Dosaggio del numero più probabile modificato per quantificare la salmonella nei prodotti a base di pollo crudo e pronto da cuocere

Riepilogo

Quantificare con precisione la Salmonella nel pollame a bassi livelli è una sfida industriale e normativa attuale. Questo protocollo descrive un test MPN che consente la quantificazione della Salmonella nei prodotti avicoli crudi e pronti per la cottura. Questo metodo è veloce, sensibile e si allinea con le linee guida FSIS, migliorando la sicurezza alimentare e sostenendo gli sforzi per la salute pubblica.

Abstract

La salmonella è una delle principali cause di malattie di origine alimentare negli Stati Uniti, in particolare nei prodotti a base di pollame. I metodi tradizionali per rilevare la Salmonella si concentrano sulla prevalenza piuttosto che sulla quantificazione, il che limita la loro utilità nella valutazione dei livelli di contaminazione e dei rischi. Questo studio introduce un nuovo test del numero più probabile (MPN) progettato per quantificare la Salmonella nei prodotti avicoli pronti da cuocere, come il cordon bleu di pollo. Il metodo prevede il lavaggio del campione di pollame, la concentrazione del risciacquo attraverso la centrifugazione e la diluizione in serie in un blocco di 48 pozzetti. Il test MPN è integrato con il metodo di amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) per fornire una quantificazione sensibile, accurata e rapida della contaminazione da Salmonella entro lo stesso periodo di tempo dei protocolli FSIS (Food Safety and Inspection Service) esistenti. I risultati mostrano una forte correlazione lineare tra le misurazioni MPN-LAMP e i livelli teorici di inoculazione (R² = 0,933). Tuttavia, la variabilità a concentrazioni più basse evidenzia le sfide per rilevare con precisione la Salmonella a questi livelli, con il limite inferiore di rilevabilità pratico stimato a circa 300 CFU/g. I potenziali perfezionamenti per migliorare l'applicabilità del protocollo includono l'aumento della quantità campionata per migliorare ulteriormente il limite di rilevamento, l'ottimizzazione delle formulazioni dei terreni di arricchimento e l'espansione del rilevamento molecolare per mirare a più sierotipi di Salmonella . Nel complesso, questo studio rappresenta uno strumento pratico per l'industria alimentare, che consente una quantificazione affidabile della contaminazione da Salmonella nei prodotti avicoli, contribuendo a migliorare la sicurezza alimentare e la salute pubblica.

Introduzione

Come principale causa di malattie di origine alimentare, ospedalizzazione e morte negli Stati Uniti, la Salmonella ha un impatto significativo sulla salute pubblica e sull'economia. L'onere economico stimato dell'agente patogeno nel solo 2013 è stato di 3,67 miliardi di^dollari1. Sebbene le recenti iniziative normative mirino a ridurre la salmonellosi del 25 % entro il 2030^{2 ,} rimangono evidenti le lacune nelle attuali strategie di rilevamento e mitigazione, in particolare per quanto riguarda l'allineamento della sorveglianza degli impianti di lavorazione con i risultati in materia di salute pubblica³ .

I prodotti avicoli surgelati pronti per la cottura, che sono stati implicati in molteplici focolai di Salmonella , sono una preoccupazione significativa per la salute pubblica. In risposta, il Food Safety and Inspection Service (FSIS) ha classificato la Salmonella come adulterante in questi prodotti. Attualmente, la FSIS Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 4.15 si concentra esclusivamente sulla determinazione della prevalenza di Salmonella nei prodotti avicoli⁴. In base a questa linea guida, i campioni raccolti vengono arricchiti per 18-24 ore e quindi sottoposti a screening utilizzando il sistema di rilevamento molecolare (MDS), che identifica la presenza o l'assenza di Salmonella ma non fornisce informazioni sul livello di contaminazione. Sebbene questo approccio sia prezioso per rilevare la presenza di agenti patogeni, non riesce a fornire informazioni quantitative che potrebbero aiutare le aziende di trasformazione alimentare a valutare i rischi di contaminazione in modo più accurato e ad adottare azioni correttive mirate.

In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo per aumentare il rilevamento dalla prevalenza alla quantificazione dei patogeni microbici. È stato progettato per una perfetta integrazione nei processi esistenti per rilevare la Salmonella nei prodotti avicoli con un'interruzione minima degli attuali protocolli FSIS. Invece di arricchire semplicemente il campione di massa, il metodo inizia lavando i prodotti avicoli utilizzando terreni coerenti con gli attuali metodi FSIS. Il risciacquo viene quindi distribuito nella prima colonna di un blocco di pozzi profondo 48 pezzi. Le diluizioni seriali vengono eseguite sulle restanti cinque colonne e il blocco viene incubato per 18-24 ore, allineandosi con il protocollo MLG 4.15. Dopo l'incubazione, i pozzetti vengono testati per la presenza di Salmonella e i risultati vengono utilizzati per calcolare il numero più probabile (MPN)^5,6. Questo approccio consente di quantificare la contaminazione nello stesso lasso di tempo dell'attuale processo FSIS, rendendolo un'opzione pratica sia per l'industria che per l'uso normativo. La Figura 1 illustra un diagramma a blocchi che riassume il test MPN modificato. La figura include le fotografie scattate in fasi specifiche, il blocco di 48 pozzetti utilizzato per la diluizione e la crescita delle repliche e le tre tecniche utilizzate come parametri di riferimento per valutare il numero più probabile di Salmonella presente nel pollo macinato. Nella prima fase di questo studio, abbiamo utilizzato pollo macinato irradiato per ridurre al minimo l'impatto della microflora di fondo e l'incertezza delle misurazioni relative all'inoculo verificato prima di applicare il protocollo a campioni di pollo non irradiati.

Protocollo

NOTA: Tutto il lavoro associato a questo protocollo deve essere condotto all'interno di un laboratorio di biosicurezza di livello 2 (BSL-2). Se del caso, questo protocollo deve essere condotto all'interno di una cabina di sicurezza biologica (BSC) per mantenere le condizioni asettiche e ridurre al minimo il rischio di contaminazione del campione o l'esposizione dell'operatore a patogeni microbici. Quando si trasferiscono i campioni al di fuori del BSC, utilizzare contenitori sigillati per mantenere l'integrità del campione ed evitare fuoriuscite in caso di cadute accidentali. Preferibilmente, i componenti monouso dovrebbero essere utilizzati durante tutta la procedura per mitigare la possibilità di contaminazione incrociata. Nei casi in cui i prodotti monouso non siano fattibili, assicurarsi che tutte le attrezzature e i materiali siano sterili prima dell'uso. Una corretta gestione dei rifiuti è fondamentale; Tutti i componenti usa e getta usati devono essere smaltiti come rifiuti a rischio biologico. Autoclavare i materiali riutilizzabili prima del riutilizzo per garantire una corretta sterilizzazione e contenimento dei materiali potenzialmente pericolosi. L'osservanza di queste precauzioni non solo salvaguarda l'integrità del campione, ma riduce anche al minimo il rischio di esposizione dell'operatore a patogeni microbici.

1. Preparazione dei campioni di carne

1. Acquisizione e lavorazione di campioni di carne
   1. Carne fresca
      1. Acquista il pollo macinato dal reparto carne fresca dei rivenditori locali. Trasferire tutti i campioni in un deposito a 4 °C ed elaborarli entro 24 ore dal ricevimento. Dividere asetticamente la carne in campioni da 25 g.
      2. Sigillare sottovuoto e irradiare il campione. Qui, il Texas A&M AgriLife National Center for Electron Beam Research ha irradiato la carne sottoposta a una dose di ~25 kGy.
         NOTA: Sebbene l'irradiazione sia stata utilizzata come misura di controllo in questo studio per garantire l'eliminazione della microflora di fondo, non è un prerequisito per il protocollo nelle applicazioni pratiche, come dimostrato dai prodotti pronti da cuocere non irradiati utilizzati nella sezione successiva. In contesti di campo, metodi alternativi come i terreni selettivi o la specificità della diagnostica molecolare possono affrontare la potenziale interferenza di microrganismi non bersaglio.
   2. Prodotti a base di pollo pronti da cuocere
      1. Acquista prodotti a base di pollo pronti da cucinare dal reparto surgelati dei rivenditori locali. Dividere asetticamente in campioni da 25 g.
      2. Raccogli i campioni dal centro dei singoli pezzi per assicurarti che tutti gli ingredienti (ad esempio, panatura e formaggio) siano inclusi.
2. Preparazione dei terreni
   1. Preparare l'acqua peptonica tamponata (BPW) sciogliendo 25 g di polvere di BPW in 1 L di nanopuro H₂O.
   2. Preparare le piastre per infusione cerebrale e cardiaca (BHI). Per fare ciò, sciogliere 37 g di polvere di BHI in 1 L di nanopure H₂O e aggiungere 15 g di agar nella soluzione di BHI. Sterilizzare tutti i terreni in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Versare da 20 a 25 mL di terreno in piastre di Petri con coperchio trasparente (100 mm x 15 mm).
      NOTA: È meglio versare le piastre all'interno di una cabina di sicurezza biologica per mantenere le condizioni asettiche.

2. Coltura cellulare

1. Preparare la coltura iniziale strisciando il sierotipo di Salmonella enterica Typhimurium ATCC 14028 su una piastra di agar BHI e incubare a 37 °C per una notte.
2. Preparare le colture durante la notte inoculando 25 ml di brodo BHI con una colonia di Salmonella appena cresciuta. Colture a crescita aerobica durante la notte a 37 °C con agitazione a 100 giri/min.

3. Inoculazione di campioni di pollame

1. Diluizione e placcatura della coltura
   1. Preparare una serie di diluizioni di 10 volte della coltura notturna in BPW per ottenere concentrazioni finali di circa 1 x 10⁸ a 1 x 10¹ CFU/mL. Si supponga che la concentrazione della coltura notturna di Salmonella sia di 1 x 10⁹ CFU/mL.
   2. Trasferire 0,5 mL della coltura notturna in 4,5 mL di BPW, mescolare, quindi trasferire 0,5 mL della diluizione in 4,5 mL di BPW per ogni diluizione aggiuntiva.
      1. Distribuire 10 μL della diluizione 1 x 10³ CFU/mL su una piastra di agar BHI in triplicato per l'enumerazione delle cellule per calcolare la concentrazione della coltura durante la notte.
2. Inoculazione di campioni di carne
   1. Trasferire asetticamente 25 g di pollo macinato irradiato in una sacca sterile per lo stomaco in duplicato. La borsa misura 7,5 x 12 pollici ed è etichettata come 1,63 L. Il sacchetto contiene una partizione filtrante con un diametro del foro di 330 μm e ce ne sono 285 per cm quadrato.
   2. Inoculare ogni campione con 1 mL della diluizione della concentrazione target. Ad esempio, aggiungere 1 mL di coltura dalla diluizione di 1 x 10³ CFU/mL per ottenere un livello di contaminazione di circa 1.000 cellule/25 g di pollo. Distribuire delicatamente l'inoculo liquido sulla superficie dei campioni di pollo utilizzando un divaricatore di cellule sterili e lasciarlo riposare per 1 ora a 4 °C.
   3. Preparare i campioni di controllo negativi aggiungendo 1 mL di BPW sterile.

4. Elaborazione del campione

1. Aggiungere 225 mL di BPW a ciascun campione. Il rapporto tra volume e media è stato selezionato per allinearsi a FSIS MLG 4.15⁴.
2. Omogeneizzare i campioni utilizzando lo Stomacher⁷ a velocità normale e una durata di 120 s.
3. Centrifugazione e risospensione
   1. Rimuovere con cautela il liquido dal lato filtrato della sacca utilizzando una pipetta da 50 ml. Dividere il liquido in due flaconi da centrifuga sterili.
   2. Bilanciare le bottiglie con BPW sterile per garantire pesi uguali. Centrifugare i campioni a 10.000 x g per 10 minuti. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 3 mL di brodo BPW con una spatola sterile.
   3. Aggiungere altri 27 ml di brodo BPW e mescolare accuratamente mescolando con una spatola. Combinare il contenuto di entrambi i flaconi da centrifuga in un flacone per ogni campione.

5. Configurazione del blocco MPN

NOTA: La Tabella 1 illustra uno schema delle diluizioni in un blocco di 48 pozzetti.

1. Aggiungere 3 mL del campione risospeso a ciascun pozzetto nella colonna 1 del blocco da 48 pozzetti (8 repliche).
2. Preparare una serie di diluizioni di 10 volte sulle colonne 1-6 all'interno del blocco utilizzando una pipetta a otto canali.
3. Aggiungere 0,3 mL di campione in 2,7 mL di pipetta BPW per miscelare. Ripetere per ogni diluizione. Incubare i blocchi per una notte (~18 h) a 37 °C con agitazione a ~100 giri/min.

6. Impiattamento ed enumerazione

1. Enumerazione della piastra di caduta modificata
   1. Piastra 7 μl di campione coltivato durante la notte di ciascuna diluizione in una griglia 4 x 6 su una piastra di agar utilizzando una pipetta multicanale (Figura 2). L'utilizzo di una griglia 4 x 6 su due piastre ospita meglio 8 campioni, rispetto alla tipica griglia di goccioline 6 x 6⁸.
   2. Lasciare asciugare le piastre all'aria per 10 minuti prima dell'incubazione. Incubare le piastre di agar per una notte (~18-24 h) a 37 °C. Dopo l'incubazione, contare il numero di colonie su ogni piastra.

7. Rilevamento qPCR di Salmonella

1. Estrazione del DNA utilizzando un kit commerciale
   1. Mescolate le colture nel blocco da 48 pozzetti pipettando più volte su e giù. Pipettare 200 μl di ciascuna coltura in una piastra PCR a 96 pozzetti.
   2. Sigillare e centrifugare la piastra a 6.600 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante e aggiungere 20 μl del reagente del kit al pellet.
   3. Risospendere il pellet pipettandolo su e giù. Sigillare e riscaldare la piastra a 99 °C per 10 minuti, quindi raffreddarla a 20 °C.
   4. Centrifugare nuovamente a 6.600 x g per 10 min. Utilizzare 2 μl di surnatante per l'analisi qPCR.
2. Impostazione della piastra
   1. Preparare la miscela di reazione qPCR secondo il protocollo⁹ stabilito come segue: 10 μl di 2x Master Mix; 0,4 μL di ciascun primer e sonda (soluzione di lavoro da 10 μM): invA in avanti: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3', invA in senso inverso: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3', sonda invA: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3' marcata con il colorante fluoreni Cal Fluor Orange 560; 0,2 μl di modello di controllo dell'amplificazione interna (IAC) (6 x 10⁴ copie/μl)⁹; 0,4 μL di ciascun primer e sonda IAC (10 μM): IAC in avanti: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3', IAC in retromarcia: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3', sonda IAC: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3' marcata con colorante TAFRA. Regolare il volume con ddH₂O a 20 μL totali.
   2. Eseguire la PCR in tempo reale con le seguenti condizioni cicliche⁹: 95 °C per 10 minuti (denaturazione iniziale del DNA e attivazione della polimerasi hot-start), 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 minuto, utilizzare le impostazioni Ct predefinite per esportare i risultati per l'analisi.

8. Rilevamento mediante saggio 3M MDS

1. Seguire il protocollo del kit per il test di rilevamento molecolare Salmonella . Mescolate le colture nel blocco da 48 pozzetti pipettando più volte su e giù. Pipettare 20 μl di ciascun campione nella provetta di lisi fornita in kit.
2. Riscaldare i campioni a 100 °C per 15 minuti. La soluzione passerà dal rosa al giallo. Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente. La soluzione cambierà da gialla a rosa.
3. Trasferire 20 μl di lisato in una provetta reattiva e caricare le provette reattive nel supporto.
4. Aggiungi il supporto allo strumento MDS e configura il software per comunicare le informazioni sul kit e sul campione. Lo strumento richiede che ogni pozzetto sia etichettato con il numero di lotto per il saggio e un nome del campione. Eseguire il software MDS ed esportare il report.

9. Analisi dei dati

1. Classificazione dei risultati positivi e negativi.
   1. Per la placcatura a goccia 4 x 6, valutare come positivi i punti sulle piastre di agar con almeno 1 colonia e i punti sulle piastre di agar senza crescita come negativi.
   2. Per la qPCR, valutare i pozzetti che hanno un Ct inferiore o uguale a 30 come positivi e i pozzetti che hanno un Ct maggiore di 30 come negativi.
   3. Per MDS, utilizzare i risultati del sistema MDS, riportati come positivi o negativi.
2. Calcolo MPN
   1. Analizza positivi e negativi annotati utilizzando il metodo della risoluzione di massima probabilità semplice (SMPR) descritto in precedenza⁶ o calcolatori MPN verificati alternativi. ¹⁰

Risultati

Carne irradiata
Nell'analisi di regressione, una pendenza di 1 indica che per ogni aumento unitario della variabile indipendente (asse x), la variabile dipendente (asse y) aumenta esattamente di 1 unità. Ciò suggerisce una relazione proporzionale tra le due variabili, il che significa che la variazione della variabile dipendente rispecchia la variazione della variabile indipendente. Un'intercetta di 0 significa che quando la variabile indipendente è 0, anche la var...

Discussione

Significato del protocollo
La salmonella rimane una delle principali preoccupazioni per la sicurezza alimentare, in particolare per i prodotti avicoli, che sono spesso implicati in focolai di malattie di origine alimentare^13,14. Essendo una delle principali cause di malattie batteriche di origine alimentare negli Stati Uniti, metodi affidabili per rilevare la Salmonella nei prodotti avicoli ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 deep well block 4.6ml	Fisher Scientific International, Inc	NC1964628
Agar - Solidifying Agent (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	281230
Analytical Balance	Mettler Toledo	JL602-G/L	Equipment
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S	Equipment
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer	Steris plc	LV-250	Equipment
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+	Labconco Corporation	302411101	Equipment
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Becton, Dickinson and Company (BD)	237500
Buffered Peptone Water	Bio-Rad Laboratories Inc.	3564684
Cell Spreader - L-shaped	VWR	76208-438
Centrifuge Microcentrifuge 5424	Eppendorf	5424	Equipment
Centrifuge, Avanti J-25	Beckman Coulter, Inc.		Equipment
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	4318930
Ground Chicken	Local retailers
IAC forward  primer: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'	Integrated DNA Technologies
IAC probe: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC CACCA-3' labeled with 5' TAMRA/3' BHQ-2	Biosearch Technologies
IAC reverse primer: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'	Integrated DNA Technologies
Incubator - Inova 4230 incubator shaker	New Brunswick Scientific	4230	Equipment
Inoculating Loop - Combi Loop  10µL and 1µL	Fisher Scientific International, Inc	22-363-602
invA forward primer: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG G-3'	Integrated DNA Technologies
invA probe: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC CTTCCTC-3' labeled with 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1	Biosearch Technologies
invA reverse primer: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'	Integrated DNA Technologies
Irradiation Treatment	Texas A&M Agrilife Research National Center for Electron Beam Research		Service
Luria Bertani (LB) Broth	Becton, Dickinson and Company (BD)	244620
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Mettler Toledo	17014382	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+	Mettler Toledo	17014384	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	Mettler Toledo	17014388	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Mettler Toledo	17014391	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Mettler Toledo	17014392	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Mettler Toledo	17013805	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+	Mettler Toledo	17013803	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap	Corning Inc.	1396-1L	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap	Corning Inc.	1397-2L	Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34cm2, sterile, 108/cs	MilliporeSigma	Z707902
Mixer - Vortex Genie 2	Scientific Industries Inc.	SI-0236	Equipment
Molecular Detection Assay 2-Salmonella kit	Neogen	MDA2SAL96
Molecular Detection Instrument	Neogen	MDS100	Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2	INTEGRA Biosciences Corp.	155019	Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression	Thermo Fisher Scientific Inc.	4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable	Fisher Scientific International, Inc	3489E20	Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)	Fisher Scientific International, Inc	FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8	Mettler Toledo	30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10	Mettler Toledo	30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10	Mettler Toledo	30389276
Ready to cook chicken products	Local retailers
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors	Thermo Fisher Scientific Inc.	8093-11
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system	(Applied Biosystems, Foster City, CA)	2750036476	Equipment
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170376N
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders	Fisher Scientific International, Inc	14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags	Thermo Fisher Scientific Inc.	01-812
Stomacher 80 Biomaster Lab Blender	Seward	30010019	Equipment
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)	Applied Biosystems	535028293	Equipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex	Elga LabWater	PF2XXXXM1-US	Equipment
Whirlpak bags 1.63L	VWR	11216-777