Dosage modifié du nombre le plus probable pour quantifier la présence de Salmonella dans les produits de poulet crus et prêts à cuire

Résumé

Quantifier avec précision les salmonelles présentes à de faibles niveaux chez les volailles est un défi industriel et réglementaire actuel. Ce protocole décrit un dosage de la NPP qui permet de quantifier la présence de Salmonella dans les produits de volaille crus et prêts à cuire. Cette méthode est rapide, sensible et s’aligne sur les directives du FSIS, améliorant la sécurité alimentaire et soutenant les efforts de santé publique.

Résumé

La salmonelle est l’une des principales causes de maladies d’origine alimentaire aux États-Unis, en particulier dans les produits à base de volaille. Les méthodes traditionnelles de détection de Salmonella se concentrent sur la prévalence plutôt que sur la quantification, ce qui limite leur utilité dans l’évaluation des niveaux de contamination et des risques. Cette étude présente un nouveau test du nombre le plus probable (NPP) conçu pour quantifier Salmonella dans les produits de volaille prêts à cuire, tels que le cordon bleu de poulet. La méthode consiste à laver l’échantillon de volaille, à concentrer le rinçage par centrifugation et à le diluer en série dans un bloc de 48 puits. Le test NPP est intégré à la méthode d’amplification isotherme médiée en boucle (LAMP) afin de fournir une quantification sensible, précise et rapide de la contamination par Salmonella dans le même délai que les protocoles existants du Food Safety and Inspection Service (FSIS). Les résultats montrent une forte corrélation linéaire entre les mesures MPN-LAMP et les niveaux théoriques d’inoculation (R² = 0,933). Cependant, la variabilité à des concentrations plus faibles met en évidence les défis liés à la détection précise de Salmonella à ces niveaux, la limite inférieure pratique de détection étant estimée à environ 300 UFC/g. Parmi les améliorations qui pourraient être apportées pour améliorer l’applicabilité du protocole, mentionnons l’augmentation de la quantité échantillonnée afin d’améliorer davantage la limite de détection, l’optimisation des formulations de milieux d’enrichissement et l’élargissement de la détection moléculaire pour cibler plusieurs sérovars de Salmonella . Dans l’ensemble, cette étude présente un outil pratique pour l’industrie alimentaire, permettant une quantification fiable de la contamination par Salmonella dans les produits de volaille, contribuant ainsi à l’amélioration de la sécurité alimentaire et de la santé publique.

Introduction

En tant que principale cause de maladies d’origine alimentaire, d’hospitalisations et de décès aux États-Unis, Salmonella a un impact significatif sur la santé publique et l’économie. Le fardeau économique estimé de l’agent pathogène en 2013 seulement était de 3,67 milliards de dollars¹. Bien que les récentes initiatives réglementaires visent à réduire la salmonellose de 25 % d’ici 2030², les stratégies actuelles de détection et d’atténuation présentent des lacunes évidentes, notamment en ce qui concerne l’harmonisation de la surveillance des usines de transformation avec les résultats en matière de santé publique³ .

Les produits de volaille congelés prêts à cuire, qui ont été impliqués dans plusieurs éclosions de Salmonella , sont une préoccupation importante pour la santé publique. En réponse, le Food Safety and Inspection Service (FSIS) a classé Salmonella comme adultérant dans ces produits. À l’heure actuelle, le FSIS Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 4.15 se concentre uniquement sur la détermination de la prévalence de Salmonella dans les produits de volaille⁴. En vertu de cette ligne directrice, les échantillons prélevés sont enrichis pendant 18 à 24 heures, puis analysés à l’aide du système de détection moléculaire (SMD), qui identifie la présence ou l’absence de Salmonella , mais ne donne pas d’aperçu du niveau de contamination. Bien que cette approche soit utile pour détecter la présence d’agents pathogènes, elle ne fournit pas d’informations quantitatives qui pourraient aider les transformateurs d’aliments à évaluer les risques de contamination avec plus de précision et à prendre des mesures correctives ciblées.

Dans cette étude, nous avons développé une méthode pour augmenter la détection de la prévalence à la quantification des agents pathogènes microbiens. Il a été conçu pour s’intégrer sans heurts dans les processus existants de détection de Salmonella dans les produits de volaille avec une perturbation minimale des protocoles actuels du FSIS. Au lieu de simplement enrichir l’échantillon en vrac, la méthode commence par laver les produits de volaille à l’aide de milieux conformes aux méthodes actuelles du FSIS. Le rinçage est ensuite distribué dans la première colonne d’un bloc de puits de 48 profondeurs. Des dilutions en série sont effectuées sur les cinq colonnes restantes, et le bloc est incubé pendant 18 à 24 h, conformément au protocole MLG 4.15. Après l’incubation, les puits sont analysés pour détecter la présence de Salmonella, et les résultats sont utilisés pour calculer le nombre le plus probable (NPP)^5,6. Cette approche permet de quantifier la contamination dans le même laps de temps que le processus actuel du FSIS, ce qui en fait une option pratique pour l’industrie et la réglementation. La figure 1 représente un schéma fonctionnel résumant le dosage du NPP modifié. La figure comprend des photographies prises à des étapes précises, le bloc de 48 puits utilisé pour la dilution et la croissance des répétitions, et les trois techniques utilisées comme points de référence pour évaluer le nombre le plus probable de Salmonella présent dans le poulet haché. Dans la première phase de cette étude, nous avons utilisé du poulet haché irradié pour minimiser l’impact de la microflore de fond et l’incertitude des mesures par rapport à l’inoculum vérifié avant d’appliquer le protocole à des échantillons de poulet non irradiés.

Protocole

REMARQUE : Tous les travaux associés à ce protocole doivent être effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). S’il y a lieu, ce protocole doit être mis en œuvre au sein d’une enceinte de sécurité biologique (ESB) afin de maintenir des conditions aseptiques et de réduire au minimum le risque de contamination de l’échantillon ou d’exposition de l’opérateur à des agents pathogènes microbiens. Lorsque vous transférez des échantillons à l’extérieur de l’ESB, utilisez des contenants scellés pour maintenir l’intégrité de l’échantillon et prévenir les déversements en cas de chute accidentelle. De préférence, des composants jetables doivent être utilisés tout au long de la procédure pour atténuer le risque de contamination croisée. Dans les cas où les produits jetables ne sont pas réalisables, assurez-vous que tout l’équipement et le matériel sont stériles avant de l’utiliser. Une bonne gestion des déchets est cruciale ; Tous les composants jetables usagés doivent être jetés comme déchets biologiques. Autoclavez les matériaux réutilisables avant de les réutiliser pour assurer une stérilisation et un confinement appropriés des matériaux potentiellement dangereux. Le respect de ces précautions permet non seulement de protéger l’intégrité de l’échantillon, mais aussi de minimiser le risque d’exposition de l’opérateur à des agents pathogènes microbiens.

1. Préparation des échantillons de viande

1. Acquisition et transformation d’échantillons de viande
   1. Viande fraîche
      1. Achetez du poulet haché au rayon des viandes fraîches des détaillants locaux. Transférez tous les échantillons dans un stockage à 4 °C et traitez-les dans les 24 heures suivant leur réception. Divisez aseptiquement la viande en échantillons de 25 g.
      2. Scellez sous vide et irradiez l’échantillon. Ici, le Texas A&M AgriLife National Center for Electron Beam Research a irradié de la viande soumise à une dose de ~25 kGy.
         REMARQUE : Bien que l’irradiation ait été utilisée comme mesure de contrôle dans cette étude pour assurer l’élimination de la microflore de fond, elle n’est pas une condition préalable au protocole dans des applications pratiques, comme le montrent les produits prêts à cuire non irradiés utilisés dans la section suivante. Sur le terrain, d’autres méthodes telles que les milieux sélectifs ou la spécificité des diagnostics moléculaires peuvent traiter les interférences potentielles provenant de micro-organismes non cibles.
   2. Produits de poulet prêts à cuisiner
      1. Acquérez des produits de poulet prêts à cuisiner dans la section des aliments surgelés des détaillants locaux. Diviser aseptiquement en échantillons de 25 g.
      2. Prélevez des échantillons au centre de chaque morceau pour vous assurer que tous les ingrédients (p. ex., la panure et le fromage) sont inclus.
2. Préparation des milieux
   1. Préparez de l’eau peptonée tamponnée (EPB) en dissolvant 25 g de poudre d’EPP dans 1 L de nanopure H₂O.
   2. Préparez des plaques de perfusion cerveau-cœur (BHI). Pour ce faire, dissolvez 37 g de poudre de BHI dans 1 L de_H2O nanopure et ajoutez 15 g de gélose dans la solution de BHI. Stériliser tous les milieux en autoclave à 121 °C pendant 15 min. Verser 20 à 25 ml de média dans des boîtes de Pétri avec couvercle transparent (100 mm x 15 mm).
      REMARQUE : Il est préférable de verser les plaques dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir des conditions aseptiques.

2. Culture cellulaire

1. Préparez la culture initiale en striant le sérovar Typhimurium ATCC 14028 de Salmonella enterica sur une plaque de gélose BHI et incubez à 37 °C pendant la nuit.
2. Préparez des cultures de nuit en inoculant 25 ml de bouillon BHI avec une colonie de Salmonella fraîchement cultivée. Cultivez des cultures en aérobie pendant la nuit à 37 °C en secouant à 100 tr/min.

3. Inoculation d’échantillons de volaille

1. Dilution de la culture et placage
   1. Préparer une série de dilutions de 10 fois de la culture de nuit dans l’EPA pour obtenir des concentrations finales d’environ 1 x 10⁸ à 1 x 10¹ UFC/mL. Supposons que la concentration de la culture de nuit de Salmonella est de 1 x 10⁹ UFC/mL.
   2. Transvaser 0,5 mL de la culture de nuit dans 4,5 mL d’EPT, mélanger, puis transférer 0,5 mL de dilution dans 4,5 mL d’EPT pour chaque dilution supplémentaire.
      1. Étaler 10 μL de la dilution de 1 x 10³ UFC/mL sur une plaque de gélose BHI en trois exemplaires pour le dénombrement cellulaire afin de calculer la concentration de culture pendant la nuit.
2. Inoculation d’échantillons de viande
   1. Transférez aseptiquement 25 g de poulet haché irradié dans un sac stomacher stérile en deux exemplaires. Le sac mesure 7,5 x 12 pouces et est étiqueté comme 1,63 L. Le sac contient une cloison filtrante d’un diamètre de trou de 330 μm, et il y en a 285 par cm carré.
   2. inoculer chaque échantillon avec 1 mL de la dilution de concentration cible. Par exemple, ajoutez 1 mL de culture à partir de la dilution de 1 x 10³ UFC/mL pour obtenir un niveau de contamination d’environ 1 000 cellules/25 g de poulet. Répartissez délicatement l’inoculum liquide sur la surface des échantillons de poulet à l’aide d’un épandeur de cellules stériles et laissez-le reposer pendant 1 h à 4 °C.
   3. Préparez des échantillons témoins négatifs en ajoutant 1 mL de DMP stérile.

4. Traitement des échantillons

1. Ajouter 225 mL d’EPT à chaque échantillon. Le rapport entre le volume et le support a été choisi pour s’aligner sur la MLG 4.15⁴ du FSIS.
2. Homogénéiser les échantillons à l’aide du Stomacher⁷ à vitesse normale et d’une durée de 120 s.
3. Centrifugation et remise en suspension
   1. Retirer délicatement le liquide du côté filtré du sac à l’aide d’une pipette de 50 ml. Divisez le liquide en deux flacons de centrifugation stériles.
   2. Équilibrez les bouteilles avec du BPW stérile pour assurer des poids égaux. Centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 10 min. Jetez le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 3 mL de bouillon d’EPT à l’aide d’une spatule stérile.
   3. Ajouter 27 ml de bouillon BPW et bien mélanger en remuant à l’aide d’une spatule. Combinez le contenu des deux flacons de centrifugation en un seul flacon pour chaque échantillon.

5. Configuration du bloc MPN

REMARQUE : Le tableau 1 présente un schéma des dilutions dans un bloc de 48 puits.

1. Ajouter 3 mL de l’échantillon remis en suspension dans chaque puits de la colonne 1 du bloc de 48 puits (8 répétitions).
2. Préparez une série de dilutions 10 fois sur les colonnes 1 à 6 à l’intérieur du bloc à l’aide d’une pipette à huit canaux.
3. Ajouter 0,3 mL d’échantillon dans 2,7 mL de pipette BPW pour mélanger. Répétez l’opération pour chaque dilution. Incuber les blocs pendant la nuit (~18 h) à 37 °C avec agitation à ~100 tr/min.

6. Placage et dénombrement

1. Énumération modifiée des plaques de chute
   1. Plaque de 7 μL d’échantillon cultivé pendant la nuit de chaque dilution dans une grille de 4 x 6 sur une plaque de gélose à l’aide d’une pipette multicanaux (figure 2). L’utilisation d’une grille 4 x 6 sur deux plaques permet de mieux traiter 8 échantillons, par opposition à la grille typique de 6 x 6 gouttelettes⁸.
   2. Laissez les plaques sécher à l’air libre pendant 10 minutes avant l’incubation. Incuber les plaques de gélose pendant une nuit (~18-24 h) à 37 °C. Après l’incubation, comptez le nombre de colonies sur chaque plaque.

7. Détection de Salmonella par qPCR

1. Extraction d’ADN à l’aide d’un kit commercial
   1. Mélangez les cultures dans le bloc de 48 puits en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Pipeter 200 μL de chaque culture dans une plaque de PCR à 96 puits.
   2. Scellez puis centrifugez la plaque à 6 600 x g pendant 10 min. Retirer le surnageant et ajouter 20 μL du réactif du kit à la pastille.
   3. Remettez le granulé en suspension en le pipetant de haut en bas. Fermez et chauffez la plaque à 99 °C pendant 10 min, puis refroidissez à 20 °C.
   4. Centrifuger à nouveau à 6 600 x g pendant 10 min. Utilisez 2 μL de surnageant pour l’analyse qPCR.
2. Configuration de la plaque
   1. Préparez le mélange réactionnel qPCR conformément au protocole⁹ établi comme suit : 10 μL de 2x Master Mix ; 0,4 μL de chaque amorce et sonde (solution de travail de 10 μM) : invA avant : 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3', invA arrière : 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3', sonde invA : 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3' marquée avec le colorant fluorènes Cal Fluor Orange 560 ; 0,2 μL de modèle de contrôle d’amplification interne (IAC) (6 x 10⁴ copies/μL)⁹ ; 0,4 μL de chaque amorce et sonde IAC (10 μM) : IAC avant : 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3', IAC arrière : 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3', Sonde IAC : 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3' marquée avec le colorant TAMA. Ajustez le volume avec jdH₂O à 20 μL au total.
   2. Effectuez une PCR en temps réel avec les conditions de cycle suivantes⁹ : 95 °C pendant 10 min (dénaturation initiale de l’ADN et activation de la polymérase à démarrage à chaud), 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min, utilisez les paramètres Ct par défaut pour exporter les résultats à des fins d’analyse.

8. Détection à l’aide du test 3M MDS

1. Suivez le protocole de la trousse de détection moléculaire de Salmonella . Mélangez les cultures dans le bloc de 48 puits en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Pipeter 20 μL de chaque échantillon dans le tube de lyse fourni par le kit.
2. Chauffer les échantillons à 100 °C pendant 15 min. La solution passera du rose au jaune. Incuber les échantillons pendant 10 min à température ambiante. La solution passera du jaune au rose.
3. Transférez 20 μL de lysat dans un tube de réactif et chargez les tubes de réactif dans le support.
4. Ajoutez le support à l’instrument MDS et configurez le logiciel pour communiquer les informations sur le kit et l’échantillon. L’instrument exige que chaque puits soit étiqueté avec le numéro de lot de l’essai et le nom de l’échantillon. Exécutez le logiciel MDS et exportez le rapport.

9. Analyse des données

1. Classification des résultats positifs et négatifs.
   1. Pour un placage en goutte 4 x 6, évaluer les taches sur les plaques de gélose avec au moins 1 colonie comme positives et les taches sur les plaques de gélose sans croissance comme négatives.
   2. Pour la qPCR, évaluez les puits dont l’indice Ct est inférieur ou égal à 30 comme positifs et les puits dont l’indice Ct est supérieur à 30 comme négatifs.
   3. Pour les DMS, utilisez les résultats du système MDS, déclarés positifs ou négatifs.
2. Calcul du MPN
   1. Analysez les points positifs et négatifs annotés à l’aide de la méthode SMPR (Simple Maximum Probability Resolution) décrite précédemment⁶ ou d’autres calculatrices MPN vérifiées. ¹⁰

Résultats

Viande irradiée
Dans l’analyse de régression, une pente de 1 indique que pour chaque unité d’augmentation de la variable indépendante (axe des x), la variable dépendante (axe des y) augmente d’exactement 1 unité. Cela suggère une relation proportionnelle entre les deux variables, ce qui signifie que la variation de la variable dépendante reflète la variation de la variable indépendante. Une ordonnée à l’origine de 0 signifie que lorsque la variable...

Discussion

Importance du protocole
La salmonelle demeure une préoccupation majeure en matière de salubrité des aliments, en particulier dans le secteur des produits de volaille, qui sont souvent impliqués dans des éclosions de maladies d’origine alimentaire^13,14. En tant que principale cause de maladies bactériennes d’origine alimentaire aux États-Unis, des méthodes fiables de détection de Salm...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 deep well block 4.6ml	Fisher Scientific International, Inc	NC1964628
Agar - Solidifying Agent (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	281230
Analytical Balance	Mettler Toledo	JL602-G/L	Equipment
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S	Equipment
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer	Steris plc	LV-250	Equipment
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+	Labconco Corporation	302411101	Equipment
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Becton, Dickinson and Company (BD)	237500
Buffered Peptone Water	Bio-Rad Laboratories Inc.	3564684
Cell Spreader - L-shaped	VWR	76208-438
Centrifuge Microcentrifuge 5424	Eppendorf	5424	Equipment
Centrifuge, Avanti J-25	Beckman Coulter, Inc.		Equipment
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	4318930
Ground Chicken	Local retailers
IAC forward  primer: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'	Integrated DNA Technologies
IAC probe: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC CACCA-3' labeled with 5' TAMRA/3' BHQ-2	Biosearch Technologies
IAC reverse primer: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'	Integrated DNA Technologies
Incubator - Inova 4230 incubator shaker	New Brunswick Scientific	4230	Equipment
Inoculating Loop - Combi Loop  10µL and 1µL	Fisher Scientific International, Inc	22-363-602
invA forward primer: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG G-3'	Integrated DNA Technologies
invA probe: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC CTTCCTC-3' labeled with 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1	Biosearch Technologies
invA reverse primer: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'	Integrated DNA Technologies
Irradiation Treatment	Texas A&M Agrilife Research National Center for Electron Beam Research		Service
Luria Bertani (LB) Broth	Becton, Dickinson and Company (BD)	244620
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Mettler Toledo	17014382	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+	Mettler Toledo	17014384	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	Mettler Toledo	17014388	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Mettler Toledo	17014391	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Mettler Toledo	17014392	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Mettler Toledo	17013805	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+	Mettler Toledo	17013803	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap	Corning Inc.	1396-1L	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap	Corning Inc.	1397-2L	Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34cm2, sterile, 108/cs	MilliporeSigma	Z707902
Mixer - Vortex Genie 2	Scientific Industries Inc.	SI-0236	Equipment
Molecular Detection Assay 2-Salmonella kit	Neogen	MDA2SAL96
Molecular Detection Instrument	Neogen	MDS100	Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2	INTEGRA Biosciences Corp.	155019	Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression	Thermo Fisher Scientific Inc.	4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable	Fisher Scientific International, Inc	3489E20	Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)	Fisher Scientific International, Inc	FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8	Mettler Toledo	30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10	Mettler Toledo	30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10	Mettler Toledo	30389276
Ready to cook chicken products	Local retailers
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors	Thermo Fisher Scientific Inc.	8093-11
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system	(Applied Biosystems, Foster City, CA)	2750036476	Equipment
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170376N
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders	Fisher Scientific International, Inc	14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags	Thermo Fisher Scientific Inc.	01-812
Stomacher 80 Biomaster Lab Blender	Seward	30010019	Equipment
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)	Applied Biosystems	535028293	Equipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex	Elga LabWater	PF2XXXXM1-US	Equipment
Whirlpak bags 1.63L	VWR	11216-777