Ensaio de número mais provável modificado para quantificar Salmonella em produtos de frango crus e prontos para cozinhar

Resumo

Quantificar com precisão a Salmonella em aves em níveis baixos é um desafio industrial e regulatório atual. Este protocolo descreve um ensaio MPN que permite a quantificação de Salmonella em produtos avícolas crus e prontos para cozinhar. Este método é rápido, sensível e se alinha com as diretrizes do FSIS, aumentando a segurança alimentar e apoiando os esforços de saúde pública.

Resumo

A salmonela é uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos nos Estados Unidos, principalmente em produtos avícolas. Os métodos tradicionais de detecção de Salmonella se concentram na prevalência e não na quantificação, o que limita sua utilidade na avaliação dos níveis e riscos de contaminação. Este estudo apresenta um novo ensaio de número mais provável (MPN) projetado para quantificar Salmonella em produtos avícolas prontos para cozinhar, como frango cordon bleu. O método envolve lavar a amostra de aves, concentrar o enxágue por centrifugação e diluí-lo em série em um bloco de 48 poços. O ensaio MPN é integrado ao método de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para fornecer uma quantificação sensível, precisa e rápida da contaminação por Salmonella dentro do mesmo período de tempo que os protocolos existentes do Serviço de Inspeção e Segurança Alimentar (FSIS). Os resultados mostram uma forte correlação linear entre as medidas de MPN-LAMP e os níveis teóricos de inoculação (R² = 0,933). No entanto, a variabilidade em concentrações mais baixas destaca os desafios na detecção precisa de Salmonella nesses níveis, com o limite inferior prático de detecção estimado em aproximadamente 300 UFC / g. Refinamentos potenciais para melhorar a aplicabilidade do protocolo incluem aumentar a quantidade amostrada para melhorar ainda mais o limite de detecção, otimizar formulações de meios de enriquecimento e expandir a detecção molecular para atingir vários sorovares de Salmonella . No geral, este estudo apresenta uma ferramenta prática para a indústria alimentícia, permitindo a quantificação confiável da contaminação por Salmonella em produtos avícolas, contribuindo para melhorar a segurança alimentar e a saúde pública.

Introdução

Como uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos, hospitalização e morte nos EUA, a Salmonella tem um impacto significativo na saúde pública e na economia. A carga econômica estimada do patógeno somente em 2013 foi de US $ 3,67 bilhões¹. Embora as recentes iniciativas regulatórias visem reduzir a salmonelose em 25% até 2030², as lacunas nas estratégias atuais de detecção e mitigação permanecem evidentes, particularmente no alinhamento da vigilância da planta de processamento com os resultados de saúde pública³ .

Produtos avícolas congelados prontos para cozinhar, que foram implicados em vários surtos de Salmonella , são uma preocupação significativa para a saúde pública. Em resposta, o Serviço de Inspeção e Segurança Alimentar (FSIS) classificou a Salmonella como adulterante nesses produtos. Atualmente, o Guia de Laboratório de Microbiologia do FSIS (MLG) 4.15 concentra-se exclusivamente na determinação da prevalência de Salmonella em produtos avícolas⁴. De acordo com essa diretriz, as amostras coletadas são enriquecidas por 18 a 24 horas e, em seguida, rastreadas usando o Sistema de Detecção Molecular (MDS), que identifica a presença ou ausência de Salmonella , mas não oferece informações sobre o nível de contaminação. Embora essa abordagem seja valiosa para detectar a presença de patógenos, ela não fornece informações quantitativas que poderiam ajudar os processadores de alimentos a avaliar os riscos de contaminação com mais precisão e tomar ações corretivas direcionadas.

Neste estudo, desenvolvemos um método para aumentar a detecção da prevalência à quantificação de patógenos microbianos. Ele foi projetado para integração perfeita em processos existentes para detectar Salmonella em produtos avícolas com o mínimo de interrupção nos protocolos FSIS atuais. Em vez de simplesmente enriquecer a amostra a granel, o método começa lavando os produtos avícolas usando meios consistentes com os métodos FSIS atuais. O enxágue é então distribuído na primeira coluna de um bloco de poço de 48 de profundidade. Diluições seriais são realizadas nas cinco colunas restantes e o bloco é incubado por 18-24 h, alinhando-se com o protocolo MLG 4.15. Após a incubação, os poços são testados para Salmonella, e os resultados são usados para calcular o número mais provável (MPN)^5,6. Essa abordagem permite a quantificação da contaminação dentro do mesmo período de tempo que o processo FSIS atual, tornando-o uma opção prática para uso industrial e regulatório. A Figura 1 mostra um diagrama de blocos resumindo o ensaio MPN modificado. A figura inclui fotografias tiradas em etapas específicas, o bloco de 48 poços utilizado para diluição e crescimento de réplicas e as três técnicas usadas como referência para avaliar o número mais provável de Salmonella presente em frango moído. Na primeira fase deste estudo, utilizamos frango moído irradiado para minimizar o impacto da microflora de fundo e a incerteza das medições em relação ao inóculo verificado antes de aplicar o protocolo a amostras de frango não irradiadas.

Protocolo

NOTA: Todo o trabalho associado a este protocolo deve ser conduzido em um laboratório de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2). Quando apropriado, este protocolo deve ser conduzido dentro de um gabinete de segurança biológica (BSC) para manter as condições assépticas e minimizar o risco de contaminação da amostra ou exposição do operador a patógenos microbianos. Ao transferir amostras para fora do BSC, use recipientes lacrados para manter a integridade da amostra e evitar derramamento em caso de quedas acidentais. De preferência, componentes descartáveis devem ser usados durante todo o procedimento para mitigar a possibilidade de contaminação cruzada. Nos casos em que os descartáveis não são viáveis, certifique-se de que todos os equipamentos e materiais sejam estéreis antes do uso. A gestão adequada dos resíduos é crucial; Todos os componentes descartáveis usados devem ser descartados como resíduos de risco biológico. Autoclave materiais reutilizáveis antes da reutilização para garantir a esterilização e contenção adequadas de materiais potencialmente perigosos. Aderir a essas precauções não apenas protege a integridade da amostra, mas também minimiza o risco de exposição do operador a patógenos microbianos.

1. Preparação de amostras de carne

1. Aquisição e processamento de amostras de carne
   1. Carne fresca
      1. Adquira frango moído no departamento de carnes frescas dos varejistas locais. Transfira todas as amostras para armazenamento a 4 °C e processe dentro de 24 horas após o recebimento. Divida assepticamente a carne em amostras de 25 g.
      2. Selar a vácuo e irradiar a amostra. Aqui, o Texas A&M AgriLife National Center for Electron Beam Research irradiou carne submetida a uma dose de ~ 25 kGy.
         NOTA: Embora a irradiação tenha sido usada como medida de controle neste estudo para garantir a eliminação da microflora de fundo, ela não é um pré-requisito para o protocolo em aplicações práticas, conforme mostrado pelos produtos prontos para cozinhar não irradiados usados na seção subsequente. Em ambientes de campo, métodos alternativos, como meios seletivos ou especificidade de diagnósticos moleculares, podem abordar a interferência potencial de microrganismos não-alvo.
   2. Produtos de frango prontos para cozinhar
      1. Adquira produtos de frango prontos para cozinhar na seção de alimentos congelados dos varejistas locais. Dividir assepticamente em amostras de 25 g.
      2. Colete amostras do centro das peças individuais para garantir que todos os ingredientes (por exemplo, empanados e queijo) sejam incluídos.
2. Preparação de mídia
   1. Prepare a Água Peptonada Tamponada (BPW) dissolvendo 25 g de pó BPW em 1 L de H₂O nanopuro.
   2. Prepare placas de infusão cérebro-coração (BHI). Para fazer isso, dissolva 37 g de pó de BHI em 1 L de H₂O nanopuro e adicione 15 g de ágar na solução de BHI. Esterilize todos os meios em autoclavagem a 121 °C durante 15 min. Despeje 20 a 25 mL de mídia em placas de Petri com tampa transparente (100 mm x 15 mm).
      NOTA: É melhor colocar as placas dentro de um gabinete de segurança biológica para manter as condições assépticas.

2. Cultura celular

1. Preparar a cultura inicial com uma colocação em linha de Salmonella enterica sorovar Typhimurium ATCC 14028 numa placa de ágar BHI e incubar a 37 °C durante a noite.
2. Prepare culturas durante a noite inoculando 25 mL de caldo BHI com uma colônia de Salmonella recém-cultivada. Cultive culturas aeróbicas durante a noite a 37 °C com agitação a 100 rpm.

3. Inoculação de amostras de aves de capoeira

1. Diluição de cultura e plaqueamento
   1. Preparar uma série de diluições de 10 vezes da cultura durante a noite em BPW para atingir concentrações finais de aproximadamente 1 x 10⁸ a 1 x 10^{1 UFC} / mL. Suponha que a concentração da cultura noturna de Salmonella seja de 1 x 10⁹ UFC / mL.
   2. Transfira 0,5 mL da cultura durante a noite para 4,5 mL de BPW, misture e, em seguida, transfira 0,5 mL da diluição para 4,5 mL de BPW para cada diluição adicional.
      1. Espalhar 10 μL da diluição de 1 x 10³ UFC/ml numa placa de ágar BHI em triplicado para enumeração celular para calcular a concentração da cultura durante a noite.
2. Inoculação de amostras de carne
   1. Transfira assepticamente 25 g de frango moído irradiado para um saco estéril em duplicado. A bolsa tem 7,5 x 12 polegadas e é rotulada como 1,63 L. O saco contém uma divisória de filtro com um diâmetro de furo de 330 μm e 285 por cm quadrado.
   2. Inocular cada amostra com 1 ml da diluição da concentração alvo. Por exemplo, adicione 1 mL de cultura da diluição de 1 x 10³ UFC/mL para atingir um nível de contaminação de aproximadamente 1.000 células/25 g de frango. Distribuir suavemente o inóculo líquido sobre a superfície das amostras de frango utilizando um espalhador de células esterilizado e deixá-lo repousar durante 1 h a 4 °C.
   3. Preparar amostras de controlo negativo adicionando 1 ml de BPW estéril.

4. Processamento de amostras

1. Adicione 225 mL de BPW a cada amostra. A proporção de volume para mídia foi selecionada para se alinhar com o FSIS MLG 4.15⁴.
2. Homogeneizar as amostras utilizando o Stomacher⁷ à velocidade normal e com uma duração de 120 s.
3. Centrifugação e ressuspensão
   1. Remova cuidadosamente o líquido do lado filtrado do saco usando uma pipeta de 50 mL. Divida o líquido em dois frascos de centrífuga estéreis.
   2. Equilibre os frascos com BPW estéril para garantir pesos iguais. Centrifugue as amostras a 10.000 x g por 10 min. Descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet celular em 3 mL de caldo BPW com uma espátula estéril.
   3. Adicione mais 27 mL de caldo BPW e misture bem, mexendo com uma espátula. Combine o conteúdo de ambos os frascos de centrífuga em um frasco para cada amostra.

5. Configuração de bloco MPN

NOTA: A Tabela 1 mostra um esquema das diluições em um bloco de 48 poços.

1. Adicionar 3 ml da amostra ressuspensa a cada alvéolo na coluna 1 do bloco de 48 poços (8 réplicas).
2. Prepare uma série de diluições de 10 vezes nas colunas 1-6 dentro do bloco usando uma pipeta de oito canais.
3. Adicione 0,3 mL de amostra em 2,7 mL de pipeta BPW para misturar. Repita para cada diluição. Incubar os blocos durante a noite (~18 h) a 37 °C com agitação a ~100 rpm.

6. Chapeamento e enumeração

1. Enumeração de placa suspensa modificada
   1. Placa 7 μL de amostra cultivada durante a noite de cada diluição em uma grade 4 x 6 em uma placa de ágar usando uma pipeta multicanal (Figura 2). O uso de uma grade 4 x 6 em duas placas acomoda melhor 8 amostras, em oposição à grade típica de 6 x 6 de gotículas⁸.
   2. Deixe as placas secarem ao ar por 10 minutos antes da incubação. Incubar as placas de ágar-ágar durante a noite (~18-24 h) a 37 °C. Após a incubação, conte o número de colônias em cada placa.

7. Detecção de qPCR de Salmonella

1. Extração de DNA usando um kit comercial
   1. Misture culturas no bloco de 48 poços pipetando para cima e para baixo várias vezes. Pipete 200 μL de cada cultura em uma placa de PCR de 96 poços.
   2. Sele e centrifugue a placa a 6.600 x g por 10 min. Remova o sobrenadante e adicione 20 μL do reagente do kit ao pellet.
   3. Ressuspenda o pellet pipetando para cima e para baixo. Sele e aqueça a placa a 99 °C por 10 min, seguido de resfriamento a 20 °C.
   4. Centrifugue novamente a 6.600 x g por 10 min. Use 2 μL do sobrenadante para análise de qPCR.
2. Configuração da placa
   1. Preparar a mistura de reação qPCR de acordo com o protocolo^{estabelecido 9} da seguinte forma: 10 μL de 2x Master Mix; 0,4 μL de cada primer e sonda (solução de trabalho de 10 μM): invA direto: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAGG-3', invA reverso: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3', sonda invA: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTC-3' marcado com o corante de fluorenos Cal Fluor Orange 560; 0,2 μL de modelo de controle de amplificação interna (IAC) (6 x 10⁴ cópias/μL)⁹; 0,4 μL de cada primer e sonda IAC (10 μM): IAC direto: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3', IAC reverso: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3', sonda IAC: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCCACCA-3' marcado com corante TAMRA. Ajuste o volume com ddH₂O para 20 μL no total.
   2. Realize PCR em tempo real com as seguintes condições de ciclagem⁹: 95 °C por 10 min (desnaturação inicial do DNA e ativação da polimerase de partida a quente), 40 ciclos de 95 °C por 15 s e 60 °C por 1 min, use as configurações padrão de Ct para exportar os resultados para análise.

8. Detecção usando o ensaio 3M MDS

1. Siga o protocolo do kit de Salmonella do ensaio de detecção molecular. Misture culturas no bloco de 48 poços pipetando para cima e para baixo várias vezes. Pipete 20 μL de cada amostra no tubo de lise fornecido pelo kit.
2. Aquecer as amostras a 100 °C durante 15 min. A solução mudará de rosa para amarelo. Incube as amostras por 10 min em temperatura ambiente. A solução mudará de amarelo para rosa.
3. Transfira 20 μL de lisado para um tubo de reagente e carregue os tubos de reagente no suporte.
4. Adicione o suporte ao instrumento MDS e configure o software para comunicar as informações sobre o kit e a amostra. O instrumento exige que cada poço seja rotulado com o número do lote do ensaio e um nome de amostra. Execute o software MDS e exporte o relatório.

9. Análise dos dados

1. Classificação de resultados positivos e negativos.
   1. Para placas de gota 4 x 6, avalie as manchas nas placas de ágar com pelo menos 1 colônia como positivas e as manchas nas placas de ágar sem crescimento como negativas.
   2. Para qPCR, avalie os poços que têm um Ct menor ou igual a 30 como positivo e os poços que têm um Ct maior que 30 como negativo.
   3. Para SMD, use os resultados do sistema MDS, relatados como positivos ou negativos.
2. Cálculo do MPN
   1. Analise positivos e negativos anotados usando o método de resolução de probabilidade máxima simples (SMPR) descrito anteriormente⁶ ou calculadoras MPN verificadas alternativas. ¹⁰

Resultados

Carne irradiada
Na análise de regressão, uma inclinação de 1 indica que para cada aumento de unidade na variável independente (eixo x), a variável dependente (eixo y) aumenta exatamente 1 unidade. Isso sugere uma relação proporcional entre as duas variáveis, o que significa que a mudança na variável dependente reflete a mudança na variável independente. Uma interceptação de 0 significa que quando a variável independente é 0, a variável dependente tam...

Discussão

Significado do protocolo
A salmonela continua sendo uma grande preocupação na segurança alimentar, particularmente em produtos avícolas, que são frequentemente implicados em surtos de doenças transmitidas por alimentos^13,14. Como uma das principais causas de doenças bacterianas transmitidas por alimentos nos Estados Unidos, métodos confiáveis para detectar Salmonella em produtos av?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
48 deep well block 4.6ml	Fisher Scientific International, Inc	NC1964628
Agar - Solidifying Agent (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	281230
Analytical Balance	Mettler Toledo	JL602-G/L	Equipment
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S	Equipment
Autoclave - Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer	Steris plc	LV-250	Equipment
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+	Labconco Corporation	302411101	Equipment
Brain Heart Infusion (BHI) Broth	Becton, Dickinson and Company (BD)	237500
Buffered Peptone Water	Bio-Rad Laboratories Inc.	3564684
Cell Spreader - L-shaped	VWR	76208-438
Centrifuge Microcentrifuge 5424	Eppendorf	5424	Equipment
Centrifuge, Avanti J-25	Beckman Coulter, Inc.		Equipment
DNA Extraction - PreMan Ultra Sample Preparation Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	4318930
Ground Chicken	Local retailers
IAC forward  primer: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'	Integrated DNA Technologies
IAC probe: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC CACCA-3' labeled with 5' TAMRA/3' BHQ-2	Biosearch Technologies
IAC reverse primer: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'	Integrated DNA Technologies
Incubator - Inova 4230 incubator shaker	New Brunswick Scientific	4230	Equipment
Inoculating Loop - Combi Loop  10µL and 1µL	Fisher Scientific International, Inc	22-363-602
invA forward primer: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG G-3'	Integrated DNA Technologies
invA probe: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC CTTCCTC-3' labeled with 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1	Biosearch Technologies
invA reverse primer: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'	Integrated DNA Technologies
Irradiation Treatment	Texas A&M Agrilife Research National Center for Electron Beam Research		Service
Luria Bertani (LB) Broth	Becton, Dickinson and Company (BD)	244620
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Mettler Toledo	17014382	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+	Mettler Toledo	17014384	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	Mettler Toledo	17014388	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Mettler Toledo	17014391	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Mettler Toledo	17014392	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Mettler Toledo	17013805	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+	Mettler Toledo	17013803	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap	Corning Inc.	1396-1L	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap	Corning Inc.	1397-2L	Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34cm2, sterile, 108/cs	MilliporeSigma	Z707902
Mixer - Vortex Genie 2	Scientific Industries Inc.	SI-0236	Equipment
Molecular Detection Assay 2-Salmonella kit	Neogen	MDA2SAL96
Molecular Detection Instrument	Neogen	MDS100	Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2	INTEGRA Biosciences Corp.	155019	Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression	Thermo Fisher Scientific Inc.	4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable	Fisher Scientific International, Inc	3489E20	Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)	Fisher Scientific International, Inc	FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8	Mettler Toledo	30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10	Mettler Toledo	30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10	Mettler Toledo	30389276
Ready to cook chicken products	Local retailers
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors	Thermo Fisher Scientific Inc.	8093-11
Realtime PCR - 7500 Real-Time PCR system	(Applied Biosystems, Foster City, CA)	2750036476	Equipment
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170376N
Spreader - Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders	Fisher Scientific International, Inc	14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags	Thermo Fisher Scientific Inc.	01-812
Stomacher 80 Biomaster Lab Blender	Seward	30010019	Equipment
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)	Applied Biosystems	535028293	Equipment
Water Filtration - Elga Veolia Purelab Flex	Elga LabWater	PF2XXXXM1-US	Equipment
Whirlpak bags 1.63L	VWR	11216-777