Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يعد القياس الدقيق للسالمونيلا في الدواجن عند المستويات المنخفضة تحديا صناعيا وتنظيميا حاليا. يصف هذا البروتوكول اختبار MPN الذي يتيح القياس الكمي للسالمونيلا في منتجات الدواجن النيئة والجاهزة للطهي. هذه الطريقة سريعة وحساسة وتتوافق مع إرشادات FSIS ، وتعزز سلامة الأغذية وتدعم جهود الصحة العامة.

Abstract

السالمونيلا هي سبب رئيسي للأمراض المنقولة بالغذاء في الولايات المتحدة ، لا سيما في منتجات الدواجن. تركز الطرق التقليدية للكشف عن السالمونيلا على الانتشار بدلا من القياس الكمي ، مما يحد من فائدتها في تقييم مستويات التلوث ومخاطره. تقدم هذه الدراسة مقايسة جديدة للرقم الأكثر احتمالا (MPN) مصممة لتحديد كمية السالمونيلا في منتجات الدواجن الجاهزة للطهي ، مثل كوردون بلو الدجاج. تتضمن الطريقة غسل عينة الدواجن ، وتركيز الشطف من خلال الطرد المركزي ، وتخفيفها بشكل متسلسل في كتلة 48 بئرا. تم دمج مقايسة MPN مع طريقة التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) لتوفير تقدير كمي حساس ودقيق وسريع لتلوث السالمونيلا في نفس الإطار الزمني مثل بروتوكولات خدمة سلامة الأغذية والتفتيش (FSIS) الحالية. أظهرت النتائج وجود ارتباط خطي قوي بين قياسات MPN-LAMP ومستويات التلقيح النظرية (R² = 0.933). ومع ذلك ، فإن التباين عند التركيزات المنخفضة يسلط الضوء على التحديات في الكشف الدقيق عن السالمونيلا عند هذه المستويات ، مع الحد الأدنى العملي للكشف المقدر بحوالي 300 CFU / g. تشمل التحسينات المحتملة لتحسين قابلية تطبيق البروتوكول زيادة الكمية المأخوذة من العينات لتحسين حد الكشف ، وتحسين تركيبات وسائط التخصيب ، وتوسيع الكشف الجزيئي لاستهداف العديد من مصلات السالمونيلا . بشكل عام ، تقدم هذه الدراسة أداة عملية لصناعة الأغذية ، مما يتيح القياس الكمي الموثوق به لتلوث السالمونيلا في منتجات الدواجن ، مما يساهم في تحسين سلامة الأغذية والصحة العامة.

Introduction

باعتبارها سببا رئيسيا للأمراض المنقولة بالغذاء والاستشفاء والوفاة في الولايات المتحدة ، فإن السالمونيلا لها تأثير كبير على الصحة العامة والاقتصاد. بلغ العبء الاقتصادي المقدر لمسببات الأمراض في عام 2013 وحده 3.67 مليار دولار1. على الرغم من أن المبادرات التنظيمية الأخيرة تهدف إلى الحد من داء السلمونيلات بنسبة 25٪ بحلول عام 20302 ، إلا أن الفجوات في استراتيجيات الكشف والتخفيف الحالية لا تزال واضحة ، لا سيما في مواءمة ترصد مصانع المعالجة مع نتائج الصحة العامة3 .

وتشكل منتجات الدواجن المجمدة الجاهزة للطهي، والتي تورطت في تفشي السالمونيلا المتعددة، مصدر قلق كبير للصحة العامة. ردا على ذلك ، صنفت خدمة سلامة الأغذية والتفتيش (FSIS) السالمونيلا على أنها مادة مغشوشة في هذه المنتجات. حاليا ، يركز دليل مختبر علم الأحياء الدقيقة FSIS (MLG) 4.15 فقط على تحديد انتشار السالمونيلا في منتجات الدواجن4. بموجب هذا المبدأ التوجيهي ، يتم إثراء العينات التي تم جمعها لمدة 18-24 ساعة ثم يتم فحصها باستخدام نظام الكشف الجزيئي (MDS) ، الذي يحدد وجود أو عدم وجود السالمونيلا ولكنه لا يقدم نظرة ثاقبة لمستوى التلوث. في حين أن هذا النهج ذو قيمة للكشف عن وجود مسببات الأمراض ، إلا أنه يفشل في توفير معلومات كمية يمكن أن تساعد معالجي الأغذية على تقييم مخاطر التلوث بشكل أكثر دقة واتخاذ إجراءات تصحيحية مستهدفة.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقة لزيادة الكشف من انتشار مسببات الأمراض الميكروبية إلى القياس الكمي. تم تصميمه للتكامل السلس في العمليات الحالية للكشف عن السالمونيلا في منتجات الدواجن مع الحد الأدنى من التعطيل لبروتوكولات FSIS الحالية. بدلا من مجرد إثراء العينة السائبة ، تبدأ الطريقة بغسل منتجات الدواجن باستخدام وسائط تتفق مع طرق FSIS الحالية. ثم يتم توزيع الشطف في العمود الأول من كتلة بئر بعمق 48. يتم إجراء التخفيفات التسلسلية عبر الأعمدة الخمسة المتبقية ، ويتم احتضان الكتلة لمدة 18-24 ساعة ، بما يتماشى مع بروتوكول MLG 4.15. بعد الحضانة ، يتم اختبار الآبار بحثا عن السالمونيلا ، وتستخدم النتائج لحساب الرقم الأكثر احتمالا (MPN) 5،6. يسمح هذا النهج بتحديد كمية التلوث في نفس الإطار الزمني لعملية FSIS الحالية ، مما يجعله خيارا عمليا للاستخدام الصناعي والتنظيمي على حد سواء. يوضح الشكل 1 مخططا كتليا يلخص مقايسة MPN المعدلة. يتضمن الشكل صورا تم التقاطها بخطوات محددة ، والكتلة المكونة من 48 بئرا المستخدمة في تخفيف ونمو التكرارات ، والتقنيات الثلاث المستخدمة كمقاييس لتقييم العدد الأكثر احتمالا من السالمونيلا الموجودة في الدجاج المفروم. في المرحلة الأولى من هذه الدراسة ، استخدمنا الدجاج المفروم المشع لتقليل تأثير البكتيريا الدقيقة في الخلفية وعدم اليقين في القياسات المتعلقة باللقاح الذي تم التحقق منه قبل تطبيق البروتوكول على عينات الدجاج غير المشععة.

Protocol

ملاحظة: يجب إجراء جميع الأعمال المرتبطة بهذا البروتوكول داخل مختبر السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL-2). عند الاقتضاء ، يجب إجراء هذا البروتوكول داخل خزانة السلامة البيولوجية (BSC) للحفاظ على الظروف المعقمة وتقليل مخاطر تلوث العينة أو تعرض المشغل لمسببات الأمراض الميكروبية. عند نقل العينات خارج BSC ، استخدم حاويات محكمة الغلق للحفاظ على سلامة العينة ومنع الانسكاب في حالة السقوط العرضي. يفضل استخدام المكونات التي تستخدم لمرة واحدة طوال الإجراء للتخفيف من احتمالية التلوث المتبادل. في الحالات التي لا تكون فيها المستهلكات ممكنة ، تأكد من أن جميع المعدات والمواد معقمة قبل الاستخدام. الإدارة السليمة للنفايات أمر بالغ الأهمية. يجب التخلص من جميع المكونات المستخدمة التي تستخدم لمرة واحدة كنفايات بيولوجية. الأوتوكلاف المواد القابلة لإعادة الاستخدام قبل إعادة استخدامها لضمان التعقيم المناسب واحتواء المواد التي يحتمل أن تكون خطرة. لا يؤدي الالتزام بهذه الاحتياطات إلى حماية سلامة العينة فحسب ، بل يقلل أيضا من مخاطر تعرض المشغل لمسببات الأمراض الميكروبية.

1. تحضير عينات اللحوم

  1. الحصول على عينات اللحوم ومعالجتها
    1. لحم طازج
      1. احصل على الدجاج المفروم من قسم اللحوم الطازجة لتجار التجزئة المحليين. انقل جميع العينات إلى التخزين عند 4 درجات مئوية وقم بمعالجتها في غضون 24 ساعة بعد الاستلام. قسم اللحم بشكل معقم إلى عينات 25 جم.
      2. ختم الفراغ وإشعاع العينة. هنا ، قام مركز تكساس إيه آند إم AgriLife الوطني لأبحاث شعاع الإلكترون بتشعيع اللحوم المعرضة لجرعة ~ 25 كيلو جراي.
        ملاحظة: بينما تم استخدام التشعيع كإجراء للتحكم في هذه الدراسة لضمان القضاء على البكتيريا الدقيقة في الخلفية ، إلا أنه ليس شرطا مسبقا للبروتوكول في التطبيقات العملية كما هو موضح في المنتجات الجاهزة للطهي غير المشعة المستخدمة في القسم التالي. وفي السياقات الميدانية، يمكن للطرق البديلة مثل الوسائط الانتقائية أو خصوصية التشخيص الجزيئي أن تعالج التداخل المحتمل من الكائنات الحية الدقيقة غير المستهدفة.
    2. منتجات الدجاج الجاهزة للطهي
      1. احصل على منتجات الدجاج الجاهزة للطهي من قسم الأطعمة المجمدة لتجار التجزئة المحليين. تقسم بشكل معقم إلى عينات 25 جم.
      2. اجمع عينات من وسط القطع الفردية للتأكد من تضمين جميع المكونات (مثل الخبز والجبن).
  2. إعداد وسائل الإعلام
    1. تحضير ماء الببتون المخزن (BPW) عن طريق إذابة 25 جم من مسحوق BPW في 1 لتر من H2O نقي.
    2. تحضير لوحات تسريب القلب في الدماغ (BHI). للقيام بذلك ، قم بإذابة 37 جم من مسحوق BHI في 1 لتر من H2O النانوي وأضف 15 جم من الأجار إلى محلول BHI. تعقيم جميع الوسائط عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. صب 20 إلى 25 مل من الوسائط في أطباق بتري بغطاء شفاف (100 مم × 15 مم).
      ملاحظة: من الأفضل صب الألواح داخل خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على الظروف المعقمة.

2. زراعة الخلايا

  1. قم بإعداد المزرعة الأولية عن طريق وضع خط السالمونيلا المعوية المصلية Typhimurium ATCC 14028 على صفيحة أجار BHI واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  2. قم بإعداد المزارع الليلية عن طريق تلقيح 25 مل من مرق BHI بمستعمرة واحدة من السالمونيلا المزروعة حديثا. تنمو الثقافات الهوائية بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة.

3. تلقيح عينات الدواجن

  1. تخفيف الثقافة والطلاء
    1. إعداد سلسلة من التخفيفات بمقدار 10 أضعاف للاستزراع الليلي في BPW لتحقيق تركيزات نهائية تبلغ حوالي 1 × 108 إلى 1 × 101 CFU/mL. افترض أن تركيز ثقافة السالمونيلا بين عشية وضحاها هو 1 × 109 CFU / مل.
    2. انقل 0.5 مل من المزرعة الليلية إلى 4.5 مل من BPW ، واخلطها ، ثم انقل 0.5 مل من التخفيف إلى 4.5 مل من BPW لكل تخفيف إضافي.
      1. انشر 10 ميكرولتر من تخفيف 1 × 103 CFU / مل على صفيحة أجار BHI في ثلاث نسخ لتعداد الخلايا لحساب تركيز المزرعة الليلية.
  2. تلقيح عينات اللحوم
    1. انقل 25 جراما من الدجاج المفروم المشع بشكل معقم إلى كيس معقم في نسختين. يبلغ حجم الحقيبة 7.5 × 12 بوصة وتحمل علامة 1.63 لتر. تحتوي الحقيبة على قسم مرشح بقطر ثقب 330 ميكرومتر ، ويوجد 285 لكل سم مربع.
    2. تلقيح كل عينة ب 1 مل من تخفيف التركيز المستهدف. على سبيل المثال ، أضف 1 مل من المزرعة من تخفيف 1 × 10 درجة CFU / مل لتحقيق مستوى من التلوث يبلغ حوالي 1,000 خلية / 25 جم دجاج. قم بتوزيع اللقاح السائل برفق على سطح عينات الدجاج باستخدام موزع خلية معقم واتركه يقف لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
    3. قم بإعداد عينات تحكم سلبية عن طريق إضافة 1 مل من BPW المعقم.

4. معالجة العينة

  1. أضف 225 مل من BPW إلى كل عينة. تم اختيار نسبة الحجم إلى الوسائط لتتماشى مع FSIS MLG 4.154.
  2. قم بتجانس العينات باستخدام Stomacher7 بالسرعة العادية ومدة 120 ثانية.
  3. الطرد المركزي وإعادة التعليق
    1. قم بإزالة السائل بعناية من الجانب المصفى من الكيس باستخدام ماصة سعة 50 مل. قسم السائل إلى زجاجتين معقمتين للطرد المركزي.
    2. قم بموازنة الزجاجات باستخدام BPW المعقم لضمان أوزان متساوية. الطرد المركزي للعينات عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من مرق BPW باستخدام ملعقة معقمة.
    3. أضف 27 مل إضافيا من مرق BPW واخلطه جيدا عن طريق التقليب باستخدام ملعقة. اجمع محتويات زجاجتي الطرد المركزي في زجاجة واحدة لكل عينة.

5. إعداد كتلة MPN

ملاحظة: يصور الجدول 1 مخططا للتخفيفات في كتلة مكونة من 48 بئرا.

  1. أضف 3 مل من العينة المعلقة إلى كل بئر في العمود 1 من الكتلة المكونة من 48 بئرا (8 مكررات).
  2. قم بإعداد سلسلة من التخفيفات بمقدار 10 أضعاف عبر الأعمدة من 1 إلى 6 داخل الكتلة باستخدام ماصة ثماني القنوات.
  3. أضف 0.3 مل من العينة إلى 2.7 مل من ماصة BPW للخلط. كرر لكل تخفيف. احتضان الكتل بين عشية وضحاها (~ 18 ساعة) عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند ~ 100 دورة في الدقيقة.

6. الطلاء والتعداد

  1. تعداد لوحة الإسقاط المعدلة
    1. صفيحة 7 ميكرولتر من العينة المزروعة بين عشية وضحاها من كل مخفف في شبكة 4 × 6 على صفيحة أجار باستخدام ماصة متعددة القنوات (الشكل 2). إن استخدام شبكة 4 × 6 على لوحين يستوعب 8 عينات بشكل أفضل ، على عكس الشبكة النموذجية 6 × 6 من القطرات8.
    2. اترك الأطباق تجف في الهواء لمدة 10 دقائق قبل الحضانة. احتضان ألواح الأجار بين عشية وضحاها (~ 18-24 ساعة) عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، احسب عدد المستعمرات في كل لوحة.

7. الكشف عن qPCR للسالمونيلا

  1. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة تجارية
    1. امزج الثقافات في كتلة 48 بئرا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. ماصة 200 ميكرولتر من كل مزرعة في لوحة PCR سعة 96 بئر.
    2. قم بإغلاق اللوحة ثم طردها بجهاز الطرد المركزي عند 6,600 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 20 ميكرولتر من كاشف المجموعة إلى الحبيبات.
    3. أعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. أغلق الطبق وسخنه عند 99 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، متبوعا بالتبريد إلى 20 درجة مئوية.
    4. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 6,600 × جم لمدة 10 دقائق. استخدم 2 ميكرولتر من المادة الطافية لتحليل qPCR.
  2. إعداد اللوحة
    1. تحضير خليط تفاعل qPCR وفقا للبروتوكولالمعمول به 9 على النحو التالي: 10 ميكرولتر من 2x Master Mix ؛ 0.4 ميكرولتر من كل برايمر ومسبار (حل عمل 10 ميكرومتر): invA إلى الأمام: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAGG-3 '، invA عكس الحمل: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3' ، مسبار invA: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3 'المسمى بصبغة الفلورين Cal Fluor Orange 560 ؛ 0.2 ميكرولتر من قالب التحكم في التضخيم الداخلي (IAC) (6 × 104 نسخ/ميكرولتر)9؛ 0.4 ميكرولتر من كل برايمر ومسبار IAC (10 ميكرومتر): IAC للأمام: 5'-GGCGCCCTACTACACCT-3' ، عكس IAC: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTTA-3 '، مسبار IAC: 5'-TTACAACGGGAAGAAGACAATGCCACCA-3' الموسوم بصبغة TAMRA. اضبط مستوى الصوت باستخدام ddH2O إلى 20 ميكرولتر إجمالا.
    2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي مع ظروف التدوير التالية9: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (التمسخ الأولي للحمض النووي وتنشيط البوليميراز الساخن ، 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، استخدم إعدادات Ct الافتراضية لتصدير النتائج للتحليل.

8. الكشف باستخدام اختبار 3M MDS

  1. اتبع بروتوكول مجموعة فحص الكشف الجزيئي للسالمونيلا . امزج الثقافات في كتلة 48 بئرا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل عدة مرات. الماصة 20 ميكرولتر من كل عينة في أنبوب التحلل المقدم من المجموعة.
  2. سخني العينات على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. سوف يتحول الحل من اللون الوردي إلى الأصفر. احتضان العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. سيتغير الحل من الأصفر إلى الوردي.
  3. انقل 20 ميكرولتر من المحللة إلى أنبوب كاشف وقم بتحميل أنابيب الكاشف في الحامل.
  4. أضف الحامل إلى أداة MDS وقم بتكوين البرنامج لتوصيل المعلومات حول المجموعة والعينة. تتطلب الأداة تسمية كل بئر برقم الدفعة للفحص واسم العينة. قم بتشغيل برنامج MDS وتصدير التقرير.

9. تحليل البيانات

  1. تصنيف النتائج الإيجابية والسلبية.
    1. بالنسبة للطلاء بالقطرات 4 × 6 ، قم بتقييم البقع الموجودة على ألواح الأجار التي تحتوي على مستعمرة واحدة على الأقل على أنها إيجابية والبقع على ألواح الأجار التي لا يوجد بها نمو على أنها سلبية.
    2. بالنسبة إلى qPCR ، قم بتقييم الآبار التي تحتوي على CT أقل من أو يساوي 30 على أنها إيجابية والآبار التي تحتوي على CT أكبر من 30 على أنها سالبة.
    3. بالنسبة لمتلازمات خلل التنسج النقوي، استخدم النتائج المستمدة من نظام متلازمات خلل التنسج النقوي التي تم الإبلاغ عنها على أنها إيجابية أو سلبية.
  2. حساب MPN
    1. قم بتحليل الإيجابيات والسلبيات المشروحة باستخدام طريقة دقة الاحتمالية القصوى البسيطة (SMPR) الموضحة سابقا6 أو حاسبات MPN البديلة التي تم التحقق منها. 10

النتائج

اللحوم المشعة
في تحليل الانحدار ، يشير ميل 1 إلى أنه مقابل كل زيادة في الوحدة في المتغير المستقل (المحور x) ، يزداد المتغير التابع (المحور y) بمقدار وحدة واحدة بالضبط. يشير هذا إلى وجود علاقة تناسبية بين المتغيرين ، مما يعني أن التغيير في المتغير التابع يعكس التغي...

Discussion

أهمية البروتوكول
لا تزال السالمونيلا مصدر قلق كبير في سلامة الأغذية ، لا سيما في منتجات الدواجن ، والتي غالبا ما تكون متورطة في تفشي الأمراض المنقولة بالغذاء13،14. كسبب رئيسي للأمراض البكتيرية المنقولة بالغذاء في الولايات ...

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ، وخدمة البحوث الزراعية (USDA-ARS) ، والبرنامج الوطني 108 ، وأرقام نظام معلومات البحث الحالي 8072-42000-093-000-D و 8072-42000-094-000-D. ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المقالة هو فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من قبل وزارة الزراعة الأمريكية. وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود وصاحب عمل لتكافؤ الفرص.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
48 deep well block 4.6mlFisher Scientific International, IncNC1964628
Agar - Solidifying Agent (Difco)Becton, Dickinson and Company (BD)281230
Analytical BalanceMettler ToledoJL602-G/LEquipment 
Analytical BalanceMettler ToledoAB54-SEquipment 
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam SterilizerSteris plcLV-250Equipment 
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+Labconco Corporation302411101Equipment 
Brain Heart Infusion (BHI) BrothBecton, Dickinson and Company (BD)237500
Buffered Peptone WaterBio-Rad Laboratories Inc.3564684
Cell Spreader - L-shapedVWR76208-438
Centrifuge Microcentrifuge 5424Eppendorf5424Equipment
Centrifuge, Avanti J-25Beckman Coulter, Inc. Equipment
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent Thermo Fisher Scientific Inc. 4318930
Ground Chicken Local retailers
IAC forward  primer: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'Integrated DNA Technologies 
IAC probe: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC
CACCA-3' labeled with 5' TAMRA/3' BHQ-2		Biosearch Technologies
IAC reverse primer: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'Integrated DNA Technologies 
Incubator - Inova 4230 incubator shakerNew Brunswick Scientific4230Equipment 
Inoculating Loop - Combi Loop  10µL and 1µL Fisher Scientific International, Inc22-363-602
invA forward primer: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG
G-3'		Integrated DNA Technologies 
invA probe: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC
CTTCCTC-3' labeled with 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1		Biosearch Technologies
invA reverse primer: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'Integrated DNA Technologies 
Irradiation TreatmentTexas A&M Agrilife Research National Center for Electron Beam ResearchService
Luria Bertani (LB) BrothBecton, Dickinson and Company (BD)244620
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Mettler Toledo17014382Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+Mettler Toledo17014384Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+Mettler Toledo17014388Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Mettler Toledo17014391Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Mettler Toledo17014392Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Mettler Toledo17013805Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+Mettler Toledo17013803Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw CapCorning Inc.1396-1LEquipment
Media Storage Bottle -PYREX 2L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw CapCorning Inc.1397-2LEquipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34cm2, sterile, 108/csMilliporeSigmaZ707902
Mixer - Vortex Genie 2Scientific Industries Inc.SI-0236Equipment
Molecular Detection Assay 2-Salmonella kitNeogenMDA2SAL96
Molecular Detection Instrument NeogenMDS100Equipment 
Motorized pipette controller, PIPETBOY2INTEGRA Biosciences Corp.155019Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression Thermo Fisher Scientific Inc. 4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation TurntableFisher Scientific International, Inc3489E20Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)Fisher Scientific International, IncFB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8Mettler Toledo 30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10Mettler Toledo30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10Mettler Toledo30389276
Ready to cook chicken productsLocal retailers
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettorsThermo Fisher Scientific Inc. 8093-11
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, CA)2750036476Equipment
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)Thermo Fisher Scientific Inc. 170376N
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell SpreadersFisher Scientific International, Inc14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter BagsThermo Fisher Scientific Inc. 01-812
Stomacher 80 Biomaster Lab BlenderSeward30010019Equipment
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)Applied Biosystems535028293Equipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex Elga LabWaterPF2XXXXM1-USEquipment
Whirlpak bags 1.63L VWR11216-777

References

  1. Batz, M., Hoffmann, S., Morris, J. G. Disease-outcome trees, eq-5d scores, and estimated annual losses of quality-adjusted life years (qalys) for 14 foodborne pathogens in the united states. Foodborne Pathogens and Disease. 11 (5), 395-402 (2014).
  2. . The Grand Challenge: Salmonella Available from: https://tellus.ars.usda.gov/stories/articles/the-grand-challenge-salmonella (2024)
  3. National Advisory Committee on Microbiological Criteria in Foods (NACMCF). Response to questions posed by the food safety and inspection service: Enhancing Salmonella control in poultry products. J Food Prot. 82 (4), 645-668 (2019).
  4. Food Safety and Inspection Service. . 4.15 Isolation and identification of Salmonella from meat, poultry, pasteurized egg, siluriformes (Fish) products and carcass and environmental sponges. , (2024).
  5. Irwin, P., Reed, S., Brewster, J., Nguyen, L., He, Y. P. Non-stochastic sampling error in quantal analyses for campylobacter species on poultry products. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (7), 2353-2369 (2013).
  6. Irwin, P., Tu, S., Damert, W., Phillips, J. A modified gauss-newton algorithm and ninety-six well micro-technique for calculating mpn using excel spreadsheets. Journal of Rapid Methods & Automation in Microbiology. 8 (3), 171-191 (2000).
  7. Ravishankar, S., Ahmed, E. Y., Carlstrom, C. Food microbiology: A laboratory manual. Food Microbiology. 21, 489 (2004).
  8. Chen, C. Y., Nace, G. W., Irwin, P. L. A 6 x 6 drop plate method for simultaneous colony counting and mpn enumeration of campylobacter jejuni, listeria monocytogenes, and escherichia coli. J Microbiol Methods. 55 (2), 475-479 (2003).
  9. Suo, B., He, Y., Tu, S. I., Shi, X. A multiplex real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of salmonella spp., escherichia coli o157, and listeria monocytogenes in meat products. Foodborne Pathogens and Disease. 7 (6), 619-628 (2010).
  10. Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. J Appl Microbiol. 109 (5), 1660-1667 (2010).
  11. Stevens, R., Poppe, K. Validation of clinical prediction models: What does the "calibration slope" really measure. Journal of Clinical Epidemiology. 118, (2019).
  12. Miller, M. E., Hui, S. L., Tierney, W. M. Validation techniques for logistic regression models. Statistics in Medicine. 10 (8), 1213-1226 (1991).
  13. Galán-Relaño, &. #. 1. 9. 3. ;., et al. Salmonella and salmonellosis: An update on public health implications and control strategies. Animals. 13 (23), 3666 (2023).
  14. Gorski, L., et al. Growth assessment of salmonella enterica multi-serovar populations in poultry rinsates with commonly used enrichment and plating media. Food Microbiology. 119, 104431 (2024).
  15. Schmidt, J. W., et al. Evaluation of methods for identifying poultry wing rinses with salmonella concentrations greater than or equal to 10 cfu/ml. J Food Prot. 87 (11), 100362 (2024).
  16. Gorski, A., Liang, L. S. Effect of enrichment medium on real-time detection of salmonella enterica from lettuce and tomato enrichment cultures. Journal of Food Protection. 73 (6), 1047-1056 (2010).
  17. Guillén, S., Nadal, L., Álvarez, I., Mañas, P., Cebrián, G. Impact of the resistance responses to stress conditions encountered in food and food processing environments on the virulence and growth fitness of non-typhoidal salmonellae. Foods. 10 (3), 617 (2021).
  18. Rohde, A., Hammerl, J. A., Appel, B., Dieckmann, R., Al Dahouk, S. Sampling and homogenization strategies significantly influence the detection of foodborne pathogens in meat. BioMed Research International. 2015, (2015).
  19. Wang, D., Wang, Z., He, F., Kinchla, A. J., Nugen, S. R. Enzymatic digestion for improved bacteria separation from leafy green vegetables. Journal of Food Protection. 79 (8), 1378-1386 (2016).
  20. Pitard, F. F. . Theory of sampling and sampling practice. , (2019).
  21. Sharpe, A. . in Detecting pathogens in food. , 52-68 (2003).
  22. Hannah, J., et al. Effect of stomaching on numbers of bacteria recovered from chicken skin. Poultry Science. 90 (2), 491-493 (2011).
  23. Mcmeekin, T., Thomas, C. Retention of bacteria on chicken skin after immersion in bacterial suspensions. Journal of Applied Bacteriology. 45 (3), 383-387 (1978).
  24. Rodrigues-Szulc, U., Ventoura, G., Mackey, B., Payne, M. Rapid physicochemical detachment, separation and concentration of bacteria from beef surfaces. Journal of Applied Bacteriology. 80 (6), 673-681 (1996).
  25. Vibbert, H. B., et al. Accelerating sample preparation through enzyme-assisted microfiltration of salmonella in chicken extract. Biotechnol Prog. 31 (6), 1551-1562 (2015).
  26. Armstrong, C. M., et al. Use of a commercial tissue dissociation system to detect salmonella-contaminated poultry products. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 416 (3), 621-626 (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MPN LAMP FSIS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved