改良的最可能数量测定法，用于定量生鸡肉和即食鸡肉产品中的沙门氏菌

摘要

准确定量家禽中低浓度 的沙门氏菌 是当前的工业和监管挑战。该方案描述了一种 MPN 测定法，能够定量生家禽和即食家禽产品中的 沙门氏菌 。这种方法快速、灵敏，并且符合 FSIS 指南，从而提高了食品安全并支持公共卫生工作。

摘要

沙门氏菌 是美国食源性疾病的主要原因，尤其是在家禽产品中。检测 沙门氏菌 的传统方法侧重于流行率而不是量化，这限制了它们在评估污染水平和风险方面的实用性。本研究介绍了一种新的最可能数 （MPN） 测定法，旨在量化即食家禽产品（如蓝带鸡）中的 沙门氏菌 。该方法包括清洗家禽样品，通过离心浓缩冲洗液，然后在 48 孔模块中连续稀释。MPN 检测与环介导等温扩增 （LAMP） 方法相结合，可在与现有食品安全和检验服务 （FSIS） 方案相同的时间范围内对 沙门氏菌 污染进行灵敏、准确和快速的定量分析。结果显示 MPN-LAMP 测量值与理论接种水平之间存在很强的线性相关性 （R² = 0.933）。然而，较低浓度下的变异性凸显了准确检测这些水平沙 门氏菌 的挑战，实际检测下限估计约为 300 CFU/g。提高方案适用性的潜在改进包括增加采样量以进一步提高检测限、优化富集培养基配方以及扩大分子检测范围以靶向多种 沙门氏菌 血清型。总体而言，本研究为食品行业提供了一种实用工具，能够可靠地定量家禽产品中的 沙门氏菌 污染，有助于改善食品安全和公共卫生。

引言

沙门氏菌是美国食源性疾病、住院和死亡的主要原因，对公共卫生和经济具有重大影响。仅在 2013 年，该病原体的经济负担估计就为 36.7 亿美元¹。尽管最近的监管举措旨在到 2030 年将沙门氏菌病减少 25%²，但当前检测和缓解策略的差距仍然很明显，特别是在使加工厂监测与公共卫生结果保持一致^{方面 3} 。

与多次 沙门氏菌 疫情有关的冷冻即食家禽产品是公共卫生的一个重大问题。作为回应，食品安全和检验局 （FSIS） 将 沙门氏菌 归类为这些产品中的掺杂物。目前，FSIS 微生物学实验室指南 （MLG） 4.15 仅侧重于确定家禽产品中 沙门氏菌 的流行率⁴。根据该指南，将收集的样品富集 18-24 小时，然后使用分子检测系统 （MDS） 进行筛选，该系统可识别沙 门氏菌 的存在与否，但不能深入了解污染水平。虽然这种方法对于检测病原体的存在很有价值，但它无法提供定量信息，无法帮助食品加工商更准确地评估污染风险并采取有针对性的纠正措施。

在这项研究中，我们开发了一种方法，将检测从流行率扩展到微生物病原体的量化。它旨在无缝集成到现有流程中，以检测家禽产品中的沙门氏菌，同时最大限度地减少对当前 FSIS 协议的干扰。该方法不是简单地富集大量样品，而是首先使用与当前 FSIS 方法一致的培养基清洗家禽产品。然后将冲洗液分配到 48 深孔块的第一柱中。在其余五根柱上进行连续稀释，并将块孵育 18-24 小时，符合 MLG 4.15 方案。孵育后，对孔进行沙门氏菌检测，并将结果用于计算最可能数 （MPN）^5,6。这种方法允许在与当前 FSIS 流程相同的时间范围内对污染进行定量，使其成为行业和监管用途的实用选择。图 1 描述了总结改良 MPN 测定的框图。该图包括在特定步骤拍摄的照片、用于稀释和重复生长的 48 孔模块，以及用作评估碎鸡中最可能存在的沙门氏菌数量的基准的三种技术。在本研究的第一阶段，在将方案应用于未辐照鸡样品之前，我们利用辐照碎鸡来最大限度地减少背景微生物群落的影响和相对于已验证接种物的测量不确定性。

研究方案

注意：与本协议相关的所有工作都应在生物安全 2 级 （BSL-2） 实验室内进行。在适当的情况下，该方案应在生物安全柜 （BSC） 内进行，以维持无菌条件并最大限度地降低样品污染或作员接触微生物病原体的风险。将样品转移到 BSC 外时，请使用密封容器保持样品完整性并防止意外掉落时溢出。最好在整个过程中使用一次性组件，以减少交叉污染的可能性。如果一次性用品不可行，请确保所有设备和材料在使用前都是无菌的。适当的废物管理至关重要;所有用过的一次性组件都应作为生物危害废物丢弃。在重复使用之前对可重复使用的材料进行高压灭菌，以确保对潜在危险材料进行适当的消毒和遏制。遵守这些预防措施不仅可以保证样品的完整性，还可以最大限度地降低作员接触微生物病原体的风险。

1. 肉类样品的制备

1. 采集和处理肉类样品
   1. 鲜肉
      1. 从当地零售商的鲜肉部门购买碎鸡。将所有样品转移至 4 °C 储存，并在接收后 24 小时内处理。在无菌条件下将肉类分成 25 g 样品。
      2. 真空密封并照射样品。在这里，德克萨斯 A&M AgriLife 国家电子束研究中心对 ~25 kGy 的剂量照射肉类。
         注意：虽然在本研究中使用辐照作为控制措施以确保消除背景微生物群落，但它并不是实际应用中协议的先决条件，如后续部分中使用的未辐照即食产品所示。在现场环境中，选择性培养基或分子诊断的特异性等替代方法可以解决来自非目标微生物的潜在干扰。
   2. 即食鸡肉产品
      1. 从当地零售商的冷冻食品区购买即食鸡肉产品。在无菌条件下分成 25 g 样品。
      2. 从各个部分的中心收集样品，以确保包含所有成分（例如面包屑和奶酪）。
2. 培养基制备
   1. 通过将 25 g BPW 粉末溶解在 1 L 纳米纯 H₂O 中来制备缓冲蛋白胨水 （BPW）。
   2. 准备脑心输液 （BHI） 板。为此，将 37 g BHI 粉末溶解在 1 L 纳米纯 H₂O 中，并将 15 g 琼脂加入 BHI 溶液中。通过在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟对所有培养基进行消毒。将 20 至 25 mL 培养基倒入带透明盖的培养皿 （100 mm x 15mm） 中。
      注意：最好将板倒入生物安全柜中，以保持无菌条件。

2. 细胞培养

1. 通过在BHI琼脂平板上划线肠道 沙门氏菌 血清型Typhimurium ATCC 14028来制备初始培养物，并在37°C下孵育过夜。
2. 通过在 25 mL BHI 肉汤中接种一个新鲜生长的 沙门氏菌 菌落来制备过夜培养物。在 37 °C 下以 100 rpm 振荡，用好氧培养物过夜。

3. 家禽样本的接种

1. 培养物稀释和铺板
   1. 在 BPW 中制备一系列 10 倍稀释的过夜培养物，以达到约 1 x 10⁸ 至 1 x 10¹ CFU/mL 的最终浓度。假设 沙门氏菌 过夜培养物的浓度为 1 x 10⁹ CFU/mL。
   2. 将 0.5 mL 过夜培养物转移到 4.5 mL BPW 中，混合，然后每增加一次稀释，将 0.5 mL 稀释液转移到 4.5 mL BPW 中。
      1. 将 10 μL 的 1 x 10³ CFU/mL 稀释液一式三份涂布在 BHI 琼脂平板上进行细胞计数，以计算过夜培养物浓度。
2. 肉类样品接种
   1. 无菌转移 25 克辐照鸡肉粉放入无菌胃袋中，一式两份。袋子尺寸为 7.5 x 12 英寸，标有 1.63 升。袋子包含一个孔径为 330 μm 的过滤器隔板，每平方厘米有 285 个。
   2. 用 1 mL 的目标浓度稀释液接种每个样品。例如，从 1 x 10³ CFU/mL 稀释液中加入 1 mL 培养物，以达到约 1,000 个细胞/25 g 鸡肉的污染水平。使用无菌细胞涂抹器将液体接种物轻轻分布在鸡样品的表面，并使其在 4 °C 下放置 1 小时。
   3. 通过添加 1 mL 无菌 BPW 制备阴性对照样品。

4. 样品处理

1. 向每个样品中加入 225 mL BPW。选择体积与介质的比率以与 FSIS MLG 4.15⁴ 保持一致。
2. 使用 Stomacher⁷ 以正常速度和 120 秒的持续时间对样品进行均质化。
3. 离心和重悬
   1. 使用 50 mL 移液器小心地从袋子的过滤侧取出液体。将液体分成两个无菌离心瓶。
   2. 用无菌 BPW 平衡瓶子以确保重量相等。将样品以 10,000 x g 离心 10 分钟。丢弃上清液。用无菌刮刀将细胞沉淀重悬于 3 mL BPW 肉汤中。
   3. 再加入 27 mL BPW 肉汤，用刮刀搅拌充分混合。将两个离心瓶的内容物合并到每个样品的瓶子中。

5. MPN 块设置

注： 表 1 描述了 48 孔模块中的稀释示意图。

1. 向 48 孔模块的第 1 列的每个孔中加入 3 mL 重悬样品（8 次重复）。
2. 使用八通道移液器在模块内的第 1-6 列中制备一系列 10 倍稀释液。
3. 将 0.3 mL 样品加入 2.7 mL BPW 移液管中混合。对每次稀释重复。将块在 37 °C 下孵育过夜（~18 小时），并以 ~100 rpm 振荡。

6. 电镀和枚举

1. 修改后的落板计数
   1. 使用多通道移液器将每种稀释液的 7 μL 过夜生长样品以 4 x 6 网格形式接种在琼脂板上（图 2）。在两块板上使用 4 x 6 网格可以更好地容纳 8 个样品，而不是典型的 6 x 6 网格液滴⁸。
   2. 孵育前让板风干 10 分钟。将琼脂平板在 37 °C 下孵育过夜（~18-24 小时）。 孵育后，计算每个平板上的菌落数。

7. 沙门氏菌的 qPCR 检测

1. 使用市售试剂盒提取 DNA
   1. 通过上下移液数次，在 48 孔模块中混合培养物。将每种培养物的 200 μL 移液到 96 孔 PCR 板中。
   2. 密封板，然后以 6,600 x g 离心 10 分钟。去除上清液，向沉淀中加入 20 μL 试剂盒试剂。
   3. 通过上下移液重悬沉淀。密封板并在 99 °C 下加热 10 分钟，然后冷却至 20 °C。
   4. 再次以 6,600 x g 离心 10 分钟。使用 2 μL 上清液进行 qPCR 分析。
2. 板设置
   1. 根据既定方案⁹ 制备 qPCR 反应混合物，如下所示：10 μL 2x 预混液;每种引物和探针 0.4 μL（10 μM 工作溶液）：invA 正向：5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3'，invA 反向：5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'，invA 探针：5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3'用 Cal Fluor Orange 560 芴染料标记;0.2 μL 内部扩增对照 （IAC） 模板（6 x 10⁴ 拷贝/μL）⁹;每种 IAC 引物和探针 （10 μM） 0.4 μL：IAC 正向：5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'，IAC 反向：5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'，IAC 探针：5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3'用 TAMRA 染料标记。用 ddH₂O 调节体积至总共 20 μL。
   2. 使用以下^{循环条件进行}实时PCR：95°C 10 分钟（DNA 的初始变性和热启动聚合酶的激活），95 °C 15 秒和 60 °C 1 分钟的 40 个循环，使用默认 Ct 设置导出结果进行分析。

8. 使用 3M MDS 检测

1. 遵循分子检测检测 Salmonella 试剂盒方案。通过上下移液数次，在 48 孔模块中混合培养物。将每个样品的 20 μL 移液到试剂盒提供的裂解管中。
2. 将样品在 100 °C 下加热 15 分钟。溶液将从粉红色变为黄色。将样品在室温下孵育 10 分钟。溶液将从黄色变为粉红色。
3. 将 20 μL 裂解物转移到试剂管中，并将试剂管装入支架中。
4. 将支架添加到 MDS 仪器并配置软件以传达有关试剂盒和样品的信息。仪器要求每个孔都标有分析的批号和样品名称。运行 MDS 软件并导出报告。

9. 数据分析

1. 阳性和阴性结果的分类。
   1. 对于 4 x 6 滴板，评估琼脂平板上至少有 1 个菌落的斑点为阳性，琼脂平板上没有生长的斑点为阴性。
   2. 对于 qPCR，将 Ct 小于或等于 30 的孔评估为阳性，将 Ct 大于 30 的孔评估为阴性。
   3. 对于 MDS，请使用 MDS 系统中的结果，报告为阳性或阴性。
2. MPN 计算
   1. 使用^{前面描述的简单} 最大概率分辨率 （SMPR） 方法（6 或其他经过验证的 MPN 计算器）分析带注释的阳性和阴性。¹⁰

结果

辐照肉
在回归分析中，斜率 1 表示自变量（x 轴）每增加一个单位，因变量（y 轴）正好增加 1 个单位。这表明两个变量之间存在比例关系，这意味着因变量的变化反映了自变量的变化。截距 0 表示当自变量为 0 时，因变量也为 0。这表明两个变量之间的关系没有固定的偏移量或偏差。斜率 1 和截距 0 一起表示变量 ^11,12

讨论

协议的意义
沙门氏菌仍然是食品安全的主要问题，尤其是在家禽产品中，这通常与食源性疾病爆发有关^13,14。作为美国细菌性食源性疾病的主要原因，在新鲜和即食家禽产品中检测沙门氏菌的可靠方法对于确保食品安全至关重要¹⁵。定量低浓度沙门氏菌的能力对于识别可能?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 deep well block 4.6ml	Fisher Scientific International, Inc	NC1964628
Agar - Solidifying Agent (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	281230
Analytical Balance	Mettler Toledo	JL602-G/L	Equipment
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S	Equipment
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer	Steris plc	LV-250	Equipment
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+	Labconco Corporation	302411101	Equipment
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Becton, Dickinson and Company (BD)	237500
Buffered Peptone Water	Bio-Rad Laboratories Inc.	3564684
Cell Spreader - L-shaped	VWR	76208-438
Centrifuge Microcentrifuge 5424	Eppendorf	5424	Equipment
Centrifuge, Avanti J-25	Beckman Coulter, Inc.		Equipment
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	4318930
Ground Chicken	Local retailers
IAC forward  primer: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'	Integrated DNA Technologies
IAC probe: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC CACCA-3' labeled with 5' TAMRA/3' BHQ-2	Biosearch Technologies
IAC reverse primer: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'	Integrated DNA Technologies
Incubator - Inova 4230 incubator shaker	New Brunswick Scientific	4230	Equipment
Inoculating Loop - Combi Loop  10µL and 1µL	Fisher Scientific International, Inc	22-363-602
invA forward primer: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG G-3'	Integrated DNA Technologies
invA probe: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC CTTCCTC-3' labeled with 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1	Biosearch Technologies
invA reverse primer: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'	Integrated DNA Technologies
Irradiation Treatment	Texas A&M Agrilife Research National Center for Electron Beam Research		Service
Luria Bertani (LB) Broth	Becton, Dickinson and Company (BD)	244620
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Mettler Toledo	17014382	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+	Mettler Toledo	17014384	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	Mettler Toledo	17014388	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Mettler Toledo	17014391	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Mettler Toledo	17014392	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Mettler Toledo	17013805	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+	Mettler Toledo	17013803	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap	Corning Inc.	1396-1L	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap	Corning Inc.	1397-2L	Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34cm2, sterile, 108/cs	MilliporeSigma	Z707902
Mixer - Vortex Genie 2	Scientific Industries Inc.	SI-0236	Equipment
Molecular Detection Assay 2-Salmonella kit	Neogen	MDA2SAL96
Molecular Detection Instrument	Neogen	MDS100	Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2	INTEGRA Biosciences Corp.	155019	Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression	Thermo Fisher Scientific Inc.	4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable	Fisher Scientific International, Inc	3489E20	Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)	Fisher Scientific International, Inc	FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8	Mettler Toledo	30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10	Mettler Toledo	30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10	Mettler Toledo	30389276
Ready to cook chicken products	Local retailers
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors	Thermo Fisher Scientific Inc.	8093-11
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system	(Applied Biosystems, Foster City, CA)	2750036476	Equipment
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170376N
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders	Fisher Scientific International, Inc	14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags	Thermo Fisher Scientific Inc.	01-812
Stomacher 80 Biomaster Lab Blender	Seward	30010019	Equipment
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)	Applied Biosystems	535028293	Equipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex	Elga LabWater	PF2XXXXM1-US	Equipment
Whirlpak bags 1.63L	VWR	11216-777