و (رابعا) عدم وجود ضربات قلب. يسمح الاختبار بتحديد السمية الحادة و LC₅₀. علاوة على ذلك ، فإنه ينصح أيضا بأحجام غرف الاختبار لاستخدامها في الفحص (24 لوحة بئر) ، وتوزيع البيض في غرفة الاختبار ، وظروف السكن ، من بين أمور أخرى ، مما يضمن نتائج صالحة وقابلة^{للتكرار 7}.

في حين أن اختبار FET مناسب لاختبار السمية في المرحلة الجنينية ، إلا أنه لا يتجاوز 4 dpf. بالنسبة للأنماط الظاهرية التي تبدأ في التطور في هذه المرحلة الزمنية تقريبا (على سبيل المثال ، تمعدن الحبل^{الظهري 6}) ، يجب أن يستمر فحص الدواء إلى أبعد من 4 dpf لتمكين التقييم المورفولوجي لهذه الأنسجة. علاوة على ذلك ، نوصي بأن يبدأ التعرض للأدوية قبل يوم واحد على الأقل من تطور النمط الظاهري محل الاهتمام. على حد علمنا ، لا يوجد بروتوكول موحد مشابه ل FET لفحص الأدوية في يرقات أسماك الزرد في المراحل المبكرة ، وتحديدا في أسماك الزرد التي تتراوح أعمارها بين 3 و 7 dpf. في حين تم نشر العديد من الدراسات التي تصف اختبار المخدرات في يرقات أسماك الزرد التي تتجاوز 4 dpf ، إلا أن هناك نقصا في الاتساق في المنهجية المستخدمة ، بما في ذلك حجم غرف الاختبار ، وعدد التكرارات البيولوجية والتقنية ، ومعدل تغيرات الوسائط ، وفترات التعرض ، والعيوب المورفولوجية التي تم^{تقييمها 8،9،10،11،12،13}. لهذا السبب ، قمنا بتطوير بروتوكول تم التحقق من صحته لاختبار السمية الموحد متبوعا بالملاحظة البصرية للتغيرات المورفولوجية في يرقات سمك الزرد عند 3-7 dpf. يمكن استخدام البروتوكول المقترح لاحقا لمقايسات التنميط الظاهري النهائية الأخرى ، مثل التحليل السلوكي ، وتوصيف التعبير الجيني ، وقياس الشكل.

Protocol

تم التعامل مع أسماك الزرد وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63 / EU. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة أخلاقيات البحث في الكلية (FREC) واللجنة الفرعية القطاعية المشتركة لأبحاث FREC (JFARSS) التابعة لجامعة مالطا. يمكن العثور على مخطط انسيابي للبروتوكول المقترح في الشكل 1.

1. إنتاج البيض وجمعه وصيانته

1. قم بإعداد الأسماك في أحواض التكاثر في اليوم السابق ، بعد ساعة على الأقل من آخر تغذية ، مع وضع فواصل تفصل بين الذكور والإناث. للحصول على نتائج أفضل لإنتاج البيض ، استخدم نسبة أعلى من الإناث إلى الذكور. ضع السمكة في غرفة مجهزة بدورة إضاءة / ظلام 14 ساعة: 10 ساعات ودرجة حرارة محيطة 27-28 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن لخزان التكاثر سعة 1 لتر أن يستوعب ثلاث أسماك بالغة ، بينما يمكن لخزان التكاثر سعة 1.7 لتر أن يستوعب خمس أسماك بالغة.
2. في صباح اليوم التالي ، بعد بداية الضوء ، استبدل الماء في خزانات التكاثر وقم بإزالة الفواصل. في حالة عدم انحدار خزان التكاثر بسهولة ، ضعه في وضع مائل للتأكد من توفر المياه الضحلة لتعزيز التزاوج. في حالة بطء إنتاج البيض ونشاط التزاوج ، استبدل الماء في خزانات التكاثر كل 45 دقيقة. اترك السمكة تتزاوج لمدة تصل إلى 3 ساعات أو حسب الحاجة.
3. بمجرد اكتمال التزاوج ، اضغط برفق على أي إناث لم تنتج بيضا لمنع ارتباط البيض على المدى الطويل. ضع الأسماك مرة أخرى في أحواض الخزان الخاصة بها.
4. اجمع أي بيض في خزانات التكاثر باستخدام مصفاة شبكية ، واشطفه بماء الجنين (E3) ، وضعه في طبق بتري مع E3. لتحضير E3 ، اخلطي 16.67 مل من 60x E3 (300 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 10 ملي كلوريد كلوريد الصوديوم ؛ 20 ملي كلوريد_{المكالسيوم 2.2} ساعة₂درجة ؛ 20 ملي مللي MgSO_{4.7H 2}O) مع 1 مل من 0.01٪ أزرق الميثيلين و 982 مل من الماء منزوع الأيونات. قم بإزالة أي بيض أو حطام غير مخصب. تأكد من أن أطباق بتري ليست مزدحمة ، مع 50 بيضة لكل طبق بتري 100 مم × 15 مم و 120 بيضة لكل طبق بتري 150 مم × 15 مم.
5. احتفظ بالبيض في حاضنة مضبوطة على 28.5 درجة مئوية ومجهزة بدورة نهارية / ليلية تبلغ 14 ساعة: 10 ساعات. عند 1 نقطة في الدقيقة ، قم بتحديث E3 وإزالة البيض غير القابل للحياة للحد من نمو الفطريات.

2. إعداد لوحة الاختبار

1. عند 3 dpf ، انقل جنينا واحدا صحي المظهر وفقس إلى كل بئر في صفيحة مكونة من 96 بئرا باستخدام ماصة دقيقة سعة 1,000 ميكرولتر مضبوطة على حجم 100 ميكرولتر.
   ملاحظة: لا ينبغي استخدام الأجنة غير المفرغة ، لأن هذا قد يؤدي إلى امتصاص متغير للمركب. كما أن استخدام الأجنة التي تبدو صحية يحد من التحيز أثناء الاختبار. يسمح حجم طرف الماصة بجمع جنين الزرد بسهولة دون التسبب في أي ضرر مادي. بالإضافة إلى ذلك، تسمح الماصة الدقيقة بالتحكم بشكل أفضل في الحجم الذي يتم توزيعه في البئر بدلا من ماصة النقل.
2. في صفيحة مكونة من 12 بئرا ، قم بإعداد التركيز (التركيزات) المطلوبة لكل مادة كيميائية للاختبار في آبار منفصلة (هنا ، Bosutinib في نطاق تركيز من 100 ميكرومتر إلى 6.25 ميكرومتر). في كل بئر ، أضف الحجم اللازم من مادة الاختبار الكيميائية باستخدام الماصات الدقيقة واصنع ما يصل إلى 2.4 مل باستخدام E3.
   ملاحظة: ينبغي إجراء بحث في الأدبيات لتحديد التركيزات الكافية لاستخدامها في مواد الاختبار الكيميائية ذات الصلة. إذا لم تكن هناك معلومات متوفرة ، فيمكن تجربة العديد من التركيزات حتى يتم تحديد نطاق تركيز مناسب. يجب استخدام ما لا يقل عن خمسة تركيزات، بحيث يتسبب أعلى تركيز في الوفيات بنسبة 100٪ وأدنى تركيز لا يسبب أي تأثير ملحوظ⁷.
3. قم بإعداد التحكم في السيارة اعتمادا على المذيب المستخدم لإذابة مادة اختبار المخزون الكيميائية.
   ملاحظة: العديد من مركبات الاختبار غير قابلة للذوبان في الماء ولهذا السبب ، يجب إذابتها في مذيبات محددة ("مركبات") مثل الإيثانول أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتوليد محلول مائي. يفضل ألا يتجاوز DMSO تركيز 1٪ عند استخدامه كعنصر تحكم في السيارة ، وهو التركيز الآمن في أسماك الزرد¹⁴.
4. قم بإزالة أي محلول E3 موجود في الصفيحة المكونة من 96 بئرا باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر واستبدله ب 100 ميكرولتر من الوسط المقابل الذي يتم اختباره. تأكد من اختبار ما مجموعه 24 يرقة لكل تركيز. استخدم ماصة دقيقة أحادية أو 8 قنوات سعة 200 ميكرولتر لنقل المواد الكيميائية للاختبار إلى آبار لوحة الاختبار المقابلة. قم بتضمين عناصر التحكم (على سبيل المثال ، E3 ، المركبة الكيميائية ، الضوابط الإيجابية ، إلخ).
   ملاحظة: يستوعب إعداد اللوحة ما يصل إلى أربع مواد كيميائية اختبار مختلفة أو أربعة تركيزات مختلفة من نفس المادة الكيميائية. يظهر في الشكل 1 مثال على لوحات الاختبار التي تم إعدادها لفحص خمسة تركيزات من نفس المادة الكيميائية (على سبيل المثال ، Bosutinib) مصحوبة بعناصر تحكم.
5. بعد 24 ساعة من التعرض ، قم بإجراء التسجيل المورفولوجي (كما هو موضح في القسم 3) وتغيير نصف متوسط ، وإزالة 50 ميكرولتر من الوسط واستبداله بوسط معد حديثا. قم بإزالة وتسجيل أي يرقات ميتة في هذه العملية. احتفظ باليرقات في حاضنة مضبوطة على 28.5 درجة مئوية ومجهزة بدورة نهارا/ليلية 14 ساعة: 10 ساعات. كرر العملية حتى 7 dpf.

3. التقييم المورفولوجي

1. باستخدام مجهر ضوئي ستيريو ، راقب يرقات الاختبار الفردية بتكبير مناسب.
   ملاحظة: يتم توفير أمثلة على العيوب المورفولوجية التي يمكن تقييمها في الجدول 1.
2. قم بتقييم التشكل من قبل اثنين من الهدافين المستقلين ، مع استشارة ثالث في حالة وجود خلافات بين الهدافين.
3. قم بتسجيل التشكل باستخدام طريقة ثنائية (أي حاضر / غائب) ، حيث تشير كلمة "غائب" إلى التشكل الطبيعي (تم تسجيلها على أنها "0") و "حاضر" تشير إلى وجود شذوذ مورفولوجي (تم تسجيله على أنه "1"). يوضح الشكل 2 أمثلة على أسماك الزرد عند 5 dpf بعد يومين من التعرض للمخدرات ، بما في ذلك سمكة الزرد غير المتأثرة (الشكل 2 أ) ، وسمكة الزرد المصابة بوذمة التامور الخفيفة (الشكل 2 ب) ، وذمة التامور الشديدة مع نزيف صفار البيض وامتداد صفار البيض (الشكل 2 ج) ، تأخر النمو مع انخفاض التصبغ ، ومثانة السباحة والطول الكلي (الشكل 2 د) ، وتورم صفار البيض وزعنفة الذيلية الملتوية (الشكل 2 ه) ، الزعنفة الذيلية الغائبة (الشكل 2F) ، الحبل الظهري المنحني (الشكل 2G) ، الاقتطاع (الشكل 2H) والموت مع النخر (الشكل 2I). قم بتسجيل جميع الأنماط الظاهرية غير الطبيعية ك "1" وسمك الزرد غير المتأثرة ك "0".

4. تصميم LC₅₀

1. بعد تقييم التشكل ، ارسم النسبة المئوية التراكمية للوفيات عند 7 dpf مقابل التركيز. يظهر مثال في الشكل 3. استخدم منحنى التركيز لتقدير التركيز الذي يسبب 50٪ من الوفيات.
2. بمجرد تقدير تركيز LC₅₀ ، كرر التجربة الموضحة أعلاه عن طريق تعريض 24 يرقة مكررة في صفيحة مكونة من 96 بئرا لتركيز LC₅₀ المقدر الفردي.

5. التكرارات التقنية

1. كرر الإجراء بأكمله باستخدام التركيزات الخمسة المحددة من نفس المادة الكيميائية مرتين أخريين على الأقل في مناسبتين منفصلتين للتأكد من أن النتائج قابلة للتكرار.

النتائج

يمكن النظر إلى التشوهات بشكل فردي أو تراكمي على مدار الجدول الزمني التجريبي حتى 7 dpf. يمكن استخدام الحد الأقصى لدرجة التشكل لكل شذوذ لحساب التشوهات المورفولوجية كنسبة مئوية من عدد اليرقات المستخدمة. على سبيل المثال ، إذا كانت درجات مورفولوجيا وذمة التامور في اليوم 7 عند 19 و 20 للهدافين 1 و 2 ، على التوالي ، من أصل درجة محتملة تبلغ 24 ، مما يعني أن 19 أو 20 يرقة من أصل 24 تظهر وذمة التامور ، فيمكن حساب النسبة المئوية للدرجة على النحو التالي:

يوضح الجدول التكميلي S1 نتائج تسجيل التشكل (لكلا الهدافين) عند 4 dpf بعد اختبار السمية لمركب Bosutinib ، وهو مثبط للتيروزين كيناز موصوف لعلاج سرطان الدم النخاعي^{المزمن 15}. يتم تكرار نفس تسجيل التشكل للأسماك المكشوفة التي تتراوح أعمارها بين 5 dpf و 7 dpf. تم اختبار المركب باستخدام نطاق تركيز من 100 ميكرومتر إلى 6.25 ميكرومتر. تم إجراء ثلاث تكرارات تقنية في نقاط زمنية مختلفة ، وتم استخدام متوسط معدل الوفيات التراكمي عند 7 dpf لتحديد LC₅₀ ، وهو التركيز الذي تعيش فيه 50٪ من اليرقات. يمكن تحديد LC₅₀ في أي نقطة زمنية للتعرض. ومع ذلك ، نوصي بحساب هذا عند 7 dpf.

تم استخدام متوسط الوفيات التراكمي عند 7 dpf لإنشاء منحنى LC₅₀ ، والذي يمكن رؤيته في الشكل 3. بالنسبة لبوسوتينيب ، قدر تركيز LC₅₀ ب 37.95 ميكرومتر.

ملاحظة: ينطبق تركيز LC₅₀ المقدر هذا بشكل صارم على هذا النظام النموذجي ويمكن استخدامه بعد ذلك لمزيد من فحوصات التنميط الظاهري في المصب.

الشكل 1: تخطيطي لفحص الأدوية المقترح في اليرقات عند 3-7 dpf. تم إعداد لوحات الاختبار المكونة من 96 بئرا لفحص خمسة تركيزات تتراوح بين 100 ميكرومتر و 6.25 ميكرومتر لمركب Bosutinib. الاختصار: dpf = أيام ما بعد الإخصاب. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: عيوب مورفولوجية تمثيلية لوحظت في يرقات سمك الزرد عند 5 dpf المعرضة لتركيزات كيميائية مختلفة (بعد يومين من التعرض). (أ) الضابط (غير المتأثر) ، (ب) يرقات الزرد التي تظهر وذمة التامور الخفيفة ، (ج) الزرد مع وذمة التامور الشديدة ونزيف صفار البيض ، (د) الزرد مع تأخر في النمو ، وانخفاض التصبغ ، ومثانة سباحة صغيرة ، (ه) الزرد مع صفار منتفخ وزعنفة ذيلية ملتوية ، (و) الزرد مع عدم وجود زعنفة ذيلية ، (ز) الزرد مع الحبل الظهري المنحني ، (ح) الزرد ذو الذيل المقطوع ، و (أنا) سمك الزرد الميت مع النخر. لوحظت العيوب برؤوس الأسهم الحمراء. أشرطة المقياس = 1 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: منحنى LC₅₀ يظهر التركيز مقابل النسبة المئوية للوفيات. كانت التركيزات الخمسة المختبرة هي 100 ميكرومولار ، و 50 ميكرومتر ، و 25 ميكرومتر ، و 12.5 ميكرومتر ، و 6.25 ميكرومتر ، مع نسبة الوفيات 100٪ و 100٪ و 29.2٪ و 12.5٪ و 12.5٪ على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

العيوب المورفولوجية	وصف
وذمة التامور	تراكم السوائل حول القلب مع تمدد القلب وخلل في الدورة الدموية
ضربات القلب (في الدقيقة)	تقليل عدد النبضات في الدقيقة
صفار	وجود أو عدم وجود وذمة صفار البيض أو نزيف يمكن أن يحدث في وقت واحد مع عيوب القلب
تمديد صفار البيض	صفار البيض المتورم أو الرقيق أو الغائب
حبل الظهري المنحني	وجود حبل الظهري الملتوي أو المتموج و / أو ذيل منحني
المثانة السباحة	وجود مثانة السباحة أو غيابها أو تطورها الجزئي
تصبغ	خلايا ميلانينية أقل أو معدومة مقارنة بالأسماك غير المعالجة في نفس العمر
نخر	وجود (خفيف أو شديد) أو عدم وجود نخر في أي جزء من الجسم
تأخر التطوير	تأخر التطور أو توقف مقارنة بعناصر التحكم البرية من نفس العمر.
الاستجابة للمس	تأخر الاستجابة أو عدم الاستجابة بعد الذهول (على سبيل المثال، استخدام طرف ماصة)
اقتطاع	غياب جسم الزرد الخلفي (أي تكوين الذيل)
زعانف	وجود أو عدم وجود الزعنفة الذيلية التي قد تكون مصحوبة بامتداد صفار رفيع
محور الجسم المنخفض	الأسماك التي تبدو طبيعية ولكن عند قياسها تكون أقصر في الطول

الجدول 1: قائمة بالعيوب المورفولوجية البصرية التي يمكن ملاحظتها بعد دراسات التعرض للأدوية.

الجدول التكميلي S1: النتائج المورفولوجية التمثيلية ل Bosutinib عند 4 dpf (يوم واحد بعد التعرض). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

أصبحت أسماك الزرد نموذجا مهما لفحص الأدوية. عند محاولة تحديد منهجية لإجراء اختبار السمية ، وجدنا العديد من الطرق المتناقضة من مختبرات مختلفة^{8،9،10،11،12،13}. تستخدم الطرق الموصوفة اليرقات في أعمار مختلفة ، وجداول زمنية تجريبية متغيرة ، ومعدلات مختلفة من التغيرات المتوسطة ، وأنظمة تسجيل مورفولوجية مختلفة. من خلال التجربة والخطأ ، وضعنا المنهجية الموصوفة ، والتي قدمت نتائج موثوقة وقابلة للتكرار.

اختيار حجم اللوحة
في البداية ، تم إجراء التجارب في صفيحة مكونة من 24 بئرا للتأكد من أن اليرقات لديها مساحة كافية للتحرك والنمو. تم ترتيب الصفائح ب 10 يرقات لكل بئر ، وبئرين لكل تركيز ، و 1 مل من محلول الدواء لكل بئر. لم يقدم هذا الترتيب نتائج قابلة للتكرار ، مما أدى إلى الاستدلال على أن اليرقات لم تكن تمتص كميات متساوية من الدواء من البئر. ثم أجريت التجارب باستخدام صفيحة مكونة من 96 بئرا و 48 بئرا مع يرقة واحدة لكل بئر ، مما أظهر أن اليرقات في ألواح 96 بئرا لم تظهر أي مشاكل في النمو. ومن ثم ، استمرت التجارب في صفيحة مكونة من 96 بئرا باستخدام مساحة أقل وأحجام أدوية.

التغيير اليومي المتوسط
نظرا لأن أسماك الزرد تمتص الدواء من الوسط ، فقد تأكدنا من أن هناك حاجة إلى درجة من التغيير المتوسط للحفاظ على تركيز ثابت للدواء في الوسط. علاوة على ذلك ، يزيل التغيير المتوسط النفايات المحتملة المتراكمة في البئر ، والتي يمكن أن توفر بيئة سامة وتؤدي إلى نتائج متحيزة. أجريت تجربة مع Bosutinib ، حيث تم إعداد ثلاث لوحات لنفس الدواء ، واحدة بدون تغيير متوسط يومي ، وواحدة مع تغيير يومي نصف متوسط ، وواحدة مع تغيير متوسط يومي كامل. في حين أن اللوحة التي لم تتغير فيها متوسطة أظهرت معدلات وفيات متزايدة ، فإن الصفائح ذات التغيرات المتوسطة النصفية والكاملة أسفرت عن نفس النتيجة بمقدار 7 dpf. وهكذا ، تم اختيار تغيير يومي نصف متوسط. يضمن هذا الاختيار استهلاكا أقل لمواد الاختبار باهظة الثمن والمحدودة ، والتي يمكن أن تكون مطلوبة لمزيد من التجارب النهائية.

مدة التعرض
كان عمر يرقات الاختبار المستخدمة ومدة التعرض للأدوية المختارة في هذا البروتوكول مدفوعا بالنمط الظاهري الذي يثير اهتمامنا وهو تمعدن العظام. نظرا لأن تكوين العظام يبدأ عند ~ 4 dpf ، فقد اخترنا أن نبدأ بسمك الزرد عند 3 dpf لتحديد ما إذا كانت مواد الاختبار الكيميائية تؤثر على بداية نمو العظام. بعد ذلك ، أنهينا دراسات التعرض للأدوية عند 7 dpf حيث لوحظت درجة عالية من الوفيات من 8 dpf فصاعدا في ضوء نقص التغذية التي قد تحيز النتائج. ومع ذلك، يمكن تعديل الأطر الزمنية تبعا لطبيعة الدراسة والنمط الظاهري محل الاهتمام.

القيود
هذه المنهجية لها بعض القيود. يستغرق نقل 3 dpf من أسماك الزرد إلى ألواح اختبار متعددة الآبار وقتا طويلا. إن إزالة الوسط من الآبار دون التقاط اليرقات أمر شاق بنفس القدر. يجب إزالة الوسط من كل بئر ببطء باستخدام ماصة أحادية القناة ، مما يضمن عدم تلف اليرقات في هذه العملية. علاوة على ذلك ، في حين أن التغيير اليومي نصف المتوسط يجدد مركب الاختبار ويضمن إزالة النفايات من البئر ، فإنه لا يضمن إمكانية الحفاظ على تركيز ثابت للدواء في البئر طوال 5 أيام من التعرض. في حين أن تحليل الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء يمكن أن يعطي مزيدا من التبصر حول الكمية الفعلية للدواء التي تمتصها كل يرقة ، فإن الاختبار لم يعد مؤهلا كطريقة فحص عالية الإنتاجية.

في الختام ، تهدف هذه المنهجية إلى استهداف الفجوة في اختبار السمية باستخدام أسماك الزرد التي تتجاوز 4 dpf ، واتخاذ خطوات نحو بروتوكول موحد ينطبق على خطوط أسماك الزرد البرية والمتحولة والمعدلة وراثيا ، وهذا على قدم المساواة مع FET في المرحلة الجنينية. هذا يفتح طرقا لمقايسات الأنماط الظاهرية النهائية الأخرى التي قد لا تكون ممكنة في المراحل المبكرة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Starlab	E1415-1510
10 µL micropipette (P10)	Gilson	F144802
10/20 µL pipette tips	Starlab	S1110-3810
1000 µL micropipette (P1000)	Gilson	F123602
1000 µL pipette tips	Starlab	S1111-6001
12-well plate	Starlab	CC7672-7512	Sterile, single-wrapped, non-treated, with lid
20 µL micropipette (P20)	Gilson	F123600
200 µL micropipette (P200)	Gilson	F123601
200 µL multi-channel pipette	Gilson	F81024
200 µL pipette tips	Starlab	S1113-1006
96-well plate	Starlab	CC7672-7596	Sterile, single-wrapped, flat-bottom, non-treated, with lid
Breeding tanks with inside grid sloping bottom, tank dividers and lids	Tecniplast	ZB17BTISLOP, ZB17BTE,  ZB17BTL, ZB17BTD	Sloped inner tank
Mesh strainer	/	/
Nitrile gloves	Mercator	/	/
Petri-dish	Starlab	CC7672-3394/CC7672-3359	100 x 20 mm or 60 x 15 mm
Leica M205 FCA Fluorescence stereo microscope	Leica	10450826
Peltier-cooled incubator including 2 shelves with light module cold white	Memmert	IPP110ecoplus, T8	Equipped with day/night cycle
Dimethyl Sulfoxide	Biochem Chemopharma	504341000	To prepare a 1% solution in E3
Calcium chlorided dihydrate	Biochem Chemopharma	303080500	To prepare E3
Magnesium sulfate heptahydrate	Biochem Chemopharma	313060500	To prepare E3
Potassium Chloride	Biochem Chemopharma	316030500	To prepare E3
SCREEN-WELL Wnt Pathway library (Bosutinib)	Enzo	BML-2838-0500
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S/3161/53	To prepare E3